ВВЕДЕНИЕ. При создании биотехнологических лекарственных препаратов ключевое значение имеет разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков. Отработка протоколов селекции и подходов для эффективного скрининга линий-продуцентов целевых белков — необходимый этап разработки технологии производства рекомбинантных белков с высоким выходом целевого продукта.

ЦЕЛЬ. Получение высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного белка деносумаба на основе суспензионной клеточной линии СНО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовалась суспензионная клеточная линия СНО-К1. Для культивирования применялись среды и подпитки без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Клетки линии СНО трансфицировали плазмидами, содержащими гены легкой и тяжелой цепей деносумаба, с использованием метода электропорации с помощью системы MaxCyte STX. Селекцию трансфицированных клеток проводили с добавлением антибиотиков (гигромицин, генетицин). Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы ClonePix FL. Проводили периодическое культивирование с добавлением подпитки и определение концентрации деносумаба методом иммуноферментного анализа (ИФА) в культуральной жидкости для выявления лидерных моноклональных клеточных линий.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Оптимальная концентрация антибиотиков для селекции клеточных линий-продуцентов на основе клеток СНО составила 600 мг/л гигромицина и 600 мг/л генетицина. После проведения трансфекции из 1920 минипулов селекцию прошел 1041 (около 54%). Отбор минипулов-продуцентов деносумаба проводили путем скрининга проб культуральной жидкости с использованием ИФА из 96-, 24- и 6-луночных планшетов. Отобранные 23 лидерных минипула были адаптированы к условиям шейкерного культивирования. С учетом показателей ростовых и продукционных характеристик минипулов определен лидерный минипул (mp-19) с продуктивностью 1,92 г/л (на 7 сут периодического культивирования). На основе mp-19 получены моноклональные клеточные линии-продуценты деносумаба с продуктивностью до 6,5 г/л на 9 сут культивирования с подпиткой.

ВЫВОДЫ. Получены высокопродуктивные моноклональные клеточные линии-продуценты деносумаба. Предложенный подход к созданию клеток-продуцентов может быть применен для получения различных рекомбинантных белков, включая моноклональные антитела, ферменты, факторы свертывания крови.

ВВЕДЕНИЕ. В ряде случаев лечение ромиплостимом пациентов с идиопатической тромбоцитопенической пурпурой сопряжено с образованием антилекарственных антител (АЛА),

что часто приводит к развитию серьезных неблагоприятных явлений. Для определения связывающих (общих) АЛА (оАЛА) к ромиплостиму в сыворотке крови человека предлагается методика, основанная на биослойной интерферометрии. С технической точки зрения использующие данный принцип приборы имеют некоторые преимущества (высокая пропускная способность, увеличенные межсервисные интервалы, низкий уровень контаминации оборудования при анализе биообразцов) перед приборами на основе поверхностного плазмонного резонанса, которые применяются для мониторинга оАЛА при проведении клинических исследований оригинального препарата. Для обеспечения воспроизводимости измерений и стандартизации лабораторного этапа клинических исследований иммуногенности биоаналогичного препарата необходима валидация методики.

ЦЕЛЬ. Установить ключевые валидационные характеристики методики, основанной на биослойной интерферометрии, для определения общих антилекарственных антител к ромиплостиму в сыворотке крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Принцип метода заключается в детектировании специфического взаимодействия связывающих антител, содержащихся в исследуемых образцах, с иммобилизованным на поверхности стрептавидиновых биосенсоров биотинилированным ромиплостимом. Методика состоит из этапа скрининг-теста, в котором определяется наличие или отсутствие оАЛА в образцах; подтверждающего теста для проверки специфичности связывания оАЛА с ромиплостимом; этапа определения титра антител, то есть предельного разведения, при котором оАЛА могут быть обнаружены в образцах. В работе использовались положительные контрольные образцы, содержащие различные концентрации поликлональных кроличьих антител к ромиплостиму. Детектирование белкового комплексообразования проводилось в режиме реального времени с использованием интерферометра Octet® QKe.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Значения фактора биологической вариабельности и предельного значения незначимого ингибирования составили 1,481 и 34,2% соответственно. Подтверждены прецизионность и специфичность методики. Нижний предел детекции оАЛА в отсутствии ромиплостима составил 622 нг/мл. При оценке эффекта матрицы в скрининг-тесте аналитический сигнал 8 из 10 образцов сыворотки крови после добавления оАЛА увеличился более чем в 1,481 раза; в подтверждающем тесте значение показателя «процент ингибирования» превышало 34,2% при анализе 8 из 10 образцов с добавлением оАЛА. Эффект высокой дозы оАЛА в концентрации от 0,8 до 50 мкг/мл отсутствовал.

Результаты определения оАЛА в скрининг-тесте были устойчивы к присутствию 1 нг/мл ромиплостима в образцах. Стрептавидиновые биосенсоры с иммобилизованным ромиплостимом сохраняли стабильность после 14 сут хранения при температуре 5±3 °С и не менее 20 циклов регенерации.

ВЫВОДЫ. Анализ полученных результатов валидации подтвердил пригодность методики на основе биослойной интерферометрии для достоверного и воспроизводимого определения связывающих (общих) антител к ромиплостиму в сыворотке крови человека.

ВВЕДЕНИЕ. Афлиберцепт применяется для лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации, приводящей к потере зрения. К числу существенных побочных эффектов афлиберцепта относится его иммуногенность, проявляющаяся в виде выработки антилекарственных антител (АЛА). В рамках оценки иммуногенности препарата актуальной представляется разработка методики определения АЛА к афлиберцепту.

ЦЕЛЬ. Разработка и валидация аналитической методики для иммуноферментного обнаружения и поэтапной характеристики общих антилекарственных антител к афлиберцепту в сыворотке крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Разработку методики проводили с применением метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали афлиберцепт (GNR-098, АО «ГЕНЕРИУМ», Россия) и конъюгат GNR-098 с пероксидазой хрена. Поликлональные антитела к GNR-098 получали путем иммунизации крыс, последующего отбора сыворотки крови и выделения из нее антител при помощи метода аффинной хроматографии. Обнаружение АЛА осуществляли с использованием меченого GNR-098 при постановке мостикового ИФА. Модельные образцы готовили, используя пулированные сыворотки здоровых доноров с добавлением крысиных поликлональных антител. Валидацию методики проводили по следующим параметрам: пределы исключения методик; прецизионность; предел обнаружения; устойчивость к присутствию в образцах растворимой мишени терапевтического белка; специфичность; эффект матрицы; минимальное необходимое разведение; стабильность; устойчивость к замене ключевого компонента; эффект сверхдозы (хук-эффект).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Аналитическая методика включала скрининг-тест для определения возможного наличия АЛА, подтверждающий тест — для установления специфичности обнаруженных АЛА, тест для определения титра АЛА и их принадлежности к классу IgE. Пределы исключения методик для скрининг-теста и для теста определения АЛА класса IgE составили 1,3 и 1,2 соответственно; для подтверждающего теста — 15,2%. Предел обнаружения скрининг-теста составил 185 нг/мл. Продемонстрирована устойчивость методики к присутствию в образцах до 2000 пг/мл растворимой мишени терапевтического белка (hrVEGF₁₆₅). Отсутствие эффекта матрицы установлено в скрининг-тесте и подтверждающем тесте 13 испытуемых образцов, содержащих АЛА в концентрации 280 нг/мл. Эффект сверхдозы не был установлен в скрининг-тесте и подтверждающем тесте образцов, содержащих АЛА в концентрации, пятикратно превышающей высокоположительный образец.

ВЫВОДЫ. Разработана комплексная аналитическая методика для иммуноферментного обнаружения и поэтапной характеристики общих антилекарственных антител к афлиберцепту (препарат GNR-098) в сыворотке крови человека. Пригодность методики к применению подтверждена в ходе валидации. Разработанная аналитическая система позволит провести оценку иммуногенности афлиберцепта.