ВВЕДЕНИЕ. В мире насчитывается от 6000 до 8000 описанных редких (орфанных) заболеваний (ОЗ), из которых около 80% имеют генетическую природу и часто являются жизнеугрожающими. Исторически разработка лекарственных средств (ЛС) для лечения ОЗ была затруднена из-за отсутствия экономических стимулов. За последние 10 лет в России наблюдается активный рост числа одобренных новых ЛС для ОЗ.

ЦЕЛЬ. Проследить историю подходов к лечению наиболее распространенных моногенных орфанных заболеваний и провести анализ проблемных аспектов разработки орфанных препаратов и внедрения их в медицинскую практику.

ОБСУЖДЕНИЕ. Исторические примеры ОЗ иллюстрируют как медленный прогресс терапии от симптоматической до патогенетической (муковисцидоз), так и взрывной рост патогенетических ЛС разных типов действующих субстанций и механизмов действия там, где до этого не было никакой эффективной терапии (спинальная мышечная атрофия). Показан путь от симптоматического лечения и первых заместительных подходов до современных патогенетических и этиотропных стратегий лечения ОЗ, включая рекомбинантные белки, малые молекулы (потенциаторы и корректоры), олигонуклеотидные препараты, ферментозаместительную терапию и генную терапию на основе аденоассоциированных вирусных векторов. Особое внимание уделено подходам по преодолению таких барьеров, как вирусная безопасность, доставка препаратов через гематоэнцефалический барьер («троянские кони»), и проблемам коммерциализации генной терапии. Рассмотрены современные регуляторные механизмы и меры поддержки разработки орфанных ЛС в России, странах ЕАЭС и мире. Предлагаются пути гармонизации регуляторных требований для повышения доступности терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Опыт последних десятилетий свидетельствует о трансформации подхода к ОЗ, которые перестали быть «безнадежными» и перешли в область наиболее интенсивного развития биомедицинских технологий. Дальнейший прогресс будет связан не только с созданием новых методов генной и клеточной терапии, но и с выстраиванием эффективных регуляторных, экономических и социальных механизмов, которые обеспечат равный доступ пациентов к терапии.

ВВЕДЕНИЕ. Отсутствие единых регуляторных требований к доклиническим исследованиям (ДКИ) педиатрических орфанных генотерапевтических лекарственных препаратов (ГТЛП) затрудняет их разработку и регистрацию. В обзоре систематизированы основные особенности ДКИ таких препаратов и проанализирован успешный опыт двух зарегистрированных ГТЛП для обоснования подходов к ускорению вывода новых препаратов на рынок.

ЦЕЛЬ. Критический анализ мирового опыта доклинической разработки ГТЛП для выявления ключевых проблем ДКИ и оптимизации дизайна исследований педиатрических орфанных ГТЛП для ускорения их перехода в клиническую практику.

ОБСУЖДЕНИЕ. Анализ литературных источников проводили в базах PubMed, Embase, Google Scholar, eLIBRARY.RU, cyberleninka.ru, а также на сайтах ведущих регуляторных органов за период 2020–2026 гг. В мире зарегистрировано около 20 ГТЛП, включая три препарата в Российской Федерации. Установлено, что дизайн ДКИ педиатрических орфанных ГТЛП базируется на принципе весомости доказательств и требует индивидуального подхода. Ключевыми элементами программы доклинической разработки являются исследования биораспределения вектора и трансгена, оценка экспрессии трансгена в целевых и нецелевых тканях, а также изучение выделения (шеддинга) вектора. Решающим фактором разработки выступает валидация модели на животных по клинически значимым конечным точкам. На примере препарата Элевидис для лечения мышечной дистрофии Дюшенна продемонстрирована важность оценки функциональных исходов (двигательная активность) и коррекции гистологических изменений (уменьшение некроза мышечной ткани), а на примере препарата Золгенсма для лечения спинальной мышечной атрофии — значимость снижения летальности как основной конечной точки. Выявлено, что оценка безопасности ГТЛП сопряжена с необходимостью анализа неопределенностей (долгосрочные риски, иммуногенность), которые регуляторные органы признают допустимыми в условиях отсутствия альтернативной терапии. Полученные данные подтверждают необходимость раннего взаимодействия разработчиков с регуляторными органами для оптимизации программ ДКИ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Систематизированы особенности доклинической разработки педиатрических орфанных ГТЛП, ключевыми из которых являются гибкость дизайна на основе принципов весомости доказательств, проведение исследования биораспределения трансгена и самого вектора, приоритет функциональных конечных точек, тщательная валидация модели на животных и раннее взаимодействие с регуляторными органами. Практическая значимость работы заключается в обосновании подхода, позволяющего разработчикам оптимизировать программы ДКИ, а экспертам регуляторных органов — гармонизировать оценку эффективности и безопасности, что ускорит выход жизненно важных препаратов в клиническую практику для педиатрических пациентов с орфанными заболеваниями.

ВВЕДЕНИЕ. Несмотря на широкое использование в генотерапевтических препаратах на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) искусственных промоторов, основанных на промоторе β-актина курицы (обозначаемых как CAG, CBA или CB), данные об активности таких промоторов в разных тканях и возрастной динамике остаются ограниченными. В настоящей работе проведена количественная оценка активности CAG-промотора в различных органах мышей в постнатальном периоде для определения его применимости при разработке rAAV-опосредованной терапии.

ЦЕЛЬ. Оценка относительной активности CAG-промотора и ее динамики в органах мышей в возрасте 3–12 недель.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 2-дневным мышам линии ICR (CD-1) однократно вводили rAAV9 с кассетой для экспрессии SMN под контролем CAG-промотора. На 3, 6 и 12-й нед. после инъекции из образцов органов (головной мозг, спинной мозг, печень, легкие, сердце, четырехглавая мышца бедра) выделяли тотальную ДНК и РНК. Содержание вирусных геномов rAAV и мРНК SMN в препаратах нуклеиновых кислот определяли методом количественной ПЦР. Относительную активность промотора рассчитывали как отношение концентрации мРНК SMN к концентрации вирусных геномов (rAAV), нормализованное на соотношение РНК:ДНК в органе. Для анализа данных вычисляли среднее геометрическое и использовали регрессионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Активность CAG-промотора значительно варьировала в разных органах. На 3 нед. после инъекции наибольшие значения активности отмечены в четырехглавой мышце бедра, в 4,7–9,7 раза превышающие таковые в других органах. Также обнаружено, что в головном мозге и легких с 3 по 12 нед. после инъекции активность промотора снижалась в 4,7 раза (p=0,0094) и в 5,2 раза (p=0,0039) соответственно, в то время как в других тканях существенных изменений активности не наблюдалось.

ВЫВОДЫ. CAG-промотор малопригоден для экспрессии трансгена в клетках легких и головного мозга вследствие транскрипционного сайленсинга, а также не является оптимальным для экспрессии в клетках печени из-за относительно низкой активности. Эти данные следует учитывать при разработке генотерапевтических препаратов.

ВВЕДЕНИЕ. Разработка биофармацевтического препарата для ферментной заместительной терапии на основе рекомбинантной кислой α-1,4-глюкозидазы (α-глюкозидаза) является актуальной задачей, решение которой может позволить обеспечить пациентов с болезнью Помпе необходимым количеством препарата в Российской Федерации. В работе показан эффективный способ получения стабильного промышленного клона-­продуцента на основе клеток линии СНО-К1, продуцирующего активную α-глюкозидазу.

ЦЕЛЬ. Получение моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантной кислой α-глюкозидазы и оценка стабильности ростовых показателей и продуктивности в ходе культивирования в течение 60 генераций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Суспензионную клеточную линию СНО-К1 (ECACC) культивировали в среде BalanCD Growth A. Трансфекцию клеток проводили электропорацией на систе­ме MaxCyte (по протоколу СНО). Селекцию продуцентов проводили с использованием пуромицина (5 мкг/мл). Клонирование осуществляли с помощью системы дозирования клеток на основе микрофлюидной технологии (C.SIGHT). Моноклональность клеточных линий подтверждали с применением автоматизированной системы визуализации клеток (Cell Metric CLD). Концентрацию α-глюкозидазы в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Активность фермента измеряли колориметрически с субстратом 4-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид (pNP-α-D-Glc).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен скрининг 1000 продуцентов, в результате которого отобраны 22 клеточные линии с продуктивностью 0,14–0,65 г/л. Лидерный продуцент α-глюкозидазы GAA-14 клонировали с последующим подтверждением моноклональности. Получена панель из 20 моноклональных линий. Удельная активность фермента и содержание остатков маннозо-6-фосфата (М6Р) (4,3±0,9 ЕД/мг; 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка соответственно) не отличались от референтного препарата. При изучении стабильности лидерного клона в течение 60 генераций показано сохранение ростовых характеристик: жизнеспособность 98,5±1,5%, время удвоения популяции 20,0±1,3 ч, продуктивность 450±20 мг/л при периодическом культивировании в течение 7 сут.

ВЫВОДЫ. Получена стабильная моноклональная клеточная линия-продуцента α-глюкозидазы на основе СНО-К1, обеспечивающая продукцию активного фермента 0,45 г/л на 7 сут. Полученный клон-продуцент пригоден для масштабирования и наработки субстанции для доклинических исследований.

ВВЕДЕНИЕ. Механизм антителозависимого усиления инфекции (antibody-dependent enhacement, ADE), опосредуемый через Fcγ-рецептор иммунных клеток, принято считать основным. Комплекс вируса со специфическим иммуноглобулином G (IgG) взаимодействует с данным рецептором, обеспечивая вирусу лучшее проникновение в клетку. Развитие ADE возможно и у вакцинированных, что предполагает его изучение при оценке безопасности разрабатываемых вакцин.

ЦЕЛЬ. Применение метода детекции антителозависимого усиления in vitro с использованием клеток линий К562 и Vero, а также штамма вируса Чикунгунья Nika21.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В исследовании использовали вирус Чикунгунья (ЧикВ) штамм Nika21 и сыворотки, содержащие cпецифические анти-ЧикВ IgG. Специфические сыворотки использовались в разных разведениях. Для оценки ADE клетки линий К562 и Vero заражали «смесью» ЧикВ со специфическими антителами (АТ). На четвертые сутки после заражения определяли биологический титр ЧикВ и содержание вирусной РНК. Титр ЧикВ определяли с помощью стандартного метода титрования вируса in vitro, а количество РНК — с помощью флуоресцентного метода ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Наличие ADE считали подтвержденным, если значения биологического титра ЧикВ в присутствии исследуемой сыворотки в данном разведении были >3 SD относительно среднего титра ЧикВ в контроле, который представлял собой «смесь» ЧикВ с сывороткой здорового добровольца.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В клетках линии Vero с помощью обоих методов было отмечено усиление репликации ЧикВ при увеличении разведения иммунных сывороток, которое, однако, не превышало значений титров ЧикВ в контроле. В клетках линии К562 исследуемые сыворотки в одном разведении продемонстрировали статистически достоверное усиление репликации ЧикВ относительно соответствующего контроля. Таким образом, в нашем исследовании ADE было обнаружено в присутствии промежуточных разведений иммунных сывороток с относительно средним или низким титром анти-ЧикВ АТ.

ВЫВОДЫ. Репликация ЧикВ в FcR-негативных клетках линии Vero подтвердила высокую чувствительность данной линии клеток к вирусу и возможность использования ее исключительно для оценки нейтрализующей активности специфических АТ. Клетки FcR-экспрессирующей линии К562 позволили анализировать обе функции АТ: и нейтрализующую вирус, и активирующую инфекцию. Результаты работы подтвердили возможность проведения исследований ADE in vitro, что значительно упрощает исследование феномена ADE при оценке безопасности разрабатываемых вакцин.

ВВЕДЕНИЕ. Традиционные методы обнаружения иммуноглобулинов G (IgG) в сыворотке крови основаны на применении антител, химически конъюгированных с ферментными или флуоресцентными метками. Эффективность таких методов ограничивается стерическими помехами, возникающими в процессе химической конъюгации. В качестве альтернативы для иммунофлуоресцентного анализа IgG предложены бифункциональные гибридные белки Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 на основе Z‑домена белка A Staphylococcus aureus и ярких флуоресцентных белков mHoneydew и CyOFP1, которые сочетают способность связываться с IgG и интенсивную флуоресценцию, а их получение исключает этап химической конъюгации.

ЦЕЛЬ. Получение гибридных белков на основе Z‑домена белка A для создания универсальных флуоресцентных реагентов для обнаружения IgG в сыворотке крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Генетические конструкции pCCO‑Z‑mHoneydew и pCCO‑Z‑CyOFP1 получали методами молекулярного клонирования в вектор pCCO. Экспрессию белков Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 (~35 кДа) проводили в Escherichia coli штамм M15. Белки очищали аффинной хроматографией на Ni²⁺-NTA агарозе. Свойства белков изучали с использованием спектрофлуориметрии, иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунофлуоресцентного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Генетические конструкции pCCO‑Z‑mHoneydew и pCCO‑Z‑CyOFP1 под контролем промотора T5 кодируют гибридные белки со следующей структурой: Z‑домен белка A — гибкий линкер (Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly) — флуоресцентный белок mHoneydew или CyOFP1 — гексагистидиновая метка. При экспрессии выход растворимых белков составил ~37 мг/л (Z‑mHoneydew) и ~6 мг/л (Z‑CyOFP1) с чистотой ≥90%. Максимумы возбуждения и эмиссии Z‑mHoneydew зарегистрированы при длинах волн 480 и 536 нм соответственно со сдвигом эмиссии в синюю область на 26 нм относительно нативного mHoneydew (562 нм). Максимум возбуждения Z‑CyOFP1 зарегистрирован при 515 нм со сдвигом в красную область на 18 нм относительно нативного CyOFP1 (497 нм) при сохранении максимума эмиссии. Методом ИФА показано дозозависимое связывание IgG c гибридными белками. Для Z‑mHoneydew линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций от 30 до 235 нг/мкл (R²=0,96), а для Z‑CyOFP1 — от 15 до 250 нг/мкл (R²=0,97), что подтверждает способность гибридных белков связываться с IgG. Данные иммуно-флуоресцентного анализа указали на возможность обнаружения IgG, специфических к конъюгату бензо[а]пирена с бычьим сывороточным альбумином, в сыворотке крови кролика с использованием гибридных белков. Линейная зависимость для Z‑mHoneydew наблюдалась в диапазоне разведений сыворотки 1:10–1:160 (R²=0,92), а для Z‑CyOFP1 — 1:10–1:80 (R²=0,98), что свидетельствует о пригодности данных белков для обнаружения специфических антител в сыворотке крови.

ВЫВОДЫ. Гибридные белки Z‑mHoneydew и Z‑CyOFP1 сохраняют флуоресцентные свойства и способность связываться с IgG, в том числе с IgG сыворотки крови, что перспективно с точки зрения разработки прототипов универсальных иммунофлуоресцентных тест-систем.

ВВЕДЕНИЕ. Степень адсорбции компонентов вакцины на адъюванте определяет эффективность вакцины. Требования к показателю степени адсорбции антигенов в готовом продукте не установлены ВОЗ, тогда как в Государственной фармакопее Российской Федерации регламентированы. Разница в требованиях налагает ограничения для равнозначной оценки качества АКДС-вакцин различных производителей, а отсутствие международных требований вызывает сложности в адекватной оценке качества большого разнообразия вакцин.

ЦЕЛЬ. Анализ данных литературы и требований нормативных документов к определению полноты сорбции дифтерийного и столбнячного анатоксинов в составе комбинированных вакцин для совершенствования системы контроля качества и гармонизации национальных требований с мировыми стандартами качества.

ОБСУЖДЕНИЕ. В настоящее время отсутствуют международные требования к качеству геля алюминия гидроксида, используемого для адсорбции, и к величине степени адсорбции компонентов АКДС-вакцины. В ведущих фармакопеях мира установлены стандарты качества для геля алюминия гидроксида, тогда как в Российской Федерации требования не разработаны. Требования к степени адсорбции антигенов производители самостоятельно устанавливают для каждого продукта и определяют эту величину как минимум на стадии получения адсорбированного антигена. В спецификации на готовый препарат этот показатель качества может отсутствовать. Существуют три основных метода оценки степени адсорбции, которые определяют количество несвязанного антигена в супернатанте, при этом чувствительность и стоимость методов отличаются. Содержание антигенов выражают в общепринятых единицах флокуляции — Lf (limit of flocculation). Российские вакцины отличаются от зарубежных методами определения степени адсорбции антигенов и единицами выражения количественного содержания столбнячного анатоксина. Из-за разницы подходов и единиц выражения степени адсорбции отечественные вакцины уступают зарубежным, что, тем не менее, не указывает на низкую эффективность вакцин на основе АКДС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Стандартизация требований к качеству геля алюминия гидроксида для адсорбции, методов контроля степени адсорбции антигенов и единиц выражения количественного содержания антигенов в настоящее время имеет решающее значение для гармонизации фармакопейных требований. Внедрение актуальных требований к адъюванту и современных методов контроля качества степени адсорбции антигенов позволит упрос­тить нормативное регулирование вакцин на основе АКДС.

ВВЕДЕНИЕ. Для оценки активности аллергенов методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) требуются стандартные образцы (СО) специфических сывороток, содержащих IgE-антитела к аллергену пыльцы амброзии полыннолистной. Однако международный и национальный стандарты такой сыворотки отсутствуют. Актуальной представляется разработка российского фармакопейного стандартного образца (ФСО) IgE-­содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии.

ЦЕЛЬ. Аттестация кандидата в ФСО лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии (ФСО IgE-Амб) и оценка возможности его применения для определения концентрации IgE и активности аллергена.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Концентрацию аллергенспецифических IgE-антител в ФСО IgE-Амб определяли методом реверсивного аллергосорбентного теста (РЕАСТ) с помощью коммерческого набора реагентов российского производства. Подлинность ФСО IgE-Амб определяли согласно ОФС.1.7.2.0034.15 методом прямого ИФА. Испытания кандидата в ФСО по показателям качества «Описание», «Вода», «Однородность массы», «Растворимость», «Герметичность» проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ). Аллергенную активность оценивали методом конкурентного ИФА. Статистическую обработку данных проводили с использованием дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Аттестация кандидата в ФСО IgE-Амб проведена согласно утвержденной программе аттестации. Методом РЕАСТ определена аттестуемая характеристика ФСО IgE-Амб — концентрация специфических IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии, составившая 27,02±4,6 МЕ/мл (4-й класс). Подтверждена специфичность связывания ФСО IgE-Амб с аллергеном пыльцы амброзии полыннолистной. Результаты испытаний кандидата в ФСО по дополнительным показателям качества («Описание», «Вода», «Однородность массы», «Растворимость», «Герметичность») соответствовали требованиям ГФ РФ. Показана возможность использования ФСО IgE-Амб для определения концентрации IgE-антител в референс-сыворотках предприятия методом прямого ИФА и оценки активности аллергена пыльцы амброзии методом конкурентного ИФА. Коэффициенты вариации между известным и определенными с помощью ФСО значениями составили 4,7% для прямого ИФА и 8,0% для конкурентного ИФА.

ВЫВОДЫ. Впервые аттестован российский ФСО лиофилизированной IgE-содержащей сыворотки к аллергену пыльцы амброзии с установленной характеристикой — концентрацией специфических IgE-антител к аллергену пыльцы амброзии полыннолистной, определенной методом РЕАСТ. ФСО IgE-Амб соответствует требованиям ГФ РФ, рекомендован для включения в Реестр фармакопейных стандартных образцов ГФ РФ и обеспечивает возможность стандартизации аллергенов и референс-сывороток в Российской Федерации.

ВВЕДЕНИЕ. Реактогенность цельноклеточных коклюшных вакцин (ЦКВ) в основном обусловлена присутствием липоолигосахарида (ЛОС) — бактериального эндотоксина (БЭ) наружной мембраны Bordetella pertussis. Оценка содержания ЛОС в ЦКВ и его корреляции со специфической безопасностью позволит определить приемлемый уровень ЛОС, не усиливающий реактогенность.

ЦЕЛЬ. Определение содержания липоолигосахарида в цельноклеточных коклюшных вакцинах и установление корреляции с параметрами специфической безопасности у мышей (изменением массы тела и показателем специфической безопасности).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследовали экспериментальные серии ЦКВ из производственных (38, 475, 703) и циркулирующих штаммов B. рertussis (1-20, 2-20, 16-16, 25-16, 28(1)-18, 30-18, 33-18), выделенных от больных коклюшем детей. Содержание БЭ определяли гель-тромб тестом и турбидиметрическим методом. Параметры специфической безопасности оценивали через 24 ч и 7 сут после введения препарата по изменению массы тела аутбредных мышей обоего пола, а также по значению показателя специфической безопасности (%).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Определено содержание БЭ на протяжении следующих сроков хранения: 1 год после изготовления ЦКВ (до сведения ЦКВ с другими компонентами АКДС-вакцины); от 1 до 2,5 года (срок годности ЦКВ в составе АКДС-вакцины); от 2,5 до 6 лет (после истечения срока годности). Средние значения содержания БЭ в ЦКВ из циркулирующих штаммов при хранении 1 год и 1–2,5 года составили 41872,9–70576,0 ЕЭ/мл; в ЦКВ из производственного штамма при хранении 1–2,5 года — 43980,6 ЕЭ/мл. В вакцинах с продолжительностью хранения 2,5–6 лет средние значения БЭ составляли 1353,8–26655,0 ЕЭ/мл. Установлен широкий диапазон значений содержания БЭ в изготовленных сериях: от <1000–1270 ЕЭ/мл (штамм 30-18) до 36430–94270 ЕЭ/мл (штамм 703). Показатели специфической безопасности образцов, кроме свежеизготовленных 16-16 и 33-18, составили >60%. Установлена обратная корреляционная связь умеренной силы между содержанием БЭ и изменением массы тела мышей и показателем специфической безопасности.

ВЫВОДЫ. Содержание БЭ в образцах ЦКВ с продолжительностью хранения 1 год и 1–2,5 года статистически не различалось. Показатели специфической безопасности образцов (>60%) свидетельствуют о соответствии уровня БЭ требованиям безопасности. Обратная корреляция между содержанием БЭ (in vitro) и показателем специфической безопасности (in vivo) подтверждает роль ЛОС в специфической токсичности препарата, что обосновывает актуальность дальнейшего изучения его уровня в штаммах B. pertussis и влияния на безопасность ЦКВ.