.

Актуальность проблемы бешенства для всего человечества, поиск новых путей искоренения инфекции привели к созданию новой глобальной системы для ликвидации бешенства – «Объединенные против бешенства», поставившей перед собой чрезвычайно амбициозную задачу по достижению нулевого уровня смертности людей от гидрофобии во всем мире к 2030 году. Принимая во внимание предыдущий многолетний мировой опыт уничтожения безнадзорных собак, на долю которых приходится 99 % случаев гидрофобии, что не привело к желаемому результату, в настоящее время взят курс на массовую вакцинацию собак (не менее 70 % популяции животных). Проблема бешенства комплексная, без усилия всех заинтересованных служб, серьезных финансовых затрат вряд ли удастся решить такую глобальную задачу. Материалы данной статьи являются результатом постоянного многолетнего анализа ситуации по бешенству в мире и в Российской Федерации, анализа современного состояния проблемы вакцинопрофилактики бешенства, которая играет огромную, если не ведущую, роль в предупреждении развития гидрофобии у людей, пострадавших от укусов больных бешенством животных. Сформулированы основные направления решения проблемы заболевания бешенством на современном этапе, а именно: массовая вакцинация собак; совершенствование схем и методов применения антирабических препаратов; изучение закономерностей образования иммунного ответа у лиц с ослабленным иммунитетом; постепенное внедрение в практику вакцинации людей, пострадавших от укусов больных бешенством животных, альтернативных методов введения препаратов; разработка экспресс-системы определения титров вируснейтрализующих антител; повышение уровня информированности населения об опасности заболевания.

Подготовка научных принципов разработки неоригинальных биотерапевтических (биоподобных, биоаналоговых) препаратов была начата в Европе в начале 2000-х гг., в 2009 г. они были утверждены на международной конференции ВОЗ в Сеуле с участием стран с развитой фарминдустрией. В США закон о биоподобных препаратах принят в 2012 г., за основу были взяты документы и рекомендации, подготовленные ЕМА и одобренные ВОЗ. В 2015 г. FDA опубликовало очередную редакцию основных документов, касающихся биоподобных препаратов. В основе нормативных требований США по разработке и регистрации биоподобных препаратов лежит пошаговая сравнительная оценка биоподобного и оригинального препаратов по атрибутам качества, эффективности и безопасности в соответствии с рекомендациями ВОЗ/ЕМА. При этом по таким вопросам, как дизайн сравнительных исследований качества (физико-химических и биологических свойств), присвоение Международного непатентованного наименования и взаимозаменяемость биоподобных препаратов, нормативные требования США отличаются от национальных рекомендаций других стран, в том числе ЕМА (ВОЗ).

На каждый разработанный биомедицинский клеточный продукт (БМКП), прошедший доклинические исследования, производитель (разработчик) составляет спецификацию, которая входит в состав регистрационного досье при подаче заявления на государственную регистрацию БМКП. В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 января 2017 г. № 14н «Об утверждении формы спецификации на биомедицинский клеточный продукт» спецификация должна содержать сведения об идентичности (подлинности) клеточной линии, входящей в состав БМКП, которая включает: морфологические характеристики, экспрессию специфических маркеров, экспрессию специфических генов, экспрессию специфических белков, а также маркеры стабильности клеточной линии. В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствует практический опыт проведения экспертизы качества БМКП. Цель работы: обоснование методических подходов к определению идентичности (подлинности) клеточных линий, входящих в состав БМКП, в рамках экспертизы качества на модельной клеточной линии DF-2 при использовании методов, позволяющих характеризовать морфологический, генетический, иммунофенотипический и цитогенетический профиль клеточной линии. Материалы и методы: объектом исследования была клеточная линия DF-2 — дермальные фибробласты человека (мезенхимные стволовые клетки) — получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). В работе использовали следующие методы анализа: морфологический анализ; метод проточной цитометрии для иммунофенотипирования модельной клеточной линии DF-2; метод коротких тандемных повторов для построения аллельного профиля модельной клеточной линии; цитогенетическое исследование — DAPI-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом. Результаты: в статье представлены методические подходы к определению подлинности препаратов, содержащих жизнеспособные клетки человека (аналогов БМКП), используемые в мировой практике, а также представлены результаты экспериментального определения показателя «Идентичность (подлинность)» на модельной клеточной линии. Выводы: методы оценки подлинности БМКП должны гарантировать однозначную идентификацию клеточной линии в соответствии с представленной спецификацией. В результате проведенных исследований отработана процедура экспертной оценки идентичности (подлинности) модельной клеточной линии.

Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (международное непатентованное название — алтеплаза), разработанный и зарегистрированный компанией АО «ГЕНЕРИУМ» (Россия), является полным аналогом лекарственного препарата Актилизе®, используемого для лечения заболеваний, сопровождающихся тромбообразованием, таких как инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии и ишемический инсульт. Цель работы: провести комплексное исследование сопоставимости физико-химических и биологических характеристик лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе® для оценки их биоподобия. Материалы и методы: сравнительное пептидное картирование с определением сопоставимости хроматографических профилей триптических гидролизатов проводилось методами ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии, определение молекулярно-массового распределения — методами масс-спектрометрии и электрофореза в полиакриламидном геле по Леммли. Для определения чистоты и гомогенности препаратов, а также содержания родственных примесей (олигомеров, фрагментов) использовали метод гель-фильтрации; исследование профиля N-гликозилирования осуществляли методом гидрофильной ВЭЖХ, определение тотального содержания сиаловых кислот — методом Свеннерхольма. Оценку связывания белка с фибрином и фибриногеном человека проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, сравнение специфической активности — методом лизиса фибринового сгустка. Результаты: в ходе исследований было продемонстрировано полное совпадение пептидных карт анализируемых препаратов, что свидетельствует об идентичности аминокислотной последовательности алтеплазы в составе сравниваемых препаратов. Также сравнительно были определены молекулярная масса и содержание интактной одноцепочечной формы белка в лекарственных препаратах, количественно охарактеризованы посттрансляционные модификации, содержание сиаловых кислот и нейтральных сахаров. При изучении профиля N-гликозилирования обнаружены незначительные различия в процентном содержании мультиантенных комплексных гликанов. Специфичность алтеплазы оценивали при образовании белковых комплексов с природными лигандами алтеплазы — фибрином и ингибитором активатора плазминогена первого типа, при этом достоверных различий обнаружено не было. При сравнении специфической активации фибринолитической активности плазминогена в тесте на скорость лизиса фибринового сгустка была продемонстрирована сопоставимость препаратов Ревелиза® и Актилизе®. Выводы: проведенные сравнительные экспериментальные исследования показали отсутствие различий в структуре, гетерогенности распределения зарядов, содержании примесей, а также специфической активности алтеплазы в составе лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе®, что позволяет сделать вывод о сопоставимости препаратов по физико-химическим и биологическим свойствам.

На сегодняшний день в технологии вакцины чумной живой используется комбинированный способ концентрирования микробных клеток, состоящий из трех операций суммарной продолжительностью 18 ч. К недостаткам получения концентрата в рамках существующей технологии вакцины относятся ее многооперационность, энергозатратость, продолжительность и, как следствие, малый выход концентрированной суспензии (0,04 л с 1 л нативной культуры). Цель работы состояла в оптимизации процесса концентрирования микробных клеток Yersinia pestis ЕV с применением установки тангенциальной микрофильтрации с фильтродержателем АСФ-020. Материалы и методы: в исследованиях использовали вакцинный штамм Yersinia pestis ЕV линии НИИЭГ (Научно-исследовательский институт эпидемиологии и гигиены). Для глубинного выращивания нативной культуры применяли реактор БИОР-0,25. Содержание живых микробных клеток определяли циторефрактометрическим методом. Оценку параметров окислительного метаболизма осуществляли с использованием хроноамперометрического метода. Физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины чумной живой сухой определяли в соответствии с ФС.3.3.1.0022.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания. Результаты: конструктивные особенности внедряемого оборудования позволили осуществлять мембранную фильтрацию микробной суспензии, используя в качестве емкости промежуточного хранения реактор БИОР-0,25, тем самым исключив три технологические операции. Общая концентрация микробов в суспензии, полученной регламентным и оптимизированным способами, составляла не менее 120 млрд м.кл./мл. Сравнительное изучение влияния различных гидродинамических режимов в рабочих полостях фильтрующих установок АСФ-009 и АСФ-020 существенно не повлияло на морфометрические и физиологические свойства микробных культур. На основании экспериментальных данных составлен материальный баланс процесса мембранной фильтрации. Выход концентрата с 1 л нативной культуры по оптимизированной технологии достигал 0,17 л, продолжительность процесса сократилась до 4 ч. Выводы: оптимизирован процесс концентрирования микробных клеток Y. pestis ЕV в технологическом процессе производства чумных вакцин. Сравнительное изучение морфометрических и физиологических свойств культур чумного микроба в процессе их концентрирования по оптимизированной технологии не выявило существенных отличий по сравнению с регламентной.

Согласно существующей в мире практике референс-материалы для оценки специфической активности препаратов очищенного туберкулина изготавливают из расчета использования в течение нескольких десятилетий, что предполагает их высокую стабильность. Так, туберкулин PPD-S, изготовленный в США в 1944 г., используется для международного стандарта очищенного туберкулина до настоящего времени в виде лиофилизатов в ампулах (PPDT), содержащих 5000 IU каждая. Материал для отечественного стандартного образца очищенного туберкулина ОСО ППД-Л-2 получен в 1973 г. в Ленинградском НИИВС. Многолетнее применение этой субстанции для контроля производственных серий очищенного туберкулина ППД-Л обусловлено высокой стабильностью показателя специфической активности ОСО ППД-Л-2, что должно периодически подтверждаться в широкомасштабном исследовании на различных экспериментальных моделях в соответствии с требованиями Всемирной организации здравоохранения. Цель работы: оценить долгосрочную стабильность субстанции отраслевого стандартного образца очищенного туберкулина (ОСО ППД-Л-2) путем подтверждения его специфической активности относительно международного стандарта очищенного туберкулина и определить возможность использования этой субстанции для приготовления лиофилизованных образцов референс-препарата. Материалы и методы: специфическую активность ОСО ППД-Л-2 определяли относительно международного стандарта PPDT в соответствии с методикой, указанной в ФС.3.3.1.0023.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания, используя морских свинок, вакцинированных различными субштаммами БЦЖ, или сенсибилизированных вирулентными микобактериями («живыми» или «инактивированными») в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO TRS 45, 1987). Результаты: анализ полученных данных позволил заключить, что величина показателя относительной активности ОСО ППД-Л-2 варьировала в 3–4 раза в зависимости от использованного для вакцинации морских свинок субштамма БЦЖ (модели сенсибилизации животных). Такое влияние модели титрования проявлялось при сравнении специфической активности туберкулинов, полученных различными методами осаждения туберкулопротеина (ППД-Л-2 и PPDT), т.е. отличающихся по составу антигенов. На животных, сенсибилизированных микобактериями туберкулеза, специфическая активность установленной ранее дозы ОСО ППД-Л-2 эквивалентна международному стандарту. Выводы: Полученные в данном исследовании результаты оценки специфической активности ОСО ППД-Л-2 соответствуют данным, полученным при разработке и аттестации этого референс-материала в 1980-х годах, и подтверждают долгосрочную стабильность порошка-полуфабриката отечественного стандартного образца очищенного туберкулина. В то же время получение лиофилизированной формы ОСО, помимо экономической целесообразности, исключило бы определенное количество возможных ошибок, которые неизбежны при выполнении ежегодной процедуры приготовления и контроля разведений субстанции, и позволило бы сохранить ее количество, что увеличивает перспективы дальнейшего многолетнего использования ППД-Л-2 в качестве отраслевого стандартного образца.

.