ВВЕДЕНИЕ. В отсутствие возможности использовать международный стандартный образец (СО) антигена и антисыворотку к нему для количественного определения содержания гемагглютинина (ГА) вируса гриппа методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), а также в условиях пандемии или другой чрезвычайной ситуации необходимы валидированные альтернативные методы для количественного определения ГА.

ЦЕЛЬ. Оптимизация методики аттестации первичного стандартного образца содержания гемагглютинина вируса гриппа с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом с последующей денситометрической обработкой гелей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Содержание ГА (%) в СО определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата (ДСН-ПААГ) в условиях воспроизводимости (2 лаборатории). Концентрацию ГА (мкг/мл) определяли с учетом содержания общего белка, которое определяли по методу Лоури. Метод ОРИД использовался для оценки правильности количественного определения ГА. Обработку изображений пластин, расчет квадратов диаметров колец преципитации и количества ГА в образцах проводили с помощью программного обеспечения CombiStats. Сахарозу и глицерин в вирусном и разведенном вирусном концентратах (РВК) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Добавление 0,072 мМ 2-меркаптоэтанола для обработки образцов позволяет исключить использование мочевины при проведении электрофореза в ДСН-ПААГ с дегликозилированием. Результаты определения концентрации ГА в РВК методом электрофореза в ДСН-ПААГ при использовании 4–12% бис-трис гелей в лаборатории № 1 практически совпадают с результатами лаборатории № 2 (4–20% трис-глициновые гели) — 135,8 и 135,5 мкг/мл соответственно; значение коэффициента вариации не превышает 4% в обеих лабораториях. Концентрация ГА, определенная методом электрофореза в ДСН-ПААГ в лаборатории № 1, сопоставима с данными ОРИД (123,6 мкг/мл). Содержание вспомогательных веществ (глицерин, сахароза) не превышает 55 мкг/мл в РВК и не влияет на результаты определения белка.

ВЫВОДЫ. Установлены оптимальные условия электрофореза в ДСН-ПААГ для аттестации первичного жидкого СО содержания ГА вируса гриппа, что позволяет получать результаты, сопоставимые с данными метода ОРИД. На следующем этапе исследования планируется апробация условий пробоподготовки и количественного определения всех типов ГА (H1N1, H3N2, В), актуальных в сезоне 2025–2026 гг.

ВВЕДЕНИЕ. Гликановый профиль — критический параметр качества лекарственных средств (ЛС) на основе моноклональных антител (МкАТ), контроль которого обязателен при разработке и выпуске каждой серии ЛС. Актуальность работы обусловлена необходимостью разработки воспроизводимого протокола пробоподготовки для анализа гликанового профиля, адаптированного к условиям стандартной физико-химической лаборатории и не требующего применения коммерческих наборов ограниченной доступности.

ЦЕЛЬ. Разработать альтернативный способ пробоподготовки для количественной характеризации гликанового профиля терапевтических антител без использования коммерческих наборов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Объекты исследования — лекарственные средства на основе МкАТ: омализумаб, устекинумаб, канакинумаб, тоцилизумаб, натализумаб и иммуноглобулин класса G2, специфичный к рецептору PD-1. N-гликаны отщепляли от МкАТ пептид-N-гликозидазой (ПНГаза F), затем присоединяли к ним флуоресцентные метки — 2-аминобензамид (2-АВ) или 2-аминобензойную кислоту (2-АА) или InstantAB и очищали пробы от посторонних примесей. Для анализа смесей гликанов использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию гидрофильного взаимодействия с детектированием флуоресценции (HILIC-FLD) на оборудовании Alliance e2695 и Acquity Arc Bio с детектором флуоресценции FLR 2475. Гликановый профиль оценивали по содержанию функциональных групп гликанов.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В работе подобраны следующие условия пробоподготовки N-гликанов терапевтических МкАТ: инкубация с 2 мЕД ПНГазой F на 100 мкг белка в 10 мМ трис-HCl (pH 8,0) в течение 3 ч при температуре 37 °C без предварительной денатурации белка; окрашивание гликанов 2-АА в течение 1,5 ч при 65 °C; удаление избытка красителя путем экстракции ацетонитрилом. Осаждение ацетонитрилом меченых 2-АА гликанов пригодно для очистки и концентрирования проб. Применение метода HILIC-FLD позволило определять в пробах минорные гликаны с содержанием до 0,1–0,2%. Сравнение наших данных с данными, полученными при использовании коммерческого набора, указало на приемлемую сопоставимость результатов хроматографического анализа. При пробоподготовке важно учитывать структурные особенности конкретных МкАТ, например для высокосиалированных МкАТ обоснован контроль десиалирования в процессе окрашивания.

ВЫВОДЫ. Разработанный способ пробоподготовки пригоден для анализа омализумаба, канакинумаба и натализумаба. Предложенные аналитические подходы к пробоподготовке будут также полезны при разработке методики анализа гликанового профиля других гликопротеинов с использованием метода HILIC-FLD.