ВВЕДЕНИЕ. В настоящее время в регуляторной системе отсутствуют гармонизированные единые требования к контролю качества лекарственных препаратов (ЛП) на основе соматических клеток человека (соматотерапевтических ЛП) и тканеинженерных ЛП, в состав которых включены дифференцированные клетки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). В связи с этим актуальным представляется формирование подходов в рамках регуляторной системы Евразийского экономического союза (ЕАЭС) к разработке программы контроля качества и установлению критических показателей качества ЛП, полученных из ИПСК.

ЦЕЛЬ. Систематизация опыта ведущих мировых регуляторных органов и нормативных требований Евразийского экономического союза для разработки и обоснования программы контроля качества лекарственных препаратов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ. Основными направлениями терапевтического применения ЛП, полученных из ИПСК, являются лечение нейродегенеративных, сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний, сахарного диабета, реакции «трансплантат против хозяина» и офтальмологической патологии. За последнее десятилетие рекомендации и требования к качеству ИПСК клинического уровня были представлены Китайским обществом исследований стволовых клеток, регуляторным органом Японии, Глобальным альянсом по терапии ИПСК (GAiT), Европейским банком ИПСК (EBiSC). В рамках ЕАЭС требования к качеству генетически модифицированных клеток введены в действие в 2025 г. (глава 32 Решения Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 89 «Об утверждении Правил проведения исследований биологических лекарственных средств ЕАЭС»). Перечень критических показателей качества ИПСК клинического уровня, предложенный GAiT, в целом соответствует регуляторным нормам ЕАЭС и может быть использован при составлении программы контроля качества ЛП на основе ИПСК для применения на территории Российской Федерации и ЕАЭС. Программа контроля качества готового соматотерапевтического или тканеинженерного ЛП, полученного из ИПСК, должна основываться на принципе прослеживаемости характеристик качества начиная с исходного материала. Процедура получения ИПСК является полноценным технологическим процессом, который должен соответствовать правилам надлежащей производственной практики (GMP) для генетически модифицированных клеток. Контроль качества ИПСК должен включать определение специфических показателей, включая следующие: остаточное содержание ДНК-векторов, использованных для перепрограммирования (оценка чистоты); экспрессия маркеров недифференцированного состояния клеток (подтверждение подлинности); тест на плюрипотентность (оценка активности).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Программа контроля качества готовых ЛП, полученных из ИПСК, должна соответствовать типу дифференцированных клеток и учитывать показания к их клиническому применению. Критическими аспектами качества при характеризации ИПСК являются доказательство отсутствия примесных недифференцированных клеток и клеток с новыми иммуногенными эпитопами, подтверждение подлинности и генетической стабильности. Рассмотренные подходы к оценке качества ИПСК могут быть использованы для обоснования стратегии контроля качества ЛП на основе ИПСК, а также для формирования спецификаций при государственной регистрации по правилам ЕАЭС.

ВВЕДЕНИЕ. Производители генотерапевтических лекарственных препаратов на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ) сталкиваются в настоящее время с рядом системных проблем, в основе которых лежат трудности в оценке качества препаратов из-за недостаточной базы научных данных, опыта и несовершенства нормативных и регуляторных требований. Риск-ориентированный подход для оценки критических показателей качества в рамках концепции «качество через дизайн» (Quality by Design, QbD) обеспечивает повышение эффективности разработки и производства высокотехнологичных лекарственных препаратов.

ЦЕЛЬ. Определение критических показателей качества и их диапазонов при разработке генотерапевтических лекарственных препаратов на основе ААВ для лечения миодистрофии Дюшенна в рамках реализации концепции «качество через дизайн» (QbD).

ОБСУЖДЕНИЕ. Проведен анализ подходов к разработке технологии производства ААВ с использованием концепции QbD. Обоснован перечень основных характеристик ААВ и доступных данных об их влиянии на пациентов с точки зрения эффективности и безопасности, в том числе иммунного ответа на лечение. Проведена оценка рисков и определен перечень критических показателей качества ААВ. В ходе разработки процесса производства ААВ определены диапазоны значений для показателей качества ААВ вектора: вирусный и инфекционный титры, наличие репликативно-компетентных AАВ, содержание пустых капсидов и остаточных примесей (белки, плазмидная ДНК и остаточная ДНК продуцента). Проведена комплексная оценка рисков при определении целевого профиля продукта — препарата на основе ААВ для лечения миодистрофии Дюшенна. Разработан перечень критических показателей качества препарата и основные требования к аналитическим методикам, а также установлены диапазоны значений параметров для контроля качества продукта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Применение концепции QbD и риск-ориентированного подхода является важным этапом в идентификации критических показателей качества при разработке генотерапевтических лекарственных препаратов. Использование методологии QbD позволяет сформировать новые регуляторные стандарты оценки безопасности и эффективности генотерапевтических препаратов, а также осуществлять их фармацевтическую разработку и промышленное производство.

ВВЕДЕНИЕ. Для определения специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов в составе АКДС-вакцин крупные мировые производители, следуя принципам 3Rs (замена, уменьшение, усовершенствование), активно применяют современные альтернативные методы in vivo и in vitro. На сегодняшний день некоторые альтернативные методы полностью заменили методы in vivo. В Российской Федерации принципы 3Rs для оценки качества АКДС-вакцины практически не применяются. Процесс гармонизации Государственной фармакопеи Российской Федерации с требованиями региональной фармакопеи Евразийского экономического союза (ЕАЭС) обусловливает необходимость проведения анализа современных методов контроля качества АКДС-вакцин.

ЦЕЛЬ. Провести сравнительный анализ современных методов определения специфической активности компонентов АКДС-вакцины, оценить их преимущества и недостатки, выявить проблемные вопросы гармонизации методов в рамках ЕАЭС.

ОБСУЖДЕНИЕ. В Европейском союзе принципы 3Rs являются неотъемлемой частью законодательства. Благодаря исследованиям под эгидой ВОЗ и Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранения (EDQM) в некоторых тестах удалось полностью отказаться от использования лабораторных животных или заменить их на более гуманные, облегчающие страдания животных. Альтернативные серологические методы для контроля качества АКДС-вакцины считают щадящими, но они не исключают использование животных, которых иммунизируют для последующего получения образцов крови. Для постановки альтернативных методов определения специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов требуются дополнительные материалы, реактивы, стандартные образцы, специальное оборудование и статистическое программное обеспечение. Методы многоэтапны, требуют вовлечения большего числа специалистов. Альтернативный серологический метод на основе ИФА обладает определенным преимуществом перед методом летального заражения. В нем исключено использование токсинов и доступно определение содержания сразу двух видов защитных антител в образцах сыворотки крови, полученных от одного животного.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Несмотря на активное развитие и внедрение методов контроля качества вакцин in vitro, для дифтерийного и столбнячного компонентов АКДС-вакцины методы летального заражения более экономичны, просты в исполнении и позволяют оценить прямое протективное действие вакцины. Из альтернативных методов для контроля качества АКДС-вакцины наиболее перспективным является метод на основе иммуноферментного анализа.

ВВЕДЕНИЕ. Специфический иммуноглобулин человека получают из плазмы крови иммунизированных доноров и применяют для иммунопрофилактики вирусного гепатита В. Основная проблема при контроле качества таких препаратов и оценке их профилактической эффективности связана с отсутствием стандартных образцов, аттестованных по содержанию антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Систематизация и анализ существующего лабораторного и производственного опыта в данной области нужны для выработки новых подходов к стандартизации препаратов иммуноглобулина человека против гепатита В.

ЦЕЛЬ. Охарактеризовать лекарственные препараты иммуноглобулина человека против гепатита В и рассмотреть подходы к их стандартизации.

ОБСУЖДЕНИЕ. Большая часть препаратов иммуноглобулина человека против гепатита В разработана в Германии (27%), Италии (17%) и США (17%). Из всех препаратов 67% выпускается в лекарственной форме для внутримышечного введения, 30% — для внутривенного введения, 3% — для подкожного введения. Специфическая активность указанных лекарственных средств варьирует от 50 до 500 МЕ/мл. В России зарегистрировано три наименования препарата, содержащего специфический иммуноглобулин человека. Количество вводимых в гражданский оборот лекарственных средств не в полной мере покрывает потребности лечебно-профилактических учреждений. Эффективность иммунопрофилактики напрямую зависит от дозы препарата, которую рассчитывают исходя из специфической активности. Для обеспечения точности определения указанного показателя качества следует использовать стандартный образец содержания антител к поверхностному антигену вируса гепатита В, аттестованный в международных единицах. Существующий международный стандарт специфического иммуноглобулина человека ограниченно доступен для приобретения на территории Российской Федерации, а национальный (фармакопейный) стандартный образец отсутствует.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Анализ данных о выпускаемых препаратах иммуноглобулина человека против гепатита В позволил выявить современные направления развития данной сферы фарминдустрии. Разработка и применение национального (фармакопейного) стандартного образца содержания антител к поверхностному антигену вируса гепатита В будет способствовать повышению качества продукции и эффективности иммунопрофилактики.

ВВЕДЕНИЕ. В настоящее время национальный фармакопейный стандартный образец (ФСО.3.2.00247) для оценки активности адсорбированного столбнячного анатоксина (СА) аттестован только на мышах, в то время как международный стандартный образец (МСО) ВОЗ аттестован на двух видах животных — мышах и морских свинках. В связи с формированием регуляторной системы Евразийского экономического союза (ЕАЭС) и гармонизацией Фармакопеи ЕАЭС с Европейской фармакопеей актуально дополнить аттестованную характеристику ФСО.3.2.00247 значением специфической активности, установленной методом летального заражения на морских свинках.

ЦЕЛЬ. Определение величины специфической активности фармакопейного стандартного образца адсорбированного столбнячного анатоксина методом летального заражения на морских свинках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали четвертый МСО ВОЗ адсорбированного СА (4th WHO International Standard for tetanus toxoid adsorbed), ФСО для оценки активности адсорбированного СА (ФСО.3.2.00247, серия 011-210619). Определение специфической активности ФСО адсорбированного СА проводили методом летального заражения относительно МСО на морских свинках в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи (монография 2.7.8). В работе использованы 352 аутбредные морские свинки весом 250–350 г. Животных по 8–10 особей равномерно распределяли по опытным группам для проведения иммунизации: 4 группы для МСО и ФСО соответственно. Через 28–30 сут проводили инъекции столбнячного токсина — 50 LD₅₀. Результат оценивали в течение 5 сут, регистрируя клинические признаки столбнячной интоксикации согласно международной шкале. Для контроля активности столбнячного токсина группе неиммунизированных животных из той же партии вводили соответственно 2; 1; 0,5; 0,25 LD₅₀ токсина. Величину специфической активности ФСО и LD₅₀ токсина рассчитывали по формуле Кербера.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Разработана программа аттестации ФСО.3.2.00247 (серия 011-210619). Проведена аттестация ФСО методом летального заражения на морских свинках. По результатам четырех испытаний установлено значение специфической активности ФСО.3.2.00247, которое составило 220 МЕ/ампула. Полученные экспериментальные данные являются основанием для внесения изменений в паспорт ФСО.3.2.00247 (серия 011-210619) путем дополнения его значением активности, определенным на морских свинках (220 МЕ/ампула). Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования ФСО не только в методе летального заражения, но и в альтернативных методах контроля, в том числе в иммуноферментном анализе.

ВЫВОДЫ. Аттестованная характеристика фармакопейного стандартного образца адсорбированного столбнячного анатоксина может быть дополнена значением специфической активности, установленной методом летального заражения на морских свинках — 220 МЕ/ампула.

ВВЕДЕНИЕ. Современные подходы к микробиологическим испытаниям в фармацевтической промышленности требуют использования стандартизированных по количеству жизнеспособных клеток тест-штаммов микроорганизмов. Наиболее удобной формой для их хранения и транспортировки является лиофилизированное состояние, обеспечивающее длительное сохранение жизнеспособности микроорганизмов. В научной литературе хорошо описаны различные режимы высушивания микроорганизмов в высокой концентрации (10⁷–10¹² КОЕ/мл). Однако такие режимы нельзя напрямую применять при работе со стандартизированными по количеству жизнеспособными клетками в низкой концентрации (10³ КОЕ/мл). Определение оптимального режима лиофилизации позволит решить проблему сохранения жизнеспособности клеток микроорганизмов в низкой концентрации.

ЦЕЛЬ. Разработка режима высушивания с использованием аппарата камерного типа, обеспечивающего выживаемость тест-штаммов микроорганизмов, стандартизированных по количеству жизнеспособных клеток в концентрации 10³ КОЕ/мл.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали тест-штаммы микроорганизмов Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony NCTC 6017, Staphylococcus aureus АТСС 6538 и 6538P, Alcaligenes faecalis 415, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Yersinia enterocolitica ATCC 9610, Escherichia coli ATCC 25922, Micrococcus luteus ATCC 10240. Тест-штаммы лиофилизировали в сахарозо-желатиновой защитной среде, используя лиофильный аппарат камерного типа Martin Christ Epsilon 2-4 LSCplus.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В экспериментах были установлены оптимальные параметры лиофильного высушивания микроорганизмов в концентрации 10³ КОЕ/мл в аппарате камерного типа: замораживание до минус 25 °С; первичное высушивание при температуре полки минус 35 °С и вакууме 0,4 мбар в течение 8 ч; досушивание при температуре 30 °С в течение 4 ч и остаточном давлении 0,001 мбар. Выживаемость тест-штаммов в низкой концентрации составляла от 22 до 100% в зависимости от вида микроорганизма. Качество полученных образцов тест-штаммов соответствовало показателю «Потеря в массе при высушивании», значения которого варьировались от 0,8 до 2,1%.

ВЫВОДЫ. Разработанный режим высушивания позволяет сохранять количество жизнеспособных клеток микроорганизмов, стандартизированных в низкой концентрации, используя лиофильный аппарат камерного типа. Замораживание ниже температуры эвтектики может снижать выживаемость микробных клеток после высушивания, как это показано для A. faecalis 415. Оценка выживаемости группы из восьми микроорганизмов в низкой концентрации после лиофилизации проведена впервые в России.

ВВЕДЕНИЕ. Активный поиск пробиотических штаммов микроорганизмов, в том числе относящихся к индигенным штаммам бифидобактерий, является важной задачей при создании лечебно-профилактических пробиотических препаратов. При определении пробиотического потенциала кандидатных штаммов необходима их оценка по показателям жизнеспособности бактерий, чувствительности к антибиотикам, устойчивости к желудочному соку и желчи, лизоцимрезистентности и биопленкообразованию.

ЦЕЛЬ. Характеристика композиции индигенных штаммов Biffdobacterium biffdum ICIS-310 и Biffdobacterium longum ICIS-505 в качестве потенциального пробиотического препарата.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использованы штаммы B. biffdum ICIS-310 и B. longum ICIS-505. Оценивали чувствительность штаммов к антибиотикам, а также устойчивость к желудочному соку и желчи. Проводили исследование монокультур бифидобактерий B. biffdum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 и их композиции по количеству жизнеспособных клеток при культивировании, антилизоцимной активности (лизоцимрезистентности), биопленкообразованию. При определении антагонистической активности в качестве тест-штаммов условно-патогенных и патогенных культур использовали Candida albicans ATCC 24433, Proteus mirabilis ATCC 29906, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Shigella flexneri ATCC 12022, Klebsiella pneumoniaе ICIS-278_PBV. Содержание уксусной кислоты в среде культивирования определяли методом газожидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Отобранные по критериям численности, лизоцимрезистентности и биопленкообразования индигенные штаммы B. biffdum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 не имели генов патогенности, обладали устойчивостью к ряду антимикробных препаратов (бензилпенициллин, стрептомицин и эритромицин) и сохраняли свою жизнеспособность в присутствии желчи в течение 2 ч и желудочного сока — 30 мин. Исследуемые культуры бифидобактерий обладали биосовместимостью: в композиции штаммов через 48 ч количество микробных клеток было выше, чем в монокультурах. При совместном культивировании штаммы B. biffdum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 проявляли синергетический эффект, повышая уровень лизоцимрезистентности до 2,2±0,30 мкг/мл×ОП₄₅₀, биопленкообразования до 0,89±0,20 ед. ОП₆₃₀ и продукцию ацетата до 33,2 мМ/л. Композиция бифидобактерий обладала более выраженной антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам бактерий и грибов (зоны угнетения роста тест-культур 30–36 мм) в сравнении с монокультурами (зоны угнетения роста тест-культур 18–24 мм).

ВЫВОДЫ. Индигенные штаммы B. biffdum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 устойчивы к антимикробным препаратам, желчи и желудочному соку. При совместном культивировании штаммов выявлен синергетический эффект в отношении усиления показателей лизоцимрезистентности, биопленкообразования и антагонистической активности. Исследованные штаммы бифидобактерий и их композиция перспективны с целью создания новых пробиотических препаратов. Оценка лизоцимрезистентности и биопленкообразования может быть рекомендована в качестве показателей адаптивного потенциала микробиоты при отборе и тестировании пробиотических штаммов.

ВВЕДЕНИЕ. Вирус Чикунгунья (ВЧИК) за последние годы широко распространился во многих частях мира, вызывая крупномасштабные вспышки с серьезными экономическими и социальными последствиями. Для повышения эффективности борьбы с вирусом необходимо разрабатывать и совершенствовать методы диагностики ВЧИК не только в сыворотке крови пациентов, но и в полевых материалах — для выявления и уничтожения очагов инфекции. Определение антигенов ВЧИК также важно проводить в образцах культуральной жидкости на разных этапах разработки и производства вакцин.

ЦЕЛЬ. Разработка количественной тест-системы на основе одностадийного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа для выявления Е2 антигена вируса Чикунгунья в культуральных жидкостях, а также методики расчета массы цельновирионного антигена в образце.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали два мышиных моноклональных антитела к ВЧИК; очищенный вирус Чикунгунья (штамм Nika21, GenBank ID PQ673601) и рекомбинантный Е2 антиген ВЧИК. Для сравнения чувствительности методов иммуноферментного анализа (ИФА) и обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-кПЦР-РВ) использовали образцы культуральной жидкости, которые собирали в разные временные точки (18, 24, 46, 72 ч) после заражения ВЧИК клеток Vero. Основные аналитические и технические характеристики разработанной ИФА тест-системы определяли в соответствии с требованиями ГОСТ 51352–2013.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Аналитическая чувствительность метода составила не менее 0,625 нг/мл, значение коэффициента вариации — не более 3,56%, тест на «открытие» — 100%, результаты теста на «линейность» в диапазоне концентраций 1,5–16 нг/мл были в пределах 90–110%. Специфичность метода составила 100%; перекрестная реактивность не наблюдалась с образцами, содержащими вирусы денге, желтой лихорадки, Синдбис, краснухи и вирус Западного Нила. Разработанная ИФА тест-система и метод ОТ-кПЦР-РВ продемонстрировали схожие результаты при определении массы цельновирионного антигена в вируссодержащей жидкости — 1,06 и 1,09 мкг/мл соответственно при использовании коэффициента пересчета.

ВЫВОДЫ. Для количественного определения E2 антигена ВЧИК в культуральных образцах была разработана простая, специфичная и чувствительная ИФА тест-система, которую также можно использовать для быстрого анализа полевых образцов. Предложен метод расчета массы цельновирионного антигена по количеству Е2 белка (ИФА) и геномным эквивалентам (ОТ-кПЦР-РВ). Между оптической плотностью в ИФА и пороговым циклом в ПЦР-РВ установлена сильная обратная корреляция.

ВВЕДЕНИЕ. Трастузумаб — препарат на основе рекомбинантных гуманизированных моноклональных антител к HER2, показан для таргетной терапии HER2⁺ рака молочной железы. Применение трастузумаба стало рутинной практикой в лечении рака и позволяет повысить общую выживаемость пациенток. Однако в ряде случаев трастузумаб способен вызывать появление антилекарственных антител (АЛА), снижающих эффективность таргетной терапии. По этой причине своевременное выявление АЛА в сыворотке крови необходимо для возможной коррекции терапии.

ЦЕЛЬ. Разработка и валидация методики полуколичественного определения общих АЛА к трастузумабу в биологических жидкостях методом твердофазного иммуноферментного анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Тест-система представлена в виде классического ИФА-набора, в состав которого входят 96-луночный планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок трастузумабом, раствор вторичных антител (трастузумаб, конъюгированный с пероксидазой хрена), субстратный раствор (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) и стоп-раствор. Оптическую плотность определяли с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм. Растворы для контроля качества готовили путем разведения моноклональных антител к трастузумабу в буферном растворе, содержащем сыворотку крови человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Наименьшая определяемая концентрация АЛА составила 2 нг/мл при 2-кратном значении показателя минимального необходимого разведения. Методика устойчива к наличию 116 нг/мл трастузумаба при уровне 16 нг/мл АЛА и 1000 нг/мл трастузумаба при уровне 100 нг/мл АЛА. Доказана специфичность, селективность и прецизионность методики внутри одной аналитической серии, а также между разными сериями. Вероятность «хук»-эффекта от избыточных концентраций АЛА исключается в диапазоне от 0,16 до 640 нг/мл. Продемонстрирована краткосрочная стабильность АЛА в образцах в течение 6 ч при комнатной температуре, долгосрочная стабильность при хранении образцов при минус 70 °С в течение 90 сут и стабильность при трех циклах замораживания до минус 70 °С (по 12 ч) и оттаивания.

ВЫВОДЫ. Установленные параметры представленной тест-системы свидетельствуют о возможности ее применения для выявления антилекарственных антител к трастузумабу в биологических жидкостях при таргетной терапии.