ОБЗОРЫ
Актуальность. Эффект клинического применения биотехнологических препаратов на основе моноклональных антител (МкАТ) и истечение срока действия патентов на оригинальные (референтные) препараты стимулировали разработку биоаналогичных МкАТ, профиль качества которых должен соответствовать качеству референтного лекарственного средства. Изучение биологических свойств МкАТ при доказательстве биоподобия и определение активности препаратов в рамках контроля качества серий необходимо проводить с использованием подходящих стандартных образцов (СО). В связи с отсутствием международных стандартов производители препаратов МкАТ применяют собственные стандартные образцы, но, учитывая сложную структуру и гетерогенность МкАТ, а также наличие связи между биологической активностью и клинической эффективностью, нельзя исключить наличие риска расхождения данных о качестве и эффективности препаратов.
Цель. Анализ сведений об актуальности и необходимости разработки международных стандартных образцов (МСО) для определения биологической активности биотерапевтических МкАТ, о роли референтных препаратов и МСО при оценке сходства/подобия, а также на разных этапах жизненного цикла биоаналогичных препаратов МкАТ.
Обсуждение. Рассмотрены проблемы, связанные с отсутствием МСО для оценки активности препаратов МкАТ. Приведены сведения о роли и значимости референтных препаратов и МСО для биоаналогичных препаратов. Представлена информация об особенностях изучения биологических свойств МкАТ и обобщены данные о необходимости разработки и применения МСО для стандартизации биологических тестов. В обзоре представлены результаты исследований первых утвержденных ВОЗ международных стандартных образцов для оценки биологической активности МкАТ, свидетельствующие о необходимости стандартизации препаратов МкАТ с использованием МСО для обеспечения их качества, безопасности и эффективности.
Заключение. Применение МСО для препаратов МкАТ играет ключевую роль в гармонизации подходов к оценке их биологической активности. Общедоступные МСО препаратов МкАТ необходимы как первичные СО для аттестации вторичных СО, для гармонизации подходов к оценке активности МкАТ (в международных единицах) между лабораториями, а также для согласования активности препаратов одного международного непатентованного наименования разных производителей. Использование МСО производителями МкАТ будет способствовать гарантии качества препаратов МкАТ и обеспечению клинического мониторинга эффективности их применения.
Актуальность. Ротавирусная инфекция и ее последствия остаются одной из главных причин смертности детей раннего возраста, предотвращаемой иммунизацией ротавирусными вакцинами. В Российской Федерации вакцинация против ротавирусной инфекции не включена в национальный календарь профилактических прививок, однако в ряде регионов страны реализуются региональные программы иммунизации детей.
Цель. Обзор данных литературы, посвященных эффективности и безопасности ротавирусных вакцин в условиях реальной клинической практики в Российской Федерации, а также оценка перспектив развития национальной программы иммунизации детей раннего возраста с использованием имеющихся ротавирусных вакцин и учетом перспективных разработок.
Обсуждение. Анализ данных локальных эпидемиологических исследований спектра возбудителей показал, что ротавирусы, особенно у детей до 3 лет, — наиболее частая причина острых кишечных инфекций. С момента регистрации (2012 г.) в Российской Федерации первой ротавирусной вакцины в системе здравоохранения накоплен опыт применения таких вакцин, вполне достаточный для оценки безопасности и эффективности иммунизации. Обзор данных по многолетнему мониторингу распространенности в России различных генотипов ротавирусов группы А подтвердил, что генотипы возбудителей, входящих в состав доступных ротавирусных вакцин, в целом соответствуют спектру выявляемых в нашей стране на протяжении многих лет генотипов возбудителей. Благоприятный профиль безопасности ротавирусных вакцин подтверждается местными наблюдательными исследованиями. Отмечается выраженная эффективность иммунизации, которая проявляется, при условии высокого охвата профилактическими прививками, в существенном снижении заболеваемости среди привитых детей по сравнению с непривитыми, а в некоторых регионах — вплоть до единичных обращений за медицинской помощью или госпитализаций по поводу острых кишечных инфекций.
Заключение. Представленные в обзоре данные подтверждают необходимость включения вакцинации против ротавирусной инфекции в Национальный календарь профилактических прививок Российской Федерации.
Актуальность. С учетом разработки в последнее время множества вакцин на основе новых технологических платформ особо большое значение приобретает обновление нормативных требований к вакцинным препаратам. Актуальной представляется разработка гармонизированных подходов в рамках национальных руководств и нормативных документов Евразийского экономического союза (ЕАЭС), регламентирующих проведение клинических исследований вирусных вакцин.
Цель. Анализ нормативных национальных и международных требований, регламентирующих проведение клинических исследований эффективности и безопасности вакцин для профилактики вирусных инфекционных заболеваний.
Обсуждение. Проведен анализ разработанных Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и ведущими регуляторными органами руководств, касающихся различных аспектов проведения клинических исследований вирусных вакцин. В руководствах особое внимание уделено вопросам иммуногенности вакцин. Существенной проблемой для оценки эффективности вакцин является отсутствие обоснованных иммунных коррелятов защиты для большинства инфекций. Допускается проведение связующих исследований иммуногенности с целью расширения показаний на другие популяции вакцинируемых (например, по возрасту). Для регистрационной оценки безопасности минимальный объем выборки должен включать не менее 3000 вакцинированных. При проведении исследований безопасности для некоторых вакцин необходимо оценивать риск усиления инфекционного заболевания, связанного с введением вакцины, и развития вакциноиндуцированных заболеваний.
Заключение. Требования ВОЗ и ведущих мировых регуляторных органов к проведению клинических исследований вирусных вакцин в целом являются сходными и могут рассматриваться как взаимодополняющие при разработке новых, гармонизированных в соответствии с международными подходами национальных руководств или руководств ЕАЭС по клиническим исследованиям.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Актуальность. Использование рекомбинантных антигенов в вакцинах ограничено низкой иммуногенностью таких препаратов. Однако вакцина от COVID-19 (Nuvaxovid), содержащая не только рекомбинантный антиген гликопротеина Spike вируса SARS-CoV-2, но и вирусоподобный иммуностимулирующий комплекс ИСКОМ-адъювант, индуцирует выработку протективного вируснейтрализующего ответа. Исследование разработанного в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора ИСКОМ-адъюванта «Матрикс-В», играющего ключевую роль в формировании вируснейтрализующего иммунного ответа, позволит широко использовать рекомбинантные антигены в комплексе с адъювантом для разработки и производства новых отечественных вакцин.
Цель. Оценка гуморального иммунного ответа на внутримышечное введение животным комплекса рекомбинантного антигена RBD поверхностного Spike-гликопротеина SARS-CoV-2 (штамм «Ухань») и полученных вирусоподобных ИСКОМ с сапонинами Quillaja saponaria.
Материалы и методы. ИСКОМ-адъювант «Матрикс-В» получали по разработанной в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора технологии с применением метода тангенциальной фильтрации в системе Sartorious VivaFlow. Оценивали концентрацию сапонинов и детергента в препарате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Получен рекомбинантный антиген RBD SARS-CoV-2, проведено электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры комплекса «ИСКОМ — антиген». Комплексами «ИСКОМ — антиген» внутримышечно двукратно (через 14 сут) иммунизировали 25 (5 групп) мышей линии Balb/c и 15 (3 группы) разнополых аутбредных морских свинок. Образцы сыворотки крови исследовали в реакции нейтрализации и методом ИФА с антигенами 8 штаммов вируса SARS-CoV-2 (Государственная коллекция возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Результаты обрабатывались статистически в программе Statistica 10.
Результаты. Двукратное введение антигена RBD SARS-CoV-2 морским свинкам (по 1 мкг) и мышам (по 7 мкг) не приводило в реакции нейтрализации к достоверному формированию вируснейтрализующего ответа. В реакции нейтрализации со штаммом «Ухань» средние геометрические значения титров антител сыворотки крови животных, двукратно иммунизированных комплексом RBD SARS-CoV-2 (мыши — по 7 мкг, морские свинки — по 1 мкг) + Матрикс-В (по 25 мкг), были в пределах 1:83–1:178 и 1:174–1:587 соответственно. В группах животных, однократно иммунизированных комплексом (1 мкг и 7 мкг антигена + Матрикс-В) антитела определялись в реакции нейтрализации (и/или ИФА) только в единичных случаях. В опытах ИФА наиболее интенсивный ответ (на антиген штамма Delta) получен после двукратной иммунизации комплексом Ecto-S-Wuhan (1 мкг) + Матрикс-В (25 мкг). Ответ на двукратное введение антигена Ecto-S-Wuhan (1 мкг) без ИСКОМ-адъюванта (p=0,95) не отличался от отрицательного контроля (значение титра менее 1:100). Двукратное введение мышам антигена RBD SARS-CoV-2 (по 7 мкг) приводило к формированию антител (значения титров 1:248–1:1477).
Выводы. Комплекс рекомбинантного антигена RBD SARS-CoV-2 и адъюванта «Матрикс-В» при двукратном внутримышечном введении индуцирует выработку вируснейтрализующих антител. Предложенный подход перспективен для разработки иммунобиологических препаратов профилактики и терапии широкого спектра инфекционных заболеваний.
Актуальность. Препараты для специфического лечения и профилактики лихорадки Чикунгунья, ее осложнений и последствий в настоящее время отсутствуют, в связи с этим особую актуальность приобретают вопросы разработки терапевтических и профилактических препаратов против вируса Чикунгунья (ЧИКВ), в том числе препаратов индукторов интерферонов.
Цель. Изучение эффективности профилактического применения препарата индуктора интерферонов против вируса Чикунгунья в модели in vitro.
Материалы и методы. Использовали штамм ЧИКВ Nika2021, две линии клеток — Vero и А549, а также препарат индуктора интерферонов (РНК двуспиральной натриевая соль) в двух дозировках (250 и 500 мкг/мл) и двух режимах применения (за 4 ч до заражения и одновременно с ним). Определяли титр вируса по его цитопатическому действию; содержание РНК ЧИКВ — методом ОТ-ПЦР-РВ и оценивали по показателю порогового числа циклов ПЦР; концентрацию продуцируемых клетками цитокинов — методом ИФА. В динамике анализировали активность ЧИКВ и содержание РНК ЧИКВ, а также продукцию цитокинов клетками (ИФН-α, -γ, ИЛ-6 и ФНО-α). Полученные данные обрабатывали при помощи пакетов программ Microsoft Office Excel 2016 и StatTech.
Результаты. Препарат в дозах 250 и 500 мкг/мл стимулировал продукцию в большей степени ИФН-α и в меньшей степени ИФН-γ; в большей степени — в линии клеток А549, в меньшей — в линии клеток Vero. Динамика содержания РНК ЧИКВ соответствовала динамике его титра в клетке. В целом содержание РНК ЧИКВ в линии клеток Vero было значительно выше, чем в линии клеток А549 (р<0,002 при дозировке препарата 250 мкг/мл, р<0,0005 при дозировке 500 мкг/мл). Препарат применяли в двух режимах: профилактическом — за 4 ч до заражения клеток вирусом; экстренно профилактическом — одновременно с инфицированием. Содержание РНК ЧИКВ в режиме профилактического применения препарата относительно контрольного опыта (инфицирование без препарата) было значительно ниже в обеих дозах в обеих линиях клеток (р<0,002 для Vero, р<0,0003 для А549), в режиме экстренной профилактики — р<0,05 и р<0,003 соответственно. Выявлена и статистически подтверждена эффективность применения препарата индуктора интерферонов против ЧИКВ, показано преимущество линии клеток А549 для изучения противовирусной активности in vitro. В обеих линиях интактных клеток отмечена продукция ИЛ-6 и ФНО-α.
Выводы. Обнаружен положительный противовирусный эффект от применения препарата индуктора интерферонов против ЧИКВ in vitro, при этом степень эффективности зависела от линии клеток. Показана необходимость тщательного отбора клеточной линии в зависимости от целей исследования, а также изучения продукции цитокинов клетками в монослое до стимуляции вирусами и (или) препаратами.
Актуальность. Показатель качества «Количество живых микробных клеток» определяется на всех этапах производства вакцины чумной живой. В настоящее время для определения количества живых микробных клеток используют бактериологический метод. Однако для повышения точности анализа и сокращения времени его проведения перспективным представляется использование метода проточной цитометрии.
Цель. Изучить возможность применения метода проточной цитометрии в оценке качества препарата вакцины чумной живой.
Материалы и методы. Использовали экспериментальные серии вакцины чумной живой (пять серий). Изучение показателя качества «Количество живых микробных клеток» в препарате вакцины проводили бактериологическим методом согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ФС.3.3.1.0022.15). Цитофлуориметрический анализ образцов проводили с использованием флуоресцентного красителя SynaptoGreen.
Результаты. Проведена оценка значения количества живых микробных клеток в образцах вакцин бактериологическим методом, что составило от 27,8±2,2 до 56,5±3,1% (в среднем — 39,8±5,4%), и методом проточной цитометрии — от 29,2±1,2 до 59,1±2,1%, (в среднем — 41,7±5,5%). Статистическая обработка данных показала, что результаты контроля качества препарата вакцины, полученные обоими методами, не имели достоверных различий и характеризовались высоким коэффициентом детерминации.
Выводы. Показана целесообразность применения метода проточной цитометрии при контроле качества препарата чумной вакцины при определении количества живых микробных клеток. Высокая информативность, быстрота и простота выполнения анализа делают метод проточной цитометрии более предпочтительным в сравнении с традиционными методами анализа.
Актуальность. Оценка содержания пирогенных примесей в вакцине брюшнотифозной Ви-полисахаридной (Вианвак®) проводится в настоящее время только биологическим тестом на пирогенность. Определение бактериальных эндотоксинов (БЭ) с помощью гель-тромб теста и введение показателя «Бактериальные эндотоксины» в нормативную документацию на препарат позволят существенно повысить надежность контроля качества данной вакцины, а также гармонизировать требования к ней с требованиями ведущих фармакопей мира к данной группе лекарственных препаратов.
Цель. Экспериментальная оценка возможности определения содержания бактериальных эндотоксинов с помощью гель-тромб теста в брюшнотифозной Ви-полисахаридной вакцине.
Материалы и методы. Образцы вакцины брюшнотифозной Ви-полисахаридной (раствор для подкожного введения, 0,5 мл/доза) пяти серий; ЛАЛ-реактив; ТАЛ-реактив. Испытания проводились с использованием гель-тромб теста с учетом требований Государственной фармакопеи Российской Федерации (ОФС.1.2.4.0006.15) и теста на пирогенность согласно ОФС.1.2.4.0005.15.
Результаты. Расчетное предельное содержание БЭ в испытуемой вакцине составляет 96 ЕЭ/мл, значение максимально допустимого разведения (МДР) — 3200. Установлены нормативные требования к качеству вакцины по показателю «Бактериальные эндотоксины» (не более 48 ЕЭ/доза). Выявлено наличие БЭ в разведениях препарата 1/16–1/32 и отсутствие — в разведениях 1/64–1/256. Выбрано и валидировано рабочее разведение препарата 1/128. Полученные значения содержания БЭ в исследуемых образцах находятся в диапазоне от 0,24 до 0,48 ЕЭ/доза. Испытания на пирогенность in vivo образцов пяти серий вакцины в разведениях от 1/16 до 1/256 показали, что введение животным препарата в разведениях 1/16–1/128 вызывало пирогенную реакцию, а при введении вакцины в разведении 1/256 пирогенная реакция отсутствовала во всех экспериментах.
Выводы. Экспериментально доказана возможность определения бактериальных эндотоксинов в вакцине брюшнотифозной Ви-полисахаридной с помощью гель-тромб теста. Рекомендовано введение показателя «Бактериальные эндотоксины» в Государственную фармакопею Российской Федерации ФС.3.3.1.0012.15 «Вакцина брюшнотифозная Ви-полисахаридная».
Актуальность. Определение количества жизнеспособных клеток является важным микробиологическим исследованием при оценке качества лекарственных препаратов, содержащих живые микроорганизмы. Для оптимизации трудовых и материальных затрат, повышения точности и воспроизводимости испытаний целесообразно применение частично автоматизированных инструментальных методов, к которым относится метод спирального посева.
Цель. Проведение валидационных исследований методики спирального посева при испытании по показателю «Специфическая активность» биологических лекарственных препаратов, содержащих живые бактериальные клетки, на примере лактосодержащего пробиотического лекарственного препарата.
Материалы и методы. В исследовании использовали культуру Lactiplantibacillus plantarum, выделенную из образца пробиотического лекарственного препарата. Спиральный посев на агаризованные питательные бактериологические среды осуществляли с помощью автоматической системы нанесения пробы Eddy Jet 2 с последующим автоматическим учетом результатов с применением счетчика колоний IUL Flash & Go. Валидационные исследования проводили согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ОФС.1.1.0021.18).
Результаты. Определены основные валидационные характеристики методики спирального посева: рабочий диапазон от 104 до 105 КОЕ/мл, предел количественного определения — 102 КОЕ/мл, коэффициент линейной детерминации R2 — 0,99. Правильность методики спирального посева при определении специфической активности составила 93% с повторяемостью 4,9%.
Выводы. Методика спирального посева с применением автоматического счетчика колоний может использоваться при оценке качества лактосодержащих пробиотических лекарственных препаратов по показателю «Специфическая активность», поскольку результаты валидационных исследований подтверждают аналогичность анализируемых характеристик методу Коха, который применяется в настоящее время в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации. Использование методики спирального посева способствует оптимизации затрат и повышению точности результатов испытаний.
ISSN 2619-1156 (Online)