ВВЕДЕНИЕ. При создании биотехнологических лекарственных препаратов ключевое значение имеет разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков. Отработка протоколов селекции и подходов для эффективного скрининга линий-продуцентов целевых белков — необходимый этап разработки технологии производства рекомбинантных белков с высоким выходом целевого продукта.

ЦЕЛЬ. Получение высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного белка деносумаба на основе суспензионной клеточной линии СНО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовалась суспензионная клеточная линия СНО-К1. Для культивирования применялись среды и подпитки без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Клетки линии СНО трансфицировали плазмидами, содержащими гены легкой и тяжелой цепей деносумаба, с использованием метода электропорации с помощью системы MaxCyte STX. Селекцию трансфицированных клеток проводили с добавлением антибиотиков (гигромицин, генетицин). Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы ClonePix FL. Проводили периодическое культивирование с добавлением подпитки и определение концентрации деносумаба методом иммуноферментного анализа (ИФА) в культуральной жидкости для выявления лидерных моноклональных клеточных линий.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Оптимальная концентрация антибиотиков для селекции клеточных линий-продуцентов на основе клеток СНО составила 600 мг/л гигромицина и 600 мг/л генетицина. После проведения трансфекции из 1920 минипулов селекцию прошел 1041 (около 54%). Отбор минипулов-продуцентов деносумаба проводили путем скрининга проб культуральной жидкости с использованием ИФА из 96-, 24- и 6-луночных планшетов. Отобранные 23 лидерных минипула были адаптированы к условиям шейкерного культивирования. С учетом показателей ростовых и продукционных характеристик минипулов определен лидерный минипул (mp-19) с продуктивностью 1,92 г/л (на 7 сут периодического культивирования). На основе mp-19 получены моноклональные клеточные линии-продуценты деносумаба с продуктивностью до 6,5 г/л на 9 сут культивирования с подпиткой.

ВЫВОДЫ. Получены высокопродуктивные моноклональные клеточные линии-продуценты деносумаба. Предложенный подход к созданию клеток-продуцентов может быть применен для получения различных рекомбинантных белков, включая моноклональные антитела, ферменты, факторы свертывания крови.