Вирусы гриппа ежегодно вызывают до 70% случаев сезонных респираторных инфекций и имеют крайне высокий пандемический потенциал [1]. Современная стратегия противодействия гриппу в значительной степени опирается на вакцинопрофилактику. Формирующиеся в ответ на вакцинный или инфекционный штамм антитела могут обеспечить полную иммунную защиту от повторного заражения тем же (гомосубтипичным) штаммом вируса гриппа [2]. Однако эволюционно выработанные вирусом гриппа механизмы, такие как высокая антигенная изменчивость и реассортация геномных сегментов, существенно затрудняют предсказание циркуляции эпидемически значимых штаммов гриппа, а ошибки в выборе вакцинных штаммов приводят к значительному снижению профилактической эффективности [3]. Пассивная иммунотерапия с использованием моноклональных антител широкого спектра действия является альтернативным подходом в борьбе с инфекциями, вызванными вирусами гриппа.

Модульная структура антител дает возможность создавать более компактные функциональные фрагменты, такие как антигенсвязывающие фрагменты (fragment antigen binding, Fab), одноцепочечные вариабельные фрагменты (single chain variable fragments, scFv), однодоменные антитела, а также кристаллизуемые фрагменты антитела (fragment crystallizable, Fc) [4]. Молекулы scFv представляют собой химерные рекомбинантные белки, состоящие из вариабельных участков тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей полноразмерного антитела, которые соединены друг с другом гибким пептидным линкером [5][6]. Вариабельные участки VH и VL, локализованные совместно, формируют вариабельный фрагмент, который непосредственно участвует в связывании антигена. scFv-фрагменты демонстрируют аффинность связывания, сравнимую с исходными полноразмерными антителами — иммуноглобулинами класса G (IgG). Производство scFv-фрагментов менее затратно благодаря компактным размерам; scFv-фрагменты лучше проникают в ткани и органы и достигают стерически скрытых и конформационно сложных эпитопов антигена [4]. scFv-фрагменты не содержат константные области Fc, которые есть в полноразмерных молекулах антител, поэтому scFv-фрагменты характеризуются сниженной иммуногенностью из-за отсутствия эффекторных функций [4][7].

Для выделения scFv-фрагментов из культурального супернатанта не подходит стандартный для хроматографической очистки иммуноглобулинов Fc-рецепторный белок G Streptococcus pyogenes. Очистку и иммобилизацию scFv-фрагментов осуществляют с использованием белка L (взаимодействует с вариабельной областью легких κ-цепей), а в случае наличия в scFv-фрагменте человеческого домена VH3 — с использованием белка А [8]. Наиболее распространенным подходом при конструировании является добавление к С-концу молекулы scFv последовательности из шести гистидинов (6×His-tag) для дальнейшей очистки методом металл-аффинной хроматографии [9][10].

Использование scFv-фрагментов антител для лечения и профилактики острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) перспективно в силу ряда ключевых преимуществ. Малый размер scFv-фрагментов способствует лучшему проникновению через слизистые оболочки дыхательных путей при интраназальном введении препарата. Низкая иммуногенность и быстрое выведение из организма делают scFv-фрагменты идеальными кандидатными препаратами для экстренной профилактики во время эпидемий и терапии ОРВИ на ранних стадиях.

Наше научное исследование посвящено конструированию и созданию молекулярно-биологическими методами панели scFv-фрагментов высокоаффинных моноклональных антител, связывающих гемагглютинин (HA) и нуклеопротеин (NP) вируса гриппа А и B. Первый scFv-фрагмент был создан на основе человеческого иммуноглобулина G (IgG) FI6, который характеризуется широкой нейтрализующей активностью против штаммов вируса гриппа А (ВГА), относящихся к первой и второй филогенетическим группам [11]. Как установлено ранее, антитело FI6 взаимодействует с остатками пептида слияния и гидрофобной областью спирали НА ВГA, но не связывается с вирусом гриппа В (ВГВ) [11–13]. Другие два белковых варианта scFv были разработаны на основе моноклональных IgG мыши (клон 2/3), впервые полученных в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России при инфицировании экспериментальных животных ВГВ. IgG 2/3 специфически связывают головной домен NP Ямагатской и Викторианской антигенных линий ВГВ, но не являются нейтрализующими и широко используются в диагностических тест-системах [14].

Цель работы — разработка экспрессионных конструкций для синтеза scFv-фрагментов рекомбинантных антител к вирусу гриппа А и В, получение белковых препаратов scFv и оценка их функциональной активности in vitro.

ПЦР с перекрывающимися геноспецифическими праймерами проводили с использованием высокоточной полимеразы Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific, США) и специально разработанных четырех пар специфических праймеров (табл. 1), синтезированных ЗАО «Евроген» (Россия) в три этапа: получение первичных фрагментов, отжиг первичных фрагментов, достраивание до полноразмерного фрагмента и финальная амплификация [15]. Второй и третий этапы ПЦР с перекрывающимися праймерами проводили с использованием в качестве матрицы 20 нг первичных продуктов и 2 мкМ наружных прямого и обратного праймеров со следующими установками амплификатора Gentier 96E (Tianlong, Китай): 1) денатурация — 98 °С, 30 с; 2) 9 циклов: отжиг — 98 °С, 40 с; элонгация — 72 °С с понижением температуры на 0,5 °С на каждом следующем цикле, 25 с; 3) 15 циклов: денатурация — 98 °С, 15 с; отжиг — 65 °С, 15 с; элонгация — 72 °С, 25 с.

ScFv-фрагменты обрабатывали рестриктазами ClaI и NotI (Сибэнзим, Россия) для клонирования в экспрессионный вектор pIRESneo3 (Clontech, США). Продукты реакции разделяли в 1% агарозном геле, содержащем 1х TAE-буфер (ЗАО «Евроген», Россия). Для выделения фрагментов нужной длины из геля применяли набор Cleanup S-Cap (ЗАО «Евроген», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Аналогичным образом обрабатывали рестриктазами вектор pIRESneo3 (Clontech, США), очищая его из реакционной смеси с использованием набора Cleanup S-Cap. Затем проводили лигирование очищенных фрагментов и вектора в молярном соотношении 3:1 лигазой фага Т4 (T4 DNA Ligase, Thermo Fisher Scientific, США) в объеме 20 мкл в течение 30 мин при 22 °С. Далее лигазную смесь сразу использовали для трансформации химически компетентных бактериальных клеток Escherichia coli, штамм HB101, по методу H. Inoue c соавт. [16].

Построение 3D-моделей разработанных scFv-фрагментов проводили по первичной аминокислотной последовательности (транслированной из секвенограммы) на сервере AlfaFold Server 3 [17]. AlphaFold напрямую предсказывает локальную структуру белка (геометрию связей тяжелых атомов), используя в качестве входных данных первичную аминокислотную последовательность и известные структуры белков-гомологов. Моделирование проводили для стандартных шаблонов MSA (Multiple-Sequence Alignment), установленных по умолчанию, задавая в качестве типа объекта «protein»; аминокислотная последовательность белка была введена без сигнального пептида.

Клетки линии НЕК293 культивировали в среде DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США) в СО2-инкубаторе при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Для проведения трансфекции клетки засевали в количестве 25×10⁶ клеток в культуральные флаконы площадью 175 см² (Jet Biofil, Китай) и на следующие сутки трансфицировали реагентом GenJect-39 (Molecta, Россия) согласно инструкции производителя из расчета 40 мкг плазмиды на один культуральный флакон и с использованием соотношения «ДНК : трансфекционный агент», равного 1:1 (масса/объем, мкг/мкл). Клетки после трансфекции культивировали в течение 12 сут, поддерживая концентрацию глюкозы не менее 4 г/л.

Уровень глюкозы в культуральной среде измеряли с использованием медицинского глюкометра Accu-Chek Active (Roche Diabetes Care, Германия) с соответствующими тест-полосками.

Для получения стабильных продуцентов рекомбинантных белков использовали перевиваемую клеточную линию ExpiHEK293 (Thermo Fisher Scientific, США) и ростовую среду DMEM (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением сыворотки крупного рогатого скота до 5% (Gibco, США). Трансфекцию суточного монослоя клеток (~0,5×10⁶ клеток в лунке) проводили 1 мкг соответствующей генетической конструкции на основе вектора pIRESneo3 (Clontech, США) с использованием GenJect-39 (Molecta, Россия). Селекцию пулов-продуцентов проводили в течение 2 нед. с использованием антибиотика G418 (Gibco, США), вносимого в культуральную среду до конечной концентрации 150 мкг/мл. Продукцию scFv-фрагментов в супернатантах клеток оценивали каждые 3–5 сут методом иммуноферментного анализа (ИФА). Отбор стабильных клонов-продуцентов проводили методом предельных разведений, рассевая пул стабильных продуцентов в лунки 96-луночного планшета из расчета одна клетка на лунку. Подсчет клеток проводили в автоматическом счетчике клеток TC-10 (Bio-Rad, США). Клоны, показавшие наибольшую продуктивность и жизнеспособность, были размножены и депонированы в Коллекцию ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Очистку рекомбинантных антител из культуральной среды проводили с использованием метода металл-аффинной хроматографии на системе ӒKTA pure (Cytiva, Швеция) с колонкой Polac MC60-Ni Excel объемом 1 мл (Sepax, Китай). Элюцию scFv-фрагментов выполняли 15 мл (15 объемов колонки) 100% элюирующего буфера (50 мМ трис-HCl, 500 мМ натрия хлорид, 500 мМ имидазол, рН 8,0) при скорости потока 5 мл/мин. Контроль элюции проводили по поглощению раствора при длине волны 280 нм. На этапе элюции на автоматическом коллекторе отбирали фракцию, соответствующую пику оптической плотности >0,05 AU. Далее материал переводили в фосфатно-солевой буфер обессоливанием при помощи картриджа Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 (Bio-Rad, США) объемом 10 мл согласно инструкции производителя. Полученный препарат фильтровали через шприцевой фильтр Sartorius (Германия) с размером пор 0,45 мкм. Очищенные препараты scFv концентрировали с использованием центрифужных концентраторов JetSpin 5 kDa (Jet Biofil, Китай) и стерилизовали фильтрацией через PES-мембрану с размером пор 0,22 мкм (Jet Biofil, Китай).

Концентрацию общего белка измеряли на флуориметре Qubit с использованием набора Qubit Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США).

Электрофорез белков в ПААГ выполняли по методике Лэммли [18] в восстанавливающих условиях с добавлением β-меркаптоэтанола. Применяли градиентный гель Any kD с 15 лунками (Кат. № 4568126, Bio-Rad, США). Образцы перед загрузкой в лунки смешивали с 4х буфером для образцов (Laemmli sample buffer) и денатурировали при 95 °C в течение 10 мин в термостате «Гном» (ООО «ДНК-Технология», Россия). Разделение белков осуществляли при постоянном токе 25 мА на гель в течение 45 мин в вертикальной камере Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, США). Гель окрашивали коллоидным раствором Кумасси по методу G. Candiano с соавт. [19]. Визуализацию окрашенного геля проводили на системе документирования Gel Doc EZ Imager (Bio-Rad, США).

Иммуноферментный анализ выполняли с использованием 96-луночных планшетов Microlon High Binding (Greiner Bio-One, Германия) и термошейкера MB100-4A (Allsheng, Китай). Для работы использовали вирусы гриппа из Коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. Для иммобилизации в качестве антигена были подготовлены вирусные панели (табл. 2): вирусы гриппа А и В выращивали в 10-дневных куриных эмбрионах, очищали в градиенте сахарозы и далее хранили при –80 °С в аликвотах, содержащих 2–5 мг/мл общего белка. Вирусы сорбировали в концентрации 2–5 мкг на 100 мкл на поверхности лунок при 4 °С в течение 16 ч. Для блокирования неспецифического связывания использовали 5% раствор обезжиренного молока (Blotting-Grade Blocker, Кат. № 1706404, Bio-Rad, США) в фосфатно-солевом буфере pH 7,4 (ООО «ПанЭко», Россия) с 0,05% Твин-20 при 37 °C в течение 1 ч. Образцы scFv в концентрации 200 нг/мл инкубировали при 37 °С в течение 2 ч, затем добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к последовательности 6×His-tag (HyTest, Россия) в разведении 1:2000 (рекомендовано производителем) и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. Для выявления референсного образца IgG-FI6 использовали антитела Goat Anti-Human IgG H&L, конъюгированные с пероксидазой хрена (Bio-Rad, США). После стандартной детекции с использованием тетраметилбензидина (ООО «Хема», Россия) и 1 Н серной кислоты измеряли оптическую плотность при длинах волн 450 и 655 нм на микропланшетном спектрофотометре Multiskan SkyHigh (Thermo Fisher Scientific, США). Статистический анализ первичных данных проводили в программных пакетах Microsoft Office Exсel 2010 и GraphPad Prism 8.

Образцы объемом 50 мкл, содержащие scFv-фрагменты в концентрациях от 0,001 до 10 мкг/мл, смешивали с равным объемом образца, содержащего 100 ТЦД501 вируса гриппа. Полученную смесь в объеме 100 мкл инкубировали при 37 °С в течение 1 ч, затем наносили на монослой клеток MDCK2, предварительно промытый фосфатно-солевым буфером рН 7,2, в 96-луночных планшетах для клеточных культур (NUNC, Дания). Планшеты помещали в СО2-инкубатор при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, и инкубировали в течение 3 сут. Цитопатическое действие вирусов гриппа анализировали визуально и регистрировали в реакции гемагглютинации по стандартной методике [20]. Показатель IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) рассчитывали по результатам построения 4-параметрической кривой «доза-эффект» с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8 на основании трех независимых повторов. Статистический анализ первичных данных проводили в программных пакетах Microsoft Office Exсel 2010 и GraphPad Prism 8.

Схематическое изображение предложенного нами дизайна scFv-фрагментов показано на рисунках 1А и 1В. N-конец scFv-фрагмента содержал сигнальный пептид для секреции белка во внеклеточное пространство. Далее к С-концу VL-участка IgG через пространственный линкер в направлении от N- к C-концу был добавлен VH-участок антитела, содержащий на С-конце последовательность 6×His-tag. Две линкерные последовательности, одна из которых состоит из тетрамера G4S ((G4S)4), а другая — из гексамера G4S ((G4S)6), были предложены для scFv-2/3; для scFv-FI6 в качестве линкера был использован только один олигопептид (G4S)4. В качестве сигнального пептида использована последовательность L1 MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC, обеспечивающая высокопродуктивную сборку рекомбинантных антител в эукариотических системах на основе клеточных линий CHO3 и HEK4 [21][22].

Синтез последовательностей scFv был осуществлен с использованием ПЦР с перекрывающимися праймерами (табл. 1) в несколько стадий (рис. 1В). В качестве ДНК-матрицы использовали плазмидные конструкции, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител 2/3 и FI6, разработанные нами ранее для получения рекомбинантных полноразмерных антител. На первой стадии была проведена независимая амплификация вариабельных участков легкой и тяжелой цепей, при этом 3’-конец ПЦР-продукта легкой цепи перекрывался с 5’-концом ПЦР-продукта тяжелой цепи [23][24]. Как показано на рисунке 1С, длины полученных вариабельных последовательностей соответствовали ожидаемым (показано для антитела FI6). Фрагменты выделяли из геля и использовали в качестве матрицы (в количестве 20 нг) во второй стадии ПЦР, затем добавляли наружные праймеры, содержащие сайты рестрикции ClaI и NotI. Амплификация всех фрагментов осуществлялась высокоточной полимеразой Phusion™.

Полученные scFv-фрагменты очищали из геля (рис. 1С) и клонировали методом рестрикции-лигирования (по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции ClaI и NotI) в векторе pIRESneo3 (Clontech, США). Полученные плазмидные конструкции были накоплены, очищены, в том числе от бактериального эндотоксина, и секвенированы методом Сэнгера в ЗАО «Евроген» (Россия). Нуклеотидная и транслированная аминокислотные первичные последовательности scFv-фрагментов полностью соответствовали ожидаемой структуре.

C использованием программного обеспечения AlphaFold 3 [17][25] была предсказана пространственная структура всех трех разработанных scFv-фрагментов (рис. 1D). Согласно полученным нами результатам (рис. 1D), вторичная структура VL и VH участков в структуре scFv-фрагментов представляет собой бета-складчатые тяжи (pLDDT>90) подобно структуре, описанной для иммуноглобулинов [26]. Наименьшее качество прогнозирования (pLDDT<50) в структурах scFv-фрагментов было показано для сателлитных инженерных структур, особенно для линкерных областей, состоящих из аминокислотных остатков глицина и серина (рис. 1D). Таким образом, представлены модели 3D-структуры scFv-фрагментов. Наиболее вероятная доменная организация созданного химерного scFv-FI6 белка в целом отражает экспериментальные структуры, описанные для исходного полноразмерного антитела FI6 (PDB 3ZTN) [11].

Полученные плазмидные конструкции на основе pIRESneo3 (Clontech, США) были использованы для трансфекции клеток HEK293. Для определения продолжительности продукции, обеспечивающей максимальный выход рекомбинантных белков при временной трансфекции, исследовали кинетику накопления scFv-фрагментов в культуральной жидкости. Устойчивый прирост наблюдался в течение 6 сут для scFv-FI6-4 и в течение примерно 8 сут для обоих фрагментов scFv-2/3 (рис. 2А). Были получены и сохранены стабильные линии клеток-продуцентов фрагментов scFv-FI6-4, scFv-2/3-4 и scFv-2/3-6 с использованием антибиотика G418 на основе клеточной культуры ExpiHEK293. Был проведен первый этап селекции клеток-продуцентов, в результате которого удалось депонировать пул постоянных жизнеспособных продуцентов с первичной продуктивностью не менее 5 мкг/мл (результаты не представлены).

Для выделения и очистки scFv-фрагментов проводили транзиентную продукцию в течение 10 сут. Далее препараты scFv-фрагментов, полученные в результате хроматографической очистки, анализировали методом электрофореза белков в ПААГ в восстанавливающих условиях (рис. 2В). Молекулярные массы полученных scFv-фрагментов соответствуют ожидаемым значениям, что следует из электрофореграммы.

Способность полученных нами образцов scFv к специфическому связыванию с HA ВГА и NP ВГВ изучали методом ИФА (рис. 2С). Для этого в качестве сорбирующих лигандов использовали панель ВГА, содержащих различные подтипы поверхностных HA, и ВГВ (табл. 2). В экспериментах использовали несколько штаммов ВГА: H1N1pdm09 и H3N2, наиболее широко распространенные в человеческой популяции, и ВГА подтипа H2N2; в качестве ВГВ использовали штамм B/Phuket/3073/13, относящийся к Ямагатской генетической линии.

Согласно полученным результатам, scFv-FI6-4 специфически связывал все штаммы ВГА, однако уровень детектируемого сигнала несколько варьировал. Предположительно, scFv-FI6 имеет наибольшее сродство к ВГА подтипа H1N1pdm, что согласуется с литературными данными [27][28]. С ВГВ специфически связывались только scFv-фрагменты, полученные из антитела 2/3, что было ожидаемо. Уровни сигналов связывания scFv-2/3-4 и scFv-2/3-6 с ВГВ статистически не отличались.

Значение показателя IC50 в отношении протестированного штамма рассчитали из кривой «доза-эффект» (рис. 2D) на основании трех независимых повторов. В качестве штамма ВГА использовали А/California/07/09 (H1N1pdm09), а ВГВ — B/Phuket/3073/13 (Yam). Для scFv-фрагментов на основе антитела 2/3, не обладающего нейтрализующими свойствами, так же, как и для исходного иммуноглобулина 2/3, было показано отсутствие протективного действия в отношении ВГВ (как и ВГА) (результаты не представлены).

Полученный нами препарат scFv-FI6-4 проявлял нейтрализующую активность в отношении эталонного штамма вируса гриппа. В качестве референсного препарата использовали рекомбинантный человеческий полноразмерный иммуноглобулин IgG-FI6, полученный нами ранее [29]. Константные области тяжелой и легкой цепей IgG-FI6 были идентичны аминокислотным последовательностям P01857 (IgG1) и P01834 (κ-изотип) соответственно, согласно базе данных UniProt [30]; вариабельные области полностью совпадали с фрагментами в составе scFv-FI6-4. Среднее значение показателя IC50, рассчитанного по трем сериям экспериментов для scFv-FI6-4, составило 170 нг/мл (130, 200 и 180 нг/мл в каждом из экспериментов); для референсного препарата (человеческий IgG-FI6) — 179 нг/мл (208, 160 и 169 нг/мл). Достоверные различия (тест Манна — Уитни для сравнения двух независимых выборок) между полученными значениями IC50 для исходного IgG-FI6 и scFv-FI6-SP4 отсутствовали.

Несмотря на значительные достижения в создании противовирусных препаратов, гриппозная инфекция по-прежнему представляет серьезную проблему для общественного здравоохранения [31]. Сравнительно новым узконаправленным терапевтическим подходом является использование антител широкого спектра действия. Тем не менее существуют определенные трудности, связанные с высокопроизводительным получением и очисткой стабильных рекомбинантных иммуноглобулинов [32].

В нашей работе описан доступный и воспроизводимый способ получения scFv-фрагментов на основе антител. Наличие вариабельных фрагментов исходного полноразмерного антитела в структуре scFv обеспечивает необходимый функционал и высокоспецифическое связывание с мишенью, однако иммуногенность таких терапевтических агентов значительно снижена из-за отсутствия в их составе Fc-фрагмента [4]. Кроме того, получение рекомбинантных scFv-фрагментов происходит с использованием моноплазмидной системы, что помогает избежать проблем с неправильным сочетанием легких и тяжелых цепей [33][34]. В настоящее время на биофармацевтическом рынке представлено более 30 наименований терапевтических продуктов на основе scFv-фрагментов5.

Для получения scFv-фрагментов мы применяли метод ПЦР с перекрывающимися праймерами и в качестве матрицы использовали плазмидные конструкции, кодирующие тяжелую и легкую цепи рекомбинантного антитела. Получение scFv-фрагментов молекулярно-биологическими методами является достаточно простым, дешевым и эффективным способом.

Первичная структура scFv может быть выполнена в ориентации VL-линкер-VH или VH-линкер-VL, а линкер может состоять из разного количества повторов G4S. Предпочтительная ориентация scFv зависит от аминокислотной последовательности, и в разных публикациях отмечены разные подходы [35]. В нашей работе для всех scFv была реализована ориентация VL-линкер-VH. Комбинация гибких и гидрофильных аминокислотных остатков линкеров предотвращает образование вторичных структур и снижает вероятность того, что линкеры будут препятствовать сворачиванию и функционированию белковых доменов [36]. Поскольку было неизвестно, как повлияет на активность одноцепочечных антител длина линкера между доменами, для одной из конструкций (scFv-2/3) использовали два типа линкеров c 4 и 6 повторами G4S. Эксперименты показали, что длина линкера не влияет на продукцию клетками scFv-фрагментов антитела 2/3 и их функциональные свойства. Сигналы взаимодействия очищенных scFv-2/3-4 и scFv-2/3-6 со специфическим антигеном статистически значимо не отличались.

К недостаткам некоторых рекомбинантных антител относятся низкая стабильность, а также сложность их наработки и очистки [37][38]. В частности, получение и очистка используемого нами в качестве исходного антитела полноразмерного иммуноглобулина FI6 были крайне трудоемкими [12][13]. Нейтрализующая активность полученного нами scFv-FI6-4 была сопоставима с активностью IgG-FI6, но получение и очистка scFv были менее трудоемкими.

Наряду с дизайном первичной аминокислотной последовательности было проведено молекулярное моделирование для предсказания 3D-структуры разработанных нами молекул. Известно, что вариабельные домены иммуноглобулина состоят из β-тяжей, которые соединяются между собой стабилизирующей дисульфидной связью [26]. По данным моделирования, наиболее вероятная структура укладки вариабельных участков тяжелой и легкой цепей в разработанных нами scFv-фрагментах представляет собой антипараллельные β-нити, что в целом сходно с вариабельным фрагментом полноразмерного иммуноглобулина.

Таким образом, мы выполнили дизайн и описали подходы к получению scFv-фрагментов антител, обладающих широкой нейтрализующей активностью в отношении HA ВГА и высокой специфичностью к NP ВГВ (не являются нейтрализующими). Описана динамика экспрессии и характеристика очищенных scFv-фрагментов. Продемонстрировано, что полученные scFv-фрагменты специфически связываются с заявленными антигенами (гемагглютинином ВГА и нуклеопротеином ВГВ). При этом scFv-FI6-4 проявляет функциональную активность, сопоставимую с исходным IgG-FI6, и дозозависимо нейтрализует ВГА в экспериментах in vitro.

Применение scFv-фрагментов для профилактики и лечения ОРВИ представляет особый интерес благодаря ряду преимуществ. Малый размер scFv-фрагментов способствует их эффективному проникновению через слизистые оболочки при интраназальном введении. Это приводит к формированию не только местного иммунного барьера в носоглотке, но и оказывает системный противовирусный эффект, предотвращающий распространение возбудителя по организму. Низкая иммуногенность и короткий период полувыведения снижают риск нежелательных иммунных реакций, что особенно важно для экстренной профилактики и своевременной терапии ОРВИ. В будущем данная стратегия может быть значительно усилена за счет создания биспецифических scFv-фрагментов. Такие конструкции, нацеленные на два эпитопа одновременно, могут обеспечить беспрецедентную эффективность блокирования вируса и преодолеть ограничения моноспецифических антител.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: М.А. Плотникова — подготовка и проведение экспериментов, обработка и анализ данных, визуализация, написание и редактирование текста рукописи; В.А. Топорова — получение генно-инженерных конструкций, концептуализация, редактирование текста рукописи; Е.А. Романовская-Романько — подготовка и проведение экспериментов, обработка и анализ данных, визуализация; А.А. Шалджян — проведение хроматографической очистки, визуализация; С.А. Клотченко — концептуализация, общее руководство проектом, привлечение финансирования, рецензирование и редактирование текста рукописи, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. M.A. Plotnikova prepared and conducted the experiments, processed and analysed the data, visualised, drafted, and edited the manuscript. V.A. Toporova obtained gene-engineered constructs, conceptualised, and edited the manuscript. E.A. Romanovskaya-Romanko prepared and executed the experiments, processed, analysed, and visualised data. A.A. Shaldzhyan, performed chromatographic purification and visualisation. S.A. Klotchenko conceptualised, supervised the overall project, fundraised, reviewed and edited the manuscript, and approved the final version for publication.

1. Тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя. 2. Madin-Darby canine kidney cells, клетки почек собаки Мадина-Дарби. 3. Chinese hamster ovary cells, клетки яичника китайского хомячка. 4. Human embryonic kidney cells, клетки эмбриональной почки человека. 5. WHO Drug Information. WHO; 2025. https://www.who.int/publications/i/item/9789240112650