ВВЕДЕНИЕ. Существующие вакцины против лихорадки Эбола обладают высокой реактогенностью, что обусловливает необходимость разработки более безопасных и эффективных препаратов. Решением проблемы является применение новых рекомбинантных векторных вакцин, таких как Ad26.ZEBOV (вакцина на основе нереплицирующегося аденовируса человека серотипа 26 со встроенным геном гликопротеина штамма Zaire ebolavirus), MVA-BN-Filo (вакцина на основе модифицированного вируса осповакцины штамма Ankara), изучаемых в клинических исследованиях для подтверждения их эффективности и безопасности.

ЦЕЛЬ. Систематизация данных клинических исследований по оценке эффективности, безопасности и иммуногенности двухкомпонентной рекомбинантной векторной вакцины Ad26.ZEBOV, MVA-BN-Filo для профилактики лихорадки Эбола у различных групп населения.

ОБСУЖДЕНИЕ. Анализ литературных источников проводили в базах данных PubMed, ScienceDirect и eLIBRARY.RU за период 2009–2024 гг. Результаты клинических исследований I–III фаз подтвердили, что двухкомпонентная схема вакцинации против лихорадки Эбола (Ad26.ZEBOV, MVA-BN-Filo) обеспечивает выраженный и стойкий иммунный ответ. Сероконверсия достигала 87–95% через 3 нед. после введения первой дозы и до 100% после ревакцинации, при этом иммунитет сохранялся не менее года. Нежелательные явления (местные и системные в легкой или средней степени выраженности) наблюдались примерно у половины участников; серьезные нежелательные явления не были связаны с вакцинацией и встречались менее чем у 1% вакцинированных. У беременных женщин вакцинация не увеличивала риск неблагоприятных исходов и обеспечивала передачу антител плоду. У детей и подростков сероконверсия превышала 90%, а ревакцинация значительно усиливала иммунный ответ. У ВИЧ-инфицированных сероконверсия достигала 80–85%, что сопоставимо с общей популяцией. Малярия и гельминтозы не снижали эффективность иммунизации. На основании полученных данных Всемирная организация здравоохранения и Европейское агентство по лекарственным средствам в 2020 г. одобрили данную схему вакцинации для применения у взрослых и детей старше одного года, включая пациентов с сопутствующими инфекциями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Двухкомпонентная вакцина Ad26.ZEBOV, MVA-BN-Filo характеризуется высокой иммуногенностью и благоприятным профилем безопасности. Схема первичной вакцинации и ревакцинации эффективна для взрослых, детей старше одного года, беременных женщин и лиц с сопутствующими инфекциями, включая ВИЧ, малярию и гельминтозы. Применение вакцины  позволяет  снизить  риск  распространения  лихорадки  Эбола и может служить основой для стратегии массовой иммунизации в эндемичных регионах и при вспышках заболевания.

ВВЕДЕНИЕ. Лекарственные препараты (ЛП) на основе плазмы крови человека применяют при лечении ряда системных заболеваний, иммунодефицитных и жизнеугрожающих состояниях. Рост   потребления   таких   ЛП   предопределяет   масштабирование   производств и обеспечение стабильных поставок плазмы крови, качество которой должно соответствовать международным стандартам.

ЦЕЛЬ. Систематизация и анализ национальных и международных фармакопейных требований к качеству плазмы крови человека, в том числе используемой для производства ЛП, в рамках гармонизации национальных требований с мировыми стандартами качества и разработка проектов фармакопейных статей.

ОБСУЖДЕНИЕ. Анализ нормативных правовых документов и научной литературы показал, что в различных странах частоты донаций плазмы крови в расчете на донора составляют от 24 до 104 раз в год, а допустимые объемы донаций — от 650 до 850 мл. Двухэтапная система отбора доноров по результатам двух последовательных лабораторных исследований обеспечивает высокий уровень вирусной безопасности ЛП, что соответствует требованиям международных стандартов, в том числе стандартов PPTA. В Российской Федерации установленный срок обязательной карантинизации плазмы крови человека составляет 120 сут. В США производители плазмы добровольно внедрили протокол карантинного хранения плазмы в течение 60 сут для дальнейшего производства. Во Франции сроки карантинизации плазмы также составляет 2 мес. Анализ контроля и обеспечения вирусной безопасности индивидуальных донаций, минипула и производственного пула плазмы для фракционирования (ПДФ) на вирусные маркеры в национальных и региональных стандартах качества выявил различные подходы к стандартизации. В Европейской и Индийской фармакопеях предусмотрены испытания индивидуальных донаций плазмы на наличие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирусу гепатита С (ВГС) и поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Свод законов США устанавливает испытания индивидуальных донаций плазмы на наличие HBsAg, антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВГС и нуклеиновых кислот ВИЧ и ВГС. В Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ) предусмотрено проведение испытаний каждой индивидуальной донации плазмы на наличие HBsAg, антител к ВГС, антигена р24 ВИЧ-1, антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и возбудителю сифилиса. В рамках гармонизации ГФ РФ с монографиями зарубежных фармакопей установлены требования к качеству плазмы крови человека, в том числе используемой для производства ЛП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Результаты сравнительного анализа национальных и международных требований к качеству ПДФ и вирусинактивированной плазмы крови человека указали на необходимость создания современных подходов к стандартизации и контролю качества. Подготовлены проекты фармакопейных статей «Плазма человека для фракционирования» и «Плазма человека вирусинактивированная».

ВВЕДЕНИЕ. Вирус Чикунгунья (ВЧИК) представляет серьезную проблему для общественного здравоохранения в эндемичных регионах вследствие отсутствия специфических профилактических мер и эффективной противовирусной терапии. Идентификация и характеристика вирусных эпитопов играют ключевую роль в разработке вакцин нового поколения.

ЦЕЛЬ. Исследование Т-клеточных иммунных ответов к ВЧИК у серонегативных доноров и идентификация В-клеточных эпитопов у серопозитивных лиц и на модели ВЧИК-инфекции у мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Образцы периферической венозной крови 34 здоровых добровольцев, сыворотки крови 4 серопозитивных лиц и мышей линии BALB/c, иммунизированных нелетальным штаммом ВЧИК, были проанализированы для оценки Ти В-клеточных иммунных ответов. Пять синтетических пептидов длиной 21–29 аминокислотных  остатков, соответствующих участкам белков nsP2, nsP3, nsP4 и E2 ВЧИК, были отобраны с использованием алгоритма прогнозирования иммуногенности базы данных Immune Epitope Database и далее синтезированы с включением фланкирующих аминокислотных остатков, охватывающих предсказанные эпитопы. Мононуклеарные клетки периферической крови доноров, не подвергавшихся воздействию вируса, стимулировали пептидами в концентрации 1,2 мкг/мл, после чего пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток оценивали методом проточной цитометрии с использованием красителя — сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE). Пептид-специфические иммуноглобулины G в сыворотке крови человека и мышей определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Локализацию эпитопов визуализировали на 3D-моделях белков с использованием программы UCSF ChimeraX и веб-сервера I-TASSER.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Анализ пролиферации Т-клеток с использованием CFSE выявил  наличие CD4+, но не CD8+ Т-клеточных иммунных ответов к пептидам структурного E2 и неструктурных nsP2–4 и белков ВЧИК у серонегативных доноров (P<0,05; P<0,01). ИФА показал, что в образцах сыворотки крови ВЧИК-серопозитивных доноров и мышей, инфицированных ВЧИК, были идентифицированы линейные В-клеточные эпитопы, соответствующие участкам nsP3, nsP4 и E2 белков. Данные эпитопы были картированы на трехмерные модели белков ВЧИК: E2 — аминокислотные остатки в положениях 3140–3161, nsP3 — 1801– 1823 и nsP4 — 2207–2256.

ВЫВОДЫ. Анализ результатов исследования позволяет сделать заключение о наличии CD4+ Т-клеточных иммунных ответов у лиц, не подвергавшихся воздействию вирусных антигенов, и подчеркивает важность экспериментальной верификации эпитопов, предсказанных in silico, для совершенствования серологической диагностики и разработки вакцин против ВЧИК.

ВВЕДЕНИЕ. Пассивная иммунотерапия с использованием антител широкого спектра действия является перспективным направлением разработки новых лекарственных средств для борьбы с гриппом. Однако технологии получения, очистки и хранения рекомбинантных антител, пригодных для клинического применения, по-прежнему сопряжены со значительными трудностями. scFv-фрагменты антител (одноцепочечные вариабельные фрагменты) являются более простой, надежной и гибкой альтернативой полноразмерным аналогам антител.

ЦЕЛЬ. Разработка экспрессионных конструкций для синтеза scFv-фрагментов рекомбинантных антител к вирусу гриппа А и В, получение белковых препаратов scFv и оценка их функциональной активности in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Экспрессионные конструкции, кодирующие scFv-фрагменты антител, получали методом ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров и методами генной инженерии. Построение 3D-моделей разработанных scFv-фрагментов проводили по первичной аминокислотной последовательности на сервере AlfaFold. Наработку антител проводили в клеточной линии HEK293 в ходе транзиентной экспрессии. Препараты антител очищали из культуральной жидкости методом металл-аффинной хроматографии. Иммуноферментный анализ (ИФА) использовали для изучения вирус-специфической активности антител. Вируснейтрализующую активность антител изучали на монослойной культуре клеток MDCK по цитопатическому действию и регистрировали в реакции гемагглютинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ. На основе рекомбинантных антител, специфичных к вирусу гриппа А и В, был осуществлен дизайн и предсказана пространственная структура scFv-фрагментов, получены три генетические конструкции для экспрессии белков scFv в культуре эукариотических клеток. scFv-фрагменты были наработаны и очищены методом аффинной хроматографии с никелевым сорбентом в количестве не менее 0,5 мг и концентрации около 1 мг/мл каждого. Методом электрофореза белков в полиакриламидном геле было подтверждено соответствие выделенных scFv-фрагментов ожидаемому значению молекулярной массы — около 28 кДа. Методом ИФА было показано специфическое связывание scFv-фрагментов с различными штаммами вируса гриппа А и B. Установлено, что 50% вируснейтрализующая доза scFv-фрагмента антитела к поверхностному гемагглютинину вируса гриппа (170 нг/мл) сопоставима с нейтрализующей дозой для исходного полноразмерного антитела (179 нг/мл).

ВЫВОДЫ. Разработан дизайн и получены scFv-фрагменты двух антител, одного — обладающего широкой нейтрализующей активностью против вируса гриппа A, другого — специфичностью в отношении вируса гриппа В. Благодаря малым размерам scFv-фрагменты могут эффективно проникать через слизистые оболочки при интраназальном введении. Указанное свойство определяет потенциал использования scFv-фрагментов в экстренной профилактике и ранней терапии ОРВИ. Перспективным направлением для усиления нейтрализующей активности является создание биспецифических scFv-фрагментов, способных одновременно нацеливаться на два вирусных эпитопа.

ВВЕДЕНИЕ. Распространение устойчивых к антибиотикам микобактерий создает потребность в новых терапевтических подходах лечения туберкулеза, одним из которых является фаготерапия. Использование липосомальных форм микобактериофагов рассматривается как способ повышения их эффективности, однако для дальнейшего применения таких препаратов необходима комплексная оценка их стабильности.

ЦЕЛЬ. Оценить долгосрочную (6 мес.) стабильность липосомальной формы микобактериофага D29 в условиях хранения при 4 °C по комплексу физико-химических и функциональных показателей для обоснования ее дальнейшего доклинического изучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Стабильность липосомальной формы микобактериофага D29 оценивали в условиях хранения в течение 6 мес. при температуре 4 °C. Отбор проб проводили в следующие временные точки: 0; 1,5; 3; 4,5 и 6 мес. Степень инкапсуляции (%) фага определяли методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Поверхностный заряд (дзета-потенциал) измеряли методом электрофоретического рассеяния света (доплеровской электрофоретической подвижности). Морфологию липосом анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Функциональную активность оценивали по литической активности методом титрования по Грациа с использованием Mycobacterium smegmatis mc² 155.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Продемонстрирована высокая стабильность липосомальной формы фага D29. Литическая активность сохранялась на уровне ~10⁹ БОЕ/мл в течение сроках ранения (6 мес., 4 °C). Степень инкапсуляции снизилась незначительно и составила >88% от исходного значения. Постоянство значения дзета-потенциала (от –6,1±0,3 до –8,2±0,5 мВ) указывает на коллоидную стабильность суспензии без агрегации частиц в течение срока хранения.

ВЫВОДЫ. Установлена высокая физико-химическая и функциональная стабильность липосомальной формы микобактериофага D29 при длительном хранении (6 мес., 4 °C) с сохранением литической активности и высокой степени инкапсуляции. Полученные результаты обосновывают перспективность дальнейшего доклинического и клинического изучения разработанной липосомальной формы для терапии микобактериальных инфекций.

ВВЕДЕНИЕ. Высокая вариабельность генома РНК-содержащего вируса кори создает риск накопления мутаций в местах посадки (комплементарного связывания) праймеров, что может повлиять на надежность результатов молекулярной диагностики кори. В настоящей работе проведена оценка влияния таких мутаций на эффективность двух молекулярно-генетических методов — ПЦР и метода петлевой изотермической амплификации (LAMP).

ЦЕЛЬ. Оценить частоту встречаемости мутаций в местах связывания праймеров и их влияние на эффективность методов ПЦР и LAMP в выявлении РНК вируса кори.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали нуклеотидные последовательности   вируса   кори из базы данных NCBI и клинические образцы носоглоточного секрета, предоставленные АО «ЛабКвест» (Москва, Россия). Экстракцию РНК вируса кори проводили с использованием набора реагентов «АмплиТест РИБО-преп». Амплификацию выполняли с использованием наборов реагентов «АмплиТест Корь» и методики LAMP. Биоинформатический анализ проводили с использованием программ MAFFT, Jalview 2.1, CD-HIT, MEGA12 и FigTree v.1.4.3.

РЕЗУЛЬТАТЫ. При анализе 1080 нуклеотидных последовательностей вируса кори было обнаружено не более одной замены в областях праймеров и зонда, используемых в ПЦР. Анализ последовательностей в местах посадки праймеров, используемых в LAMP, показал бóльшую вариабельность по сравнению с методом ПЦР, но и в этом случае 96,5% последовательностей содержало не более одной мутации в месте посадки каждого праймера. В 15 из 69 клинических образцов была выявлена только одна мутация в области посадки прямого праймера, которая незначительно влияла на эффективность ПЦР при низких концентрациях вируса. Для метода LAMP в 18 образцах было обнаружено три мутации в целевых последовательностях для праймеров F3, B1c и В2. В модельных экспериментах показано, что мисмэтч (несовпадение) во внешнем праймере F3 не влияет на скорость и чувствительность реакции, в то время как для петлевого праймера BIP была показана аномально высокая эффективность амплификации при наличии двух мутаций в РНК-последовательностях, что может косвенно свидетельствовать о наличии конформационных особенностей длинных петлевых праймеров.

ВЫВОДЫ. Оба метода — ПЦР и LAMP — эффективно выявляют РНК вируса кори даже при наличии мутаций в области посадки праймеров. Однако метод LAMP требует дальнейшего изучения для широкого внедрения в диагностику кори.

ВВЕДЕНИЕ. Филграстим представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека, изготовленный по технологии рекомбинантных ДНК. Поскольку при производственном контроле качества филграстима должна применяться валидированная методика, первостепенное значение имеет установление ее валидационных характеристик методики в полном объеме, а при замене критичных реагентов/материалов/параметров — подтверждение ранее установленных.

ЦЕЛЬ. Выбор параметров и подтверждение ряда валидационных характеристик методики оценки специфической активности филграстима биологическим методом in vitro при использовании клеточной линии NFS-60.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Специфическую активность филграстима оценивали по интенсивности флуоресценции красителя аlamarBlue™ при длинах волн возбуждения (530 нм) и эмиссии (620 нм), прямо пропорциональной уровню пролиферации клеток линии NFS-60 под действием филграстима в дозах от 0,1 до 208 МЕ/мл. Полученные данные анализировали в программе PLA 2.0.0 методом параллельных линий с использованием 4-параметрической логистической функции 4PL.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Методика охарактеризована как прецизионная: значение коэффициента вариации (CV) при изучении повторяемости и внутрилабораторной прецизионности составляет 6,20 и 1,19% соответственно (критерий приемлемости CV≤25%). Методика линейна — коэффициент детерминации (R2) линейной функции составляет 0,99 при значении   критерия   приемлемости   R2≥0,95.   Значение   степени   извлечения   составляет   101,6% и не превышает отклонения ±10% от ожидаемого значения. Методика устойчива к увеличению плотности клеточной суспензии с 1,5×105 до 3,0×105 клеток/мл (CV=0,07%) и увеличению продолжительности инкубации образцов филграстима с клеточной суспензией с 48 до 72 ч (CV=4,2%) или с флуоресцентным красителем с 4 до 6 ч (CV=2,05%).

ВЫВОДЫ. Методика оценки специфической активности препаратов на основе филграстима   в   условиях   in   vitro   при   использовании   клеток   линии   NFS-60   характеризуется линейностью, прецизионностью и   правильностью;   показана   устойчивость   методики при контролируемом изменении ряда параметров. Исследование подтверждает пригодность использования клеток линии NFS-60 при оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима. Это имеет важное значение для производителей с точки зрения расширения спектра клеточных линий, применяемых при оценке качества препаратов.

ВВЕДЕНИЕ. Выявление микоплазм является одной из наиболее сложных проблем при контроле микробной контаминации биологических лекарственных препаратов (БЛП). Для обнаружения микоплазм в БЛП и стандартизации микробиологического метода контроля необходимы высокочувствительные питательные среды и фармакопейные стандартные образцы (ФСО) тест-штаммов различных видов микоплазм.

ЦЕЛЬ. Разработка и аттестация нового фармакопейного стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8 для проведения испытаний биологических лекарственных препаратов на присутствие микоплазм микробиологическим методом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Разработку ФСО проводили согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) с использованием штамма A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116), питательной среды Каган, сыворотки крови лошади. Аттестация ФСО включала определение значения титра штамма A. laidlawii PG8 методом наиболее вероятных чисел и испытания по следующим показателям качества: «Описание», «Наличие вакуума», «Время растворения», «Внешний вид растворенного образца», «Стерильность», «Потеря в массе при высушивании», «Однородность массы (средняя масса и отклонение от средней массы)».

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведена разработка ФСО A. laidlawii PG8 и составлена спецификация ФСО. Приготовлены лиофилизированные образцы основного и рабочего банков культуры A. laidlawii PG8. Установлено, что процедура лиофилизации не оказывает существенного воздействия на жизнеспособность штамма. Показана стабильность значений титра штамма (10⁸ КОЕ/мл), культуральных и физико-химических свойств образцов по критически важным для обеспечения качества и надежности показателям в течение двух лет хранения при температуре минус 20–30°С. Аттестованы три серии ФСО A. laidlawii PG8. Значения титра серий ФСО варьировались от 10×10⁸ до 21×10⁸ КОЕ/мл. Показана сопоставимость разработанного ФСО со стандартным образцом Европейской фармакопеи BRP A. laidlawii, серия 1 (титр 2,45×10⁶ КОЕ/мл). На основании результатов исследований ФСО A. laidlawii PG8 включен в Реестр ФСО ГФ РФ.

ВЫВОДЫ. Разработан и аттестован новый ФСО A. laidlawii PG8. ФСО может быть использован для оценки ростовых свойств питательных сред, определения наличия ингибирующего действия, а также в качестве положительного контроля при испытаниях БЛП и биологических материалов, применяемых в их производстве, на присутствие микоплазм микробиологическим методом согласно требованиям ГФ РФ. Внедрение ФСО будет способствовать стандартизации и повышению качества контроля БЛП, а также гармонизации требований ГФ РФ с международными стандартами.

ВВЕДЕНИЕ. Создание новых эффективных препаратов на основе гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) остается актуальной задачей, поскольку изучение биологических эффектов препарата открывает новые перспективы его клинического применения для лечения множества заболеваний – от онкологических и гематологических до нейродегенеративных. В связи с разработкой нового лиофилизированного препарата рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ (рчГМ-КСФ) на основе штамма-продуцента Esсherichia coli BL21/pET-GST-6His-GM необходима оценка его специфической активности и токсичности.

ЦЕЛЬ. Изучение специфической пролиферативной (in vitro) и гемопоэзстимулирующей (in vivo) активности, а также острой и субхронической токсичности нового лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ для подкожного введения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали лиофилизированный рчГМ-КСФ (штамм E. coli BL21/pET-GST-6His-GM) производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Россия). Пролиферативную активность определяли на культуре клеток эритролейкемии человека TF-1 в ХТТ-тесте. Гемопоэзстимулирующую активность оценивали на мышах линии СВА/Calaс (самцы, возраст 2,0–2,5 мес.) с моделью миелосупрессии, индуцированной циклофосфамидом (200 мг/кг, внутрибрюшинно). Препарат рчГМ-КСФ вводили животным подкожно в дозе 90 мкг/кг в течение 4 сут. На 5 сут анализировали лейкограмму. Острую токсичность препарата оценивали при однократном подкожном введении самцам и самкам мышей линии ICR (500 и 1000 мкг/кг), субхроническую – при четырехкратном введении (90 мкг/кг). Через 1 и 7 сут оценивали массу и температуру тела, общий и биохимический анализы крови, проводили макро- и микроскопические исследования внутренних органов, включая сердце, легкое, печень, почки и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Препарат рчГМ-КСФ проявлял выраженную пролиферативную активность на клетках TF-1 (ЕD₅₀=0,48 нг/мл). На мышах с миелосупрессией препарат приводил к увеличению числа сегментоядерных нейтрофилов в 2,1 раза относительно контроля. Однократное и многократное введение препарата рчГМ-КСФ не вызывало гибель животных, не влияло на массу и температуру тела, а также не приводило к значимым изменениям гематологических, биохимических показателей, макро- и микроскопической структуры органов.

ВЫВОДЫ. Новый лиофилизированный препарат рчГМ-КСФ продемонстрировал высокую пролиферативную и гемопоэзстимулирующую активность, а также отсутствие выраженной острой и субхронической токсичности. Полученные результаты обосновывают перспективность дальнейшей фармацевтической разработки данного препарата в качестве эффективного и безопасного гемопоэзстимулирующего средства.