Лиофилизация стандартизированных по количеству жизнеспособных клеток микроорганизмов в низкой концентрации: разработка режима высушивания

ВВЕДЕНИЕ

Одной из важных задач Государственной коллекции микроорганизмов является пополнение, поддержание и обеспечение заинтересованных учреждений, в том числе производителей лекарственных препаратов, типовыми и референсными тест-штаммами микроорганизмов [1]. Последние широко используются при проверке ростовых свойств питательных сред, оценке работы оборудования, валидации методик, при проведении микробиологических испытаний, а также при контроле качества работы лаборатории и подтверждении компетентности лабораторий на соответствие ГОСТ ISO/IEC 17025-2019 [2].

Лиофилизированные образцы тест-штаммов микроорганизмов являются лучшим выбором как для долгосрочного хранения, так и для транспортирования, что позволяет сохранить микроорганизмы в жизнеспособном состоянии. Для упрощения работы микробиологических лабораторий и увеличения точности проведения испытаний целесообразно использовать образцы лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов, готовых к использованию сразу после растворения и исключающих проведение дополнительных манипуляций по культивированию и приготовлению серийных разведений. Готовые к использованию образцы тест-штаммов должны содержать стандартизированное количество живых микробных клеток в концентрации 10³ КОЕ/мл.

Существует немало работ, посвященных выбору оптимальных условий высушивания и культивирования микроорганизмов перед высушиванием [3–6] или выбору оптимальных лиопротекторов [7–10], но все они касаются высушивания микроорганизмов в высоких концентрациях (10⁷–10¹² КОЕ/мл). Известно, что высокая концентрация клеток способствует лучшей выживаемости микроорганизмов при высушивании [11][12]. Таким образом, условия высушивания микроорганизмов в концентрации 10⁷–10¹² КОЕ/мл нельзя напрямую экстраполировать на подготовку лиофилизатов микроорганизмов в низкой концентрации.

Ранее нами были определены параметры лиофильного высушивания с применением аппарата коллекторного типа и по результатам проведенной работы разработаны несколько режимов высушивания коллекционных штаммов в ампулах [13]. При использовании аппарата данного типа можно контролировать только время высушивания. Современное лиофильное оборудование камерного типа позволяет контролировать практически все параметры процесса: температуру замораживания и нагревания образцов, время каждого этапа и глубину вакуума в камере. Таким образом, при оптимизации режима высушивания можно улучшить качество готового лиофилизированного продукта.

Обычно в режиме лиофильного высушивания выделяют три этапа: замораживание, первичное высушивание и досушивание [14].

Замораживание — первый и важнейший этап лиофилизации для всего цикла высушивания [15]. Замораживание сложных растворов, содержащих лиопротекторы (сахароза), проходит по механизму стеклования. При замораживании растворов, содержащих воду и растворенные в ней вещества, происходит их эвтектическое разделение. Оно заключается в том, что замерзает чистая вода (кристаллизация), а вещества концентрируются в незамерзающей части до тех пор, пока раствор не достигнет эвтектической концентрации. Температура, при которой достигается максимальная концентрация данного вещества и происходит замораживание всего раствора, называется эвтектической точкой.

При замерзании чистой воды снижается средняя кинетическая энергия молекул, то есть происходит выделение тепла. На графике кристаллизация обозначается моментом резкого нагревания образцов на несколько градусов. Данное значение температуры указывает на начало эвтектической зоны. При этом между кристаллами воды остается жидкая вода, в которой концентрируются растворенные вещества. Присутствие жидкой воды способствует электропроводности, выраженной в низком электрическом сопротивлении [16]. Таким образом, устанавливая температуру замораживания образцов и анализируя показатели электрического сопротивления, можно контролировать качество конечного лиофилизированного продукта.

Температура замораживания влияет на проницаемость клеточной мембраны, снижая жизнеспособность микроорганизмов [3][17]. Если температура замораживания будет недостаточно низкой и образцы не полностью замерзнут, то при сублимации такой образец вспенится, что приведет к потере качества конечного продукта. Напротив, слишком низкая температура замораживания существенно увеличивает время высушивания и потребления энергии, а также может привести к снижению выживаемости микроорганизмов при дальнейшем хранении [4].

На втором этапе (первичное высушивание), происходит сублимация воды из лиофилизуемого образца в условиях вакуума. К образцам подводят дополнительную энергию, необходимую для сублимации влаги путем нагревания полки, на которой расположены образцы. Образцы также получают энергию теплового излучения окружающей среды (рис. 1). Крайние флаконы получают больше энергии и их содержимое высыхает быстрее остальных («эффект краевого флакона»).

Третий этап (досушивание или вторичное высушивание) является критическим для лиофилизации, поскольку определяет остаточную влажность образцов. На данном этапе связанная вода, оставшаяся адсорбированной в образцах после сублимации, удаляется путем десорбции. Для ее удаления необходимо подвести дополнительную энергию к образцам, что достигается нагреванием полки и максимальным снижением давления в камере. При досушивании необходимо достигнуть остаточной влажности 1–3% для предотвращения химической деградации и физического разрушения структуры лиофилизата.

Суммируя вышесказанное: для получения образцов тест-штаммов, содержащих низкую концентрацию клеток, важно разработать специальный режим высушивания, который будет способствовать сохранению жизнеспособности максимального исходного количества клеток микроорганизмов.

Цель работы — разработка режима высушивания с использованием аппарата камерного типа, обеспечивающего выживаемость тест-штаммов микроорганизмов, стандартизированных по количеству жизнеспособных клеток в концентрации 10³ КОЕ/мл.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В работе применяли тест-штаммы микроорганизмов, рекомендованные к проведению микробиологических испытаний Государственной фармакопеей Российской Федерации XV изд.: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony NCTC 6017; Staphylococcus aureus АТСС 6538 и 6538P; Alcaligenes faecalis 415; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; Yersinia enterocolitica ATCC 9610; Escherichia coli ATCC 25922. Все штаммы получены из основного фонда Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.

Питательная среда ГРМ-агар (серия О1-К-755) получена от ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора. В качестве лиопротектора использовали сахарозо-желатиновую среду, которая содержала по массе 10% сахарозы (кат. № 1.07653, серия K48546153, Merck, Франция) и 1,5% желатина (кат. № 1.04070, серия VM918570, Merck, Франция). В работе также использовали фармакопейный стандартный образец (ФСО) Государственной фармакопеи Российской Федерации мутности бактериальных взвесей 10 МЕ ФСО 3.1.00084 (ОСО 42-28-84, серия S-2/8-010122, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) (далее — ФСО мутности бактериальных взвесей). Подготовленную бактериальную суспензию разливали во флаконы для лиофилизации объемом 2,0 мл из боросиликатного стекла стандарта 2R (артикул 1637441, серия 6106541118, Shott, Германия).

Оборудование

В работе использовали следующее оборудование: сушку лиофильную Epsilon 2-4 LSCplus с датчиками измерения температуры и электрического сопротивления LioRx (Martin Christ, Германия); весы специальные класса 1 ML204T/A00 (Mettler Toledo, Швейцария); генератор плазмы PG 1200 (Fergutec, Нидерланды); вакуумно-сушильный шкаф VD 23 (Binder, Германия); термостат MIR254 (Panasonic Healthcare Co., Ltd, Япония); шкаф ламинарный БАВ п-01-1,2, класс защиты II (ЗАО «Ламинарные системы», Россия).

Методы

Температуру замораживания образцов, помещенных в лиофильный аппарат, определяли посредством измерения электрического сопротивления с помощью датчика LioRx и температурного датчика, входящих в комплект лиофильной сушки Epsilon 2-4 LSCplus. В момент замораживания температура образца снижается, а электрическое сопротивление резко возрастает из-за снижения подвижности ионов в момент перехода из жидкого в твердое состояние. Анализируя график замораживания флаконов в лиофильной сушке, за точку замерзания можно принять пересечение кривых электрического сопротивления и температуры.

Оценку выживаемости микробных клеток после замораживания и лиофилизации проводили путем культивирования тест-штаммов при 37±2 °С на поверхности агаризованной среды в чашках Петри. Для лиофильного высушивания использовали суточную культуру микроорганизмов. Колонии отбирали бактериологической петлей и готовили в стерильной воде суспензию, соответствующую 10 МЕ ФСО мутности бактериальных взвесей. Полученную суспензию путем последовательных десятикратных разведений в сахарозо-желатиновой среде доводили до концентрации 10³ КОЕ/мл микробных клеток и вносили по 0,5 мл во флаконы. Для определения концентрации микробных клеток проводили посев суспензии в объеме 0,1 мл на поверхности агаризованной среды в чашках Петри.

Флаконы с суспензией (флаконы) помещали в лиофильную сушку и замораживали в течение 2 ч при температуре полки минус 35, 45 и 55 °С. По окончании замораживания, непосредственно перед первичным высушиванием, отбирали по 3 образца каждого штамма и размораживали в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин, а затем проводили посев. Оставшиеся флаконы высушивали при температуре полки минус 20 °С и вакууме 0,4 мбар в течение 10 ч. Затем флаконы досушивали при температуре 30 °С и вакууме 0,006 мбар в течение 4 ч. По окончании лиофилизации определяли количество жизнеспособных клеток и рассчитывали показатель выживаемости, выраженный как отношение количества жизнеспособных клеток после высушивания к исходному количеству клеток.

Определение условий первичного высушивания весовым методом. Критерием первичного высушивания служило изменение массы образцов вследствие удаления воды при сублимации. Массу образца в каждом флаконе рассчитывали по разнице между массой флакона с образцом и массой пустого флакона. Для оценки влияния глубины вакуума проводили три цикла сублимации при давлении 0,4, 0,04 и 0,004 мбар. Высушивание завершали через 5 ч, после чего взвешивали флаконы и рассчитывали массу сублимированной влаги и скорость сублимации образцов.

Определение времени досушивания. Образцы замораживали и проводили сублимацию, как указано выше. Затем в камере создавали минимальное возможное давление, а температуру полки повышали до 30 °С. После нагрева полки образцы отбирали каждый час (6 временных точек) и определяли остаточную влажность образцов по потере в массе при высушивании.

Определение потери в массе при высушивании проводили согласно ОФС.1.2.1.0010.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации¹. Для определения потери в массе при высушивании использовали 20 флаконов, из содержимого которых формировали три навески. Высушивание проводили при температуре 60 °С и давлении менее 7 гПа.

Статистическая обработка результатов включала в себя расчет среднего значения измеряемого параметра, стандартного отклонения от среднего значения и относительного стандартного отклонения с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение температуры замораживания

На графике замораживания сахарозо-желатиновой среды (рис. 2) можно выделить несколько стадий. На первой стадии защитная среда охлаждается и температура постепенно снижается до точки замерзания воды и начала образования первых кристаллов льда. Лиопротекторы (сахароза и желатин) понижают точку замерзания ниже 0 °С. Как следует из графика (рис. 2), данная среда замерзает при температуре минус 9,9 °С. Процесс кристаллизации является экзотермическим, поэтому происходит нагрев образца до минус 1,6 °С. При кристаллизации электрическое сопротивление резко повышается, но не достигает 100%, так как проходит процесс стеклования раствора (постепенный переход в твердую фазу без кристаллизации). Начинается вторая стадия — стеклование образца, когда он становится более вязким, пока не затвердеет полностью. По достижении температуры образца ниже минус 25 °С электрическое сопротивление достигает 100% (табл. 1). Таким образом, при лиофилизации замораживание необходимо проводить до температуры образца ниже минус 25 °С. Разница температуры полки и лиофилизированного продукта составляет 10 °С. Поэтому для замораживания образцов температура полки должна составлять минус 35 °С.

Влияние температуры замораживания на выживаемость тест-штаммов микроорганизмов

Результаты оценки влияния температуры замораживания на жизнеспособность тест-штаммов микроорганизмов после замораживания и лиофилизации представлены в таблице 2. При температуре ниже минус 40 °С количество жизнеспособных клеток штамма A. faecalis 415 уменьшается, хотя для двух других штаммов, S. Abony NCTC 6017 и S. aureus АТСС 6538, различия незначительны. Это объясняется тем, что микроорганизмы, содержащие жгутики и не ферментирующие трегалозу, такие как A. faecalis, имеют более низкую выживаемость после лиофилизации [18]. Поэтому для лиофилизации образцов выбрана температура минус 25 °С при температуре полки лиофильного аппарата минус 35 °С.

Определение условий первичного высушивания

При температуре полки минус 20 °С отсутствует плавление защитной среды. Небольшое плавление наблюдается при температурах минус 15 и минус 10 °С. Скорость сублимации при температурах полки минус 15 и минус 20 °С одинаковая. Поэтому оптимально проводить высушивание при температуре полки минус 20 °С, так как отсутствует вероятность плавления образцов.

После определения температуры нагрева полки оценили влияние глубины вакуума на скорость сублимации. При понижении давления скорость высушивания снижается, увеличивая общее время сублимации. Результаты эксперимента приведены в таблицах 3 и 4. Таким образом, оптимально было использовать остаточное давление в камере на уровне 0,4 гПа.

После определения условий первичного высушивания рассчитали скорость высушивания образцов в зависимости от расположения в камере лиофильного аппарата при его полной загрузке (рис. 3). Процесс сублимации протекает линейно, происходит постепенное углубление зоны высушенного образца [1]. Из рисунка 3 следует, что процесс продолжался в течение 8 ч, после чего останавливался. Затем переходили к следующему этапу — досушиванию.

Определение времени досушивания

В предыдущих исследованиях нами было определено, что продолжительность досушивания не оказывает влияния на выживаемость S. Abony, S. aureus и A. faecalis после лиофилизации и последующем хранении [13]. При определении потери в массе при высушивании остаточная влажность нормируется в диапазоне от 0 до 3%. В качестве критерия окончания времени досушивания была выбрана середина диапазона (1,5%), но не менее 0,5%, так как слишком низкая остаточная влажность может привести к снижению выживаемости клеток микроорганизмов за счет удаления связанной воды и денатурации белковых структур. Такая остаточная влажность достигается за 4 ч досушивания при 30 °С (рис. 4).

Таким образом, по результатам проведенных исследований можно предложить режим высушивания тест-штаммов микроорганизмов в аппарате камерного типа с параметрами, указанными в таблице 5.

Подобранный режим высушивания верифицировали на нескольких сериях образцов разных тест-штаммов микроорганизмов в концентрации 10³ КОЕ/мл (табл. 6). В каждой серии отмечалось высокое качество лиофилизата: ровная белая таблетка, растворяющаяся в течение 30 с в 0,5 мл стерильной воды очищенной. При культивировании каждого тест-штамма наблюдались типичные колонии, соответствующие морфологическим свойствам данного штамма.

Выживаемость грамположительных бактерий после лиофилизации оказалась выше, чем грамотрицательных, что, возможно, связано со строением клеточной стенки. Результаты оценки выживаемости совпадают с результатами исследований патентованных микроорганизмов в депозитариях Японии [19] и ФКУН РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора [18], однако описанное в этих работах высушивание проводили в условиях высокой концентрации клеток. Установленное нами сходство данных оценки выживаемости клеток микроорганизмов, взятых для высушивания в высоких и низких концентрациях, указывает на то, что выживаемость является видоспецифическим признаком, а разработанный режим высушивания может быть использован для лиофилизации стандартизированных по количеству жизнеспособных клеток микроорганизмов.

Проведенное исследование подчеркивает важность оптимизации условий лиофилизации, поскольку выбор параметров процесса влияет на выживаемость микроорганизмов. Замораживание ниже температуры стеклования приводит к снижению жизнеспособности некоторых штаммов. Увеличение глубины вакуума не ускоряет процесс высушивания, а продлевает время сублимации. Таким образом, описанный подход к определению параметров лиофильного высушивания может быть использован для оптимизации цикла лиофилизации при создании и поддержании коллекций микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан режим лиофильного высушивания тест-штаммов микроорганизмов в низкой концентрации (10³ КОЕ/мл), включающий замораживание до температуры не выше минус 25 °C, первичное высушивание при температуре полки минус 35 °C и вакууме 0,4 мбар, а также досушивание при 30 °C и остаточном давлении 0,001 мбар.
2. Выживаемость тест-штаммов микроорганизмов зависит от температурного режима замораживания: температура замораживания ниже эвтектической точки может снижать жизнеспособность микроорганизмов, особенно A. faecalis.
3. Полученные результаты исследования могут быть положены в основу стандартизации процесса лиофилизации тест-штаммов микроорганизмов в рамках фармакопейных требований и микробиологического контроля.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.А. Воропаев — концепция работы, проведение экспериментальной работы, написание текста рукописи, формулировка выводов; Ю.И. Крысанова — проведение экспериментальной работы; О.В. Фадейкина — участие в формулировке выводов, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; Р.М. Валюхова — проведение экспериментальной работы, написание текста рукописи; Д.С. Давыдов — концепция работы, утверждение окончательной версии рукописи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. A.A. Voropaev conceptualized the work, conducted the experiments, drafted the manuscript, and compiled the conclusions. Yu.I. Krysanova conducted the experiments. O.V. Fadeikina compiled the conclusions and approved the final version of the manuscript for publication. R.M. Valyukhova conducted the experimental work and drafted the manuscript. D.S. Davydov conceptualized the work and approved the final version of the manuscript for publication.