ВВЕДЕНИЕ. Трастузумаб — препарат на основе рекомбинантных гуманизированных моноклональных антител к HER2, показан для таргетной терапии HER2⁺ рака молочной железы. Применение трастузумаба стало рутинной практикой в лечении рака и позволяет повысить общую выживаемость пациенток. Однако в ряде случаев трастузумаб способен вызывать появление антилекарственных антител (АЛА), снижающих эффективность таргетной терапии. По этой причине своевременное выявление АЛА в сыворотке крови необходимо для возможной коррекции терапии.

ЦЕЛЬ. Разработка и валидация методики полуколичественного определения общих АЛА к трастузумабу в биологических жидкостях методом твердофазного иммуноферментного анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Тест-система представлена в виде классического ИФА-набора, в состав которого входят 96-луночный планшет с иммобилизованным на внутренней поверхности лунок трастузумабом, раствор вторичных антител (трастузумаб, конъюгированный с пероксидазой хрена), субстратный раствор (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) и стоп-раствор. Оптическую плотность определяли с помощью планшетного фотометра при длине волны 450 нм. Растворы для контроля качества готовили путем разведения моноклональных антител к трастузумабу в буферном растворе, содержащем сыворотку крови человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Наименьшая определяемая концентрация АЛА составила 2 нг/мл при 2-кратном значении показателя минимального необходимого разведения. Методика устойчива к наличию 116 нг/мл трастузумаба при уровне 16 нг/мл АЛА и 1000 нг/мл трастузумаба при уровне 100 нг/мл АЛА. Доказана специфичность, селективность и прецизионность методики внутри одной аналитической серии, а также между разными сериями. Вероятность «хук»-эффекта от избыточных концентраций АЛА исключается в диапазоне от 0,16 до 640 нг/мл. Продемонстрирована краткосрочная стабильность АЛА в образцах в течение 6 ч при комнатной температуре, долгосрочная стабильность при хранении образцов при минус 70 °С в течение 90 сут и стабильность при трех циклах замораживания до минус 70 °С (по 12 ч) и оттаивания.

 ВЫВОДЫ. Установленные параметры представленной тест-системы свидетельствуют о возможности ее применения для выявления антилекарственных антител к трастузумабу в биологических жидкостях при таргетной терапии.

ВВЕДЕНИЕ. Активный поиск пробиотических штаммов микроорганизмов, в том числе относящихся к индигенным штаммам бифидобактерий, является важной задачей при создании лечебно-профилактических пробиотических препаратов. При определении пробиотического потенциала кандидатных штаммов необходима их оценка по показателям жизнеспособности бактерий, чувствительности к антибиотикам, устойчивости к желудочному соку и желчи, лизоцимрезистентности и биопленкообразованию.

ЦЕЛЬ. Характеристика композиции индигенных штаммов Bifidobacterium bifidum ICIS-310 и Bifidobacterium longum ICIS-505 в качестве потенциального пробиотического препарата.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использованы штаммы B. bifidum ICIS-310 и B. longum ICIS-505. Оценивали чувствительность штаммов к антибиотикам, а также устойчивость к желудочному соку и желчи. Проводили исследование монокультур бифидобактерий B. bifidum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 и их композиции по количеству жизнеспособных клеток при культивировании, антилизоцимной активности (лизоцимрезистентности), биопленкообразованию. При определении антагонистической активности в качестве тест-штаммов условно-патогенных и патогенных культур использовали Candida albicans ATCC 24433, Proteus mirabilis ATCC 29906, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Shigella flexneri ATCC 12022, Klebsiella pneumoniaе ICIS-278_PBV. Содержание уксусной кислоты в среде культивирования определяли методом газожидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Отобранные по критериям численности, лизоцимрезистентности и биопленкообразования индигенные штаммы B. bifidum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 не имели генов патогенности, обладали устойчивостью к ряду антимикробных препаратов (бензилпенициллин, стрептомицин и эритромицин) и сохраняли свою жизнеспособность в присутствии желчи в течение 2 ч и желудочного сока — 30 мин. Исследуемые культуры бифидобактерий обладали биосовместимостью: в композиции штаммов через 48 ч количество микробных клеток было выше, чем в монокультурах. При совместном культивировании штаммы B. bifidum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 проявляли синергетический эффект, повышая уровень лизоцимрезистентности до 2,2±0,30 мкг/мл×ОП₄₅₀, биопленкообразования до 0,89±0,20 ед. ОП₆₃₀ и продукцию ацетата до 33,2 мМ/л. Композиция бифидобактерий обладала более выраженной антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам бактерий и грибов (зоны угнетения роста тест-культур 30–36 мм) в сравнении с монокультурами (зоны угнетения роста тест-культур 18–24 мм).

ВЫВОДЫ. Индигенные штаммы B. bifidum ICIS-310 и B. longum ICIS-505 устойчивы к антимикробным препаратам, желчи и желудочному соку. При совместном культивировании штаммов выявлен синергетический эффект в отношении усиления показателей лизоцимрезистентности, биопленкообразования и антагонистической активности. Исследованные штаммы бифидобактерий и их композиция перспективны с целью создания новых пробиотических препаратов. Оценка лизоцимрезистентности и биопленкообразования может быть рекомендована в качестве показателей адаптивного потенциала микробиоты при отборе и тестировании пробиотических штаммов.

ВВЕДЕНИЕ. Вирус Чикунгунья (ВЧИК) за последние годы широко распространился во многих частях мира, вызывая крупномасштабные вспышки с серьезными экономическими и социальными последствиями. Для повышения эффективности борьбы с вирусом необходимо разрабатывать и совершенствовать методы диагностики ВЧИК не только в сыворотке крови пациентов, но и в полевых материалах — для выявления и уничтожения очагов инфекции. Определение антигенов ВЧИК также важно проводить в образцах культуральной жидкости на разных этапах разработки и производства вакцин.

ЦЕЛЬ. Разработка количественной тест-системы на основе одностадийного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа для выявления Е2 антигена вируса Чикунгунья в культуральных жидкостях, а также методики расчета массы цельновирионного антигена в образце.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали два мышиных моноклональных антитела к ВЧИК; очищенный вирус Чикунгунья (штамм Nika21, GenBank ID PQ673601) и рекомбинантный Е2 антиген ВЧИК. Для сравнения чувствительности методов иммуноферментного анализа (ИФА) и обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-кПЦР-РВ) использовали образцы культуральной жидкости, которые собирали в разные временные точки (18, 24, 46, 72 ч) после заражения ВЧИК клеток Vero. Основные аналитические и технические характеристики разработанной ИФА тест-системы определяли в соответствии с требованиями ГОСТ 51352–2013.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Аналитическая чувствительность метода составила не менее 0,625 нг/мл, значение коэффициента вариации — не более 3,56%, тест на «открытие» — 100%, результаты теста на «линейность» в диапазоне концентраций 1,5–16 нг/мл были в пределах 90–110%. Специфичность метода составила 100%; перекрестная реактивность не наблюдалась с образцами, содержащими вирусы денге, желтой лихорадки, Синдбис, краснухи и вирус Западного Нила. Разработанная ИФА тест-система и метод ОТ-кПЦР-РВ продемонстрировали схожие результаты при определении массы цельновирионного антигена в вируссодержащей жидкости — 1,06 и 1,09 мкг/мл соответственно при использовании коэффициента пересчета.

ВЫВОДЫ. Для количественного определения E2 антигена ВЧИК в культуральных образцах была разработана простая, специфичная и чувствительная ИФА тест-система, которую также можно использовать для быстрого анализа полевых образцов. Предложен метод расчета массы цельновирионного антигена по количеству Е2 белка (ИФА) и геномным эквивалентам (ОТ-кПЦР-РВ). Между оптической плотностью в ИФА и пороговым циклом в ПЦР-РВ установлена сильная обратная корреляция.

ВВЕДЕНИЕ. Производители генотерапевтических лекарственных препаратов на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ) сталкиваются в настоящее время с рядом системных проблем, в основе которых лежат трудности в оценке качества препаратов из-за недостаточной базы научных данных, опыта и несовершенства нормативных и регуляторных требований. Риск-ориентированный подход для оценки критических показателей качества в рамках концепции «качество через дизайн» (Quality by Design, QbD) обеспечивает повышение эффективности разработки и производства высокотехнологичных лекарственных препаратов.

ЦЕЛЬ. Определение критических показателей качества и их диапазонов при разработке генотерапевтических лекарственных препаратов на основе ААВ для лечения миодистрофии Дюшенна в рамках реализации концепции «качество через дизайн» (QbD).

ОБСУЖДЕНИЕ. Проведен анализ подходов к разработке технологии производства ААВ с использованием концепции QbD. Обоснован перечень основных характеристик ААВ и доступных данных об их влиянии на пациентов с точки зрения эффективности и безопасности, в том числе иммунного ответа на лечение. Проведена оценка рисков и определен перечень критических показателей качества ААВ. В ходе разработки процесса производства ААВ определены диапазоны значений для показателей качества ААВ вектора: вирусный и инфекционный титры, наличие репликативно-компетентных AАВ, содержание пустых капсидов и остаточных примесей (белки, плазмидная ДНК и остаточная ДНК продуцента). Проведена комплексная оценка рисков при определении целевого профиля продукта — препарата на основе ААВ для лечения миодистрофии Дюшенна. Разработан перечень критических показателей качества препарата и основные требования к аналитическим методикам, а также установлены диапазоны значений параметров для контроля качества продукта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Применение концепции QbD и риск-ориентированного подхода является важным этапом в идентификации критических показателей качества при разработке генотерапевтических лекарственных препаратов. Использование методологии QbD позволяет сформировать новые регуляторные стандарты оценки безопасности и эффективности генотерапевтических препаратов, а также осуществлять их фармацевтическую разработку и промышленное производство.

ВВЕДЕНИЕ. Специфический иммуноглобулин человека получают из плазмы крови иммунизированных доноров и применяют для иммунопрофилактики вирусного гепатита В. Основная проблема при контроле качества таких препаратов и оценке их профилактической эффективности связана с отсутствием стандартных образцов, аттестованных по содержанию антител к поверхностному антигену вируса гепатита В. Систематизация и анализ существующего лабораторного и производственного опыта в данной области нужны для выработки новых подходов к стандартизации препаратов иммуноглобулина человека против гепатита В.

ЦЕЛЬ. Охарактеризовать лекарственные препараты иммуноглобулина человека против гепатита В и рассмотреть подходы к их стандартизации.

ОБСУЖДЕНИЕ. Большая часть препаратов иммуноглобулина человека против гепатита В разработана в Германии (27%), Италии (17%) и США (17%). Из всех препаратов 67% выпускается в лекарственной форме для внутримышечного введения, 30% — для внутривенного введения, 3% — для подкожного введения. Специфическая активность указанных лекарственных средств варьирует от 50 до 500 МЕ/мл. В России зарегистрировано три наименования препарата, содержащего специфический иммуноглобулин человека. Количество вводимых в гражданский оборот лекарственных средств не в полной мере покрывает потребности лечебно-профилактических учреждений. Эффективность иммунопрофилактики напрямую зависит от дозы препарата, которую рассчитывают исходя из специфической активности. Для обеспечения точности определения указанного показателя качества следует использовать стандартный образец содержания антител к поверхностному антигену вируса гепатита В, аттестованный в международных единицах. Существующий международный стандарт специфического иммуноглобулина человека ограниченно доступен для приобретения на территории Российской Федерации, а национальный (фармакопейный) стандартный образец отсутствует.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Анализ данных о выпускаемых препаратах иммуноглобулина человека против гепатита В позволил выявить современные направления развития данной сферы фарминдустрии. Разработка и применение национального (фармакопейного) стандартного образца содержания антител к поверхностному антигену вируса гепатита В будет способствовать повышению качества продукции и эффективности иммунопрофилактики.