Цыганова Галина Михайловна
ул. Погодинская, д. 10, стр. 1, Москва, 119121
Galina M. Tsyganova
10/1 Pogodinskaya St., Moscow 119121
Богословская Екатерина Денисовна
Институтский пер., д. 9, г. Долгопрудный, Московская область, 141701
Ekaterina D. Bogoslovskaya
9 Institutsky Ln., Dolgoprudny, Moscow region 141701
Шипулин Герман Александрович, канд. мед. наук
ул. Погодинская, д. 10, стр. 1, Москва, 119121
German A. Shipulin, Cand. Sci. (Med.)
10/1 Pogodinskaya St., Moscow 119121
Шипулина Ольга Юрьевна, канд. мед. наук
Бережковская наб., д. 20, стр. 13, Москва, 121059
Olga Yu. Shipulina, Cand. Sci. (Med.)
20/13 Berezhkovskaya Embk., Moscow 121059
Богословская Елена Владимировна, д-р мед. наук
ул. Погодинская, д. 10, стр. 1, Москва, 119121
Elena V. Bogoslovskaya, Dr. Sci. (Med.)
10/1 Pogodinskaya St., Moscow 119121
ВВЕДЕНИЕ. Высокая вариабельность генома РНК-содержащего вируса кори создает риск накопления мутаций в местах посадки (комплементарного связывания) праймеров, что может повлиять на надежность результатов молекулярной диагностики кори. В настоящей работе проведена оценка влияния таких мутаций на эффективность двух молекулярно-генетических методов — ПЦР и метода петлевой изотермической амплификации (LAMP).
ЦЕЛЬ. Оценить частоту встречаемости мутаций в местах связывания праймеров и их влияние на эффективность методов ПЦР и LAMP в выявлении РНК вируса кори.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали нуклеотидные последовательности вируса кори из базы данных NCBI и клинические образцы носоглоточного секрета, предоставленные АО «ЛабКвест» (Москва, Россия). Экстракцию РНК вируса кори проводили с использованием набора реагентов «АмплиТест РИБО-преп». Амплификацию выполняли с использованием наборов реагентов «АмплиТест Корь» и методики LAMP. Биоинформатический анализ проводили с использованием программ MAFFT, Jalview 2.1, CD-HIT, MEGA12 и FigTree v.1.4.3.
РЕЗУЛЬТАТЫ. При анализе 1080 нуклеотидных последовательностей вируса кори было обнаружено не более одной замены в областях праймеров и зонда, используемых в ПЦР. Анализ последовательностей в местах посадки праймеров, используемых в LAMP, показал бóльшую вариабельность по сравнению с методом ПЦР, но и в этом случае 96,5% последовательностей содержало не более одной мутации в месте посадки каждого праймера. В 15 из 69 клинических образцов была выявлена только одна мутация в области посадки прямого праймера, которая незначительно влияла на эффективность ПЦР при низких концентрациях вируса. Для метода LAMP в 18 образцах было обнаружено три мутации в целевых последовательностях для праймеров F3, B1c и В2. В модельных экспериментах показано, что мисмэтч (несовпадение) во внешнем праймере F3 не влияет на скорость и чувствительность реакции, в то время как для петлевого праймера BIP была показана аномально высокая эффективность амплификации при наличии двух мутаций в РНК-последовательностях, что может косвенно свидетельствовать о наличии конформационных особенностей длинных петлевых праймеров.
ВЫВОДЫ. Оба метода — ПЦР и LAMP — эффективно выявляют РНК вируса кори даже при наличии мутаций в области посадки праймеров. Однако метод LAMP требует дальнейшего изучения для широкого внедрения в диагностику кори.
INTRODUCTION. The high variability of the measles virus RNA genome poses risks of mutations accumulating at primer binding sites (complementary binding site), potentially impacting the reliability of molecular measles diagnostics. In this study, we have assessed the impact of such mutations on the efficiency of two molecular genetic methods: PCR and loop-mediated isothermal amplification (LAMP).
AIM. This study aimed to evaluate the occurrence of mutations at primer binding sites and their impact on the efficiency of PCR and LAMP methods in detecting measles virus RNA.
MATERIALS AND METHODS. Clinical samples of nasopharyngeal secretions (LabQuest, Moscow, Russia) and nucleotide sequences from NCBI database were used in the study. AmpliTest RIBO-prep kit was used for RNA extraction. AmpliTest Measles kit and LAMP-based kit were used for amplification. MAFFT, Jalview 2.1, CD-HIT, MEGA1, and FigTree v.1.4.3 software were used to perform a bioinformatics analysis.
RESULTS. Having analyzed 1,080 nucleotide sequences of the measles virus, we found no more than one mutation in the target primers target sites and probe used for PCR. The analyzed LAMP primer binding sites showed greater variability compared to PCR primers; even in this case, 96.5% of the sequences contained no more than a single mutation at each site. Out of 69 clinical samples, only 15 had one mutation in the forward primer binding site, with a minor impact on PCR performance at low virus concentrations. For the LAMP method, three mutations were detected in the F3, B1c, and B2 primer target sites in 18 samples. In a model experiment, the mismatch in the region of the outer primer F3 did not affect the speed and sensitivity of the reaction. Inversely, the loop forming primer BIP performed abnormally well in the presence of two mutations in the RNA sequences. This can indirectly prove the existence of conformational aspects for long loop primers.
CONCLUSIONS. Both methods (PCR and LAMP) effectively detect samples with mutations; however, the LAMP method warrants further research to expand its potential for diagnosing measles.
Корь остается актуальной проблемой здравоохранения во многих странах, в том числе в Российской Федерации. Важную роль в снижении распространения кори, помимо вакцинации, играет ранняя диагностика. Поскольку иммуноферментный анализ (ИФА) обладает низкой чувствительностью при диагностике на ранних сроках заболевания корью, когда пациент наиболее заразен, необходимы прямые методы выявления вируса [1–3]. Наиболее эффективным из таких методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР) благодаря ее высокой чувствительности и специфичности. Метод ПЦР рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для обнаружения вируса кори в продромальный период заболевания и в течение 14 дней после появления сыпи1.
В 2024 г. в Российской Федерации были обновлены клинические рекомендации по ведению больных корью, включившие метод ПЦР с целью идентификации вируса кори и подтверждения диагноза у всех пациентов с подозрением на коревую инфекцию (подозрительный или вероятный случай), а также у детей, рожденных от матерей, переболевших корью в третьем триместре беременности2. Единственным зарегистрированным в России (2022 г.) набором для молекулярной диагностики кори является «АмлиТест Корь». Позднее в ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России) был разработан набор реагентов на основе метода петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) для выявления РНК вируса кори, обладающий аналитическими характеристиками, не уступающими зарегистрированному набору на основе ПЦР, и значительно превосходящий его по скорости анализа [
Однако методы изотермической амплификации до сих пор не получили широкого распространения в клинической практике. Это связано с новизной метода и малым количеством работ, демонстрирующих его эффективность в выявлении высоковариабельных матриц. Несмотря на активное применение LAMP во время пандемии SARS-CoV-2 [
В случае вариабельных вирусов полная комплементарность между нуклеотидными последовательностями праймеров и матрицей практически недостижима независимо от метода амплификации. Возникающие несоответствия могут приводить к снижению чувствительности анализа вплоть до получения ложноотрицательных результатов. Влияние мутаций на эффективность ПЦР было многократно показано для различных матриц [
Цель работы — оценить частоту встречаемости мутаций в местах связывания праймеров и их влияние на эффективность методов ПЦР и LAMP в выявлении РНК вируса кори.
Были исследованы 69 клинических образцов носоглоточного секрета, полученных в 2024 г. из лабораторий АО «ЛабКвест» (Москва, Россия), в которые образцы поступали из различных клиник Российской Федерации. Все образцы имели положительные результаты на наличие в них РНК вируса кори, полученные с использованием набора реагентов «АмплиТест Корь» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России).
Экстракцию РНК вируса кори проводили с использованием набора реагентов «АмплиТест РИБО-преп» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России).
ПЦР, совмещенную с обратной транскрипцией, проводили с помощью набора реагентов «АмплиТест Корь» согласно инструкции производителя. Реакцию LAMP, совмещенную с обратной транскрипцией, выполняли c использованием методики, описанной ранее [
Для выявления мутаций в местах связывания праймеров с матрицей все клинические образцы секвенировали по Сэнгеру с использованием набора BigDye™ Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific, США) и генетического анализатора Applied Biosystems 3500 (Thermo Fisher Scientific, США). Использовали пару праймеров, ограничивающих область амплификации вируса кори обоими методами (ПЦР и LAMP): tagtyggtgaatttagattggag и caaagtaagatcgaccraagttc (длина ампликона 458 п.н.). Дополнительно полученные нуклеотидные последовательности использовали для генотипирования вируса кори.
Из базы данных Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI)3 были выгружены все последовательности гена N вируса кори (15476 последовательностей на конец апреля 2025 г.). Проводили множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей с помощью программы MAFFT4. Выравнивание обрезали по области праймеров, используемых для секвенирования по Сэнгеру, с использованием программы Jalview 2.15 и повторно выравнивали (MAFFT), удаляя пустые и неполные последовательности. В итоге было получено 1080 последовательностей, содержащих область амплификации РНК вируса кори двумя методами (ПЦР и LAMP).
Для анализа каждого праймера выравнивание обрезали по области того или иного праймера или зонда. Кластеризацию последовательностей каждого праймера проводили с помощью программы CD-HIT-v4.8.1-2019-02286 (порог идентичности — 100%). Кластеры ранжировали по числу включенных в них представителей в порядке убывания. Кластеры с одной последовательностью исключали. Если олигонуклеотид содержал инозин или вырожденный нуклеотид, то такая позиция не считалась мисмэтчем (несоответствием, несовпадением).
Для построения филогенетического дерева полученное в MAFFT выравнивание 15 476 последовательностей обрезали справа по 1596 нуклеотиду полногеномной последовательности, а слева по 721 нуклеотиду (граница левого праймера, используемого для секвенирования). Последовательности короче заданного порога исключали из анализа. В итоге осталось 1078 последовательней, включающих области, фланкированные диагностическими праймерами, и регион N-гена, рекомендуемый для генотипирования вируса кори [
Для генотипирования клинических образцов использовали программу Nextclade v3.18.09.
Для оценки репрезентативности выборки проанализированных нами нуклеотидных последовательностей генома вируса кори из базы данных NCBI был проведен анализ их генотипической принадлежности и актуальности. Филогенетический анализ (рис. S1, опубликован на сайте журнала10) показал равномерное распределение последовательностей по всем известным генотипам, включая актуальные (выявленные за последние 12 мес. на момент последнего обновления номенклатуры 20.05.2015 [
В результате анализа 1080 нуклеотидных последовательностей генома вируса кори были получены данные по частоте встречаемости и положению мутаций для каждого праймера.
Согласно полученным данным для праймеров и зонда, используемых в ПЦР (рис. S2, опубликован на сайте журнала11), 85,5% последовательностей полностью комплементарны прямому праймеру, 88% — обратному праймеру и 98,8% — зонду. Более одной замены в областях прямого, обратного праймера или зонда обнаружено не было. Мутации в большинстве случаев значительно отстоят от 3'-конца праймера и 5'-конца зонда (рис. 2). Наиболее близко к 3'-концу прямого праймера расположены мутации в кластерах 2 и 4, а обратного — в кластерах 1 и 3. Для зонда абсолютное большинство последовательностей являются консервативными.
Для праймеров, используемых в LAMP (рис. S3, опубликован на сайте журнала12), была показана бóльшая вариабельность в местах посадки праймеров по сравнению с методом ПЦР. Однако подавляющее большинство последовательностей не имело мутаций или имело только одну мутацию в местах посадки праймеров. Для внешних праймеров F3 и B3 99,4 и 99,3% последовательностей соответственно консервативны области выбранных праймеров или содержали только одну мутацию. Праймеры FIP (прямой внутренний праймер) и BIP (обратный внутренний праймер) имеют по два сайта связывания с матрицей (F1c и F2, B1c и B2 соответственно). Они взаимодействуют с противоположными цепями ДНК и поэтому оценивались как два отдельных олигонуклеотида. Праймеры FIP и BIP показали высокую консервативность: для областей F1c и F2 праймера FIP — 99,3 и 99,5%, а для областей B1c и B2 праймера BIP — 96,5 и 99,7% последовательностей были полностью консервативны выбранным праймерам либо имели всего одну замену. Петлевые праймеры LF (прямой петлевой праймер) и LB (обратный петлевой праймер) также высоко консервативны: 99,5% последовательностей для LF и 96,7% последовательностей для LB имели не более одной замены.
Анализ 69 клинических образцов с использованием разработанного набора на основе метода LAMP и набора реагентов на основе ПЦР («АмлиТест Корь») показал высокую сходимость результатов (98,6%), что согласуется с нашими предыдущими данными [
После секвенирования и анализа нуклеотидных последовательностей с помощью программы CD-HIT с порогом идентичности 100% все образцы разделили на 5 кластеров. Использованные нами праймеры для секвенирования охватывают общую область расположения праймеров для обоих методов (нуклеотиды 721–1179 полногеномной последовательности). По данным программы Nextclade v3.18.0, один кластер был отнесен к генотипу В3 (18 образцов — 26,5% от всех изученных изолятов), остальные 4 кластера — к генотипу D8.
Детальный анализ по каждому олигонуклеотиду, входящему в состав реакционной смеси ПЦР, выявил только одну мутацию для прямого праймера ПЦР в 23 положении относительно 3'-конца, что соответствует кластеру 3 на рисунке S2. Для олигонуклеотидов, используемых в LAMP, было выявлено по одной мутации в трех из восьми анализируемых фрагментах (табл. 1), все они соответствовали кластерам 1 и 2 на рисунке S2.
Таблица 1. Мутации в местах посадки праймеров и зонда, выявленные в нуклеотидных последовательностях вируса кори, выделенных из клинических образцов
Table 1. Mutations in primers and probe sites identified in the nucleotide sequences of measles virus isolated from clinical samples
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. LAMP — петлевая изотермическая амплификация; «–» отсутствие мутаций в месте посадки праймеров или зонда.
Note. LAMP, loop-mediated isothermal amplification; –, no mutations in primer binding sites or probe.
| Метод Method | Последовательность праймера Primer sequence | Тип несоответствия Mismatch type | Расстояние от 3'-конца праймера Distance from 3'-end primer | % последовательностей % of sequences | Количество образцов Samples count | Кластер Cluster |
| ПЦР PCR | Прямой праймер / Forward primer ctgacyattaagtttgggatagara | – | – | 77,9 | 53 | – |
| G→A | 23 | 22,1 | 15 | 3 | ||
| Обратный праймер / Backward primer tatcmacacttgagtccytgatg | – | – | 100 | 68 | – | |
| Зонд / Probe atgtaycctgctctyggactgcatg | – | – | 100 | 68 | – | |
| LAMP | Прямой праймер / Forward primer F3: ccgaaatgatatgygacattga | – | – | 73,5 | 50 | – |
| C→T | 21 | 26,5 | 18 | 1 | ||
| Обратный праймер / Backward primer B3: gagaactcaattcagaacaag | – | – | 100 | 68 | – | |
| Обратный праймер / Backward primer FIP(F1c): tcttggactgcatgaatttgc | – | – | 100 | 68 | – | |
| Прямой праймер / Forward primer FIP(F2): ggcaggaytagccagt | – | – | 100 | 68 | – | |
| Прямой праймер / Forward primer BIP(B1c): ggtgagttatccacacttgagtc | – | – | 73,5 | 50 | – | |
| G→A | 18 | 26,5 | 18 | 1 | ||
| Обратный праймер / Backward primer BIP(B2): gaaactgcaccctayatg | – | – | 73,5 | 50 | – | |
| A→G | 3 | 26,5 | 18 | 2 | ||
| Обратный праймер / Backward primer LF: tgggatagaaactatgtaycctgc | – | – | 100 | 68 | – | |
| Прямой праймер / Forward primer LB: tgatgaatctttaccagcaaatgg | – | – | 100 | 68 | – |
Для оценки влияния мутаций на чувствительность методов были отобраны 3 образца с мутациями в местах посадки праймеров для LAMP (образцы 18а, 31а и 32а, по 3 мутации в каждом образце, табл. 2) и 3 образца с мутациями в местах посадки праймеров для ПЦР (образцы 19а, 22а и 30а, 1 мутация в прямом праймере в каждом образце, табл. 3). При этом образцы с мутациями в местах посадки праймеров LAMP не имели мутаций в местах посадки праймеров, используемых в ПЦР, и наоборот. Тестирование 10-кратных разведений РНК, выделенных из этих образцов (табл. 2, 3), показало бóльшую чувствительность метода ПЦР по сравнению с методом LAMP. Число разведений РНК, прошедших в исследовании как положительные, в ПЦР было больше на 1–2 порядка, чем в LAMP, даже при наличии мутаций в местах посадки праймеров, что согласуется с ранее полученными данными [
Таблица 2. Результаты ПЦР и LAMP при тестировании 10-кратных разведений РНК вируса кори с мутациями в местах связывания праймеров для метода LAMP
Table 2. PCR and LAMP results for 10-fold dilutions of measles virus RNA with mismatches in LAMP primer binding sites
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. LAMP — петлевая изотермическая амплификация; Ct — пороговый цикл; отриц. — значение Ct не определено.
Note. LAMP, loop-mediated isothermal amplification; Ct, threshold cycle; neg., threshold cycle not determined.
| Разведение Dilution | Образцы с мутациями в местах связывания праймеров LAMP Samples with mutations in LAMP primers binding sites | |||||
| 18a | 31а | 32а | ||||
| LAMP, Сt | ПЦР, Сt / PCR, Сt | LAMP, Сt | ПЦР, Сt / PCR, Сt | LAMP, Сt | ПЦР, Сt / PCR, Сt | |
| 10⁻¹ | 8,31 | 20,21 | 8,25 | 20,14 | 12,28 | 24,31 |
| 10⁻² | 10,37 | 23,79 | 10,51 | 23,80 | 22,87 | 28,43 |
| 10⁻³ | 17,25 | 27,91 | 21,01 | 28,22 | Отриц. / Neg. | 32,62 |
| 10⁻⁴ | 19,46 | 31,89 | Отриц. / Neg. | 31,33 | Отриц. / Neg. | 33,84 |
| 10⁻⁵ | Отриц. / Neg. | 33,35 | Отриц. / Neg. | 34,39 | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
Таблица 3. Результаты ПЦР и LAMP при тестировании 10-кратных разведений РНК вируса кори с мутациями в местах связывания праймеров для метода ПЦР
Table 3. PCR and LAMP results for 10-fold dilutions of measles virus RNA with mismatches in PCR primer binding sites
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. LAMP — петлевая изотермическая амплификация; Ct — пороговый цикл; отриц. — значение Ct не определено.
Note. LAMP, loop-mediated isothermal amplification; Ct, threshold cycle; neg., threshold cycle not determined.
| Разведение Dilution | Образцы с мутациями в местах связывания праймеров ПЦР Samples with mismatches in PCR primer binding sites | |||||
| 19a | 22а | 30а | ||||
| LAMP, Сt | ПЦР, Сt / PCR, Сt | LAMP, Сt | ПЦР, Сt / PCR, Сt | LAMP, Сt | ПЦР, Сt / PCR, Сt | |
| 10⁻¹ | 4,91 | 19,18 | 20,13 | 20,14 | 6,33 | 23,36 |
| 10⁻² | 6,27 | 22,82 | 24,24 | 23,80 | 7,49 | 27,15 |
| 10⁻³ | 9,66 | 27,52 | 28,32 | 28,22 | 11,21 | 31,63 |
| 10⁻⁴ | 17,88 | 31,15 | 32,00 | 31,33 | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
| 10⁻⁵ | Отриц. / Neg. | 35,12 | Отриц. / Neg. | 34,39 | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
Для изучения влияния выявленных мутаций на чувствительность обоих методов все представленные в таблице 1 мутации были внесены в последовательности праймеров (один праймер для ПЦР и четыре для LAMP) таким образом, чтобы новые праймеры стали полностью или частично комплементарны последовательностям с мутациями. Последующее тестирование 10-кратных разведений РНК шести ранее отобранных образцов с мутациями проводили для оценки влияния мутаций на скорость и чувствительность ПЦР и LAMP. Использовали смеси со стандартными праймерами из наборов реагентов (смесь А) и с модифицированными праймерами (смеси B, C, D, F, G) (табл. 4).
Таблица 4. Праймеры, используемые в реакционных смесях для LAMP и ПЦР
Table 4. Primers for LAMP and PCR mixes
Таблица составлена авторами / The table was prepared by the authors
Примечание. LAMP — петлевая изотермическая амплификация. Жирным шрифтом выделены внесенные в праймеры мутации, выявленные в клинических образцах.
Note. LAMP, loop-mediated isothermal amplification. Mutations introduced in the primers and identified in clinical samples are highlighted in bold.
| Смесь Mix | Праймер Primer | 5'–3'-последовательность 5'–3'-sequence | Метод Мethod |
| B | Forward mut | ctaacyattaagtttgggatagara | ПЦР/ PCR |
| C | F3 mut | ctgaaatgatatgygacattga | LAMP |
| D | BIP mut | ggtgaattatccacacttgagtcttttcatrtagggtgcagtctc | |
| F | MlBIPmod1 | ggtgaattatccacacttgagtcttttcatrtagggtgcagtttc | |
| G | MlBIPmod2 | ggtgagttatccacacttgagtcttttcatrtagggtgcagtctc |
В ПЦР (табл. 5) использование смеси B с модифицированным праймером увеличило число разведений РНК, прошедших в исследовании как положительные, на порядок для одного из трех образцов, а для двух других различий не было выявлено. При этом для предельных разведений с положительным результатом наблюдалось наибольшее отставание по пороговым циклам в случае мисмэтча, что может указывать на снижение чувствительности метода при тестировании низких концентраций вируса.
Таблица 5. Результаты ПЦР для 10-кратных разведений РНК вируса кори с мутациями в местах посадки праймеров
Table 5. PCR results for 10-fold dilutions of measles virus RNA with mutations in primer binding sites
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. Ct — пороговый цикл; отриц. — значение Ct не определено. А — реакционная смесь со стандартными праймерами из набора реагентов; B — реакционная смесь с модифицированными праймерами.
Note. Ct, threshold cycle; neg., threshold cycle not determined. A, standard mix with primers from the reagent kit; B, mix with modified primers.
| Разведение образца Sample dilution | ПЦР, Сt / PCR, Сt | |||||
| Образец 22a / Sample 22а | Образец 19a / Sample 19а | Образец 30a / Sample 30а | ||||
| Смесь А / Mix А | Смесь B / Mix B | Смесь A / Mix А | Смесь B / Mix B | Смесь A / Mix А | Смесь B / Mix B | |
| 10⁻¹ | 21,68 | 20,46 | 20,72 | 19,23 | 25,61 | 24,08 |
| 10⁻² | 27,88 | 26,00 | 25,78 | 24,23 | 31,81 | 29,12 |
| 10⁻³ | 35,34 | 32,08 | 33,03 | 29,78 | Отриц. / Neg. | 35,70 |
| 10⁻⁴ | 40,51 | 36,61 | 38,16 | 34,32 | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
| 10⁻⁵ | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
В LAMP (табл. 6) праймер F3 (смесь С) практически не оказывал влияние на скорость реакции. При использовании праймера BIP с мутацией только в сайте В1с (смесь F) разницы в скорости реакции и чувствительности также не наблюдалось. Неожиданные результаты были получены при использовании праймера BIP с одной мутацией в сайте В2 (смесь G) и с двумя внесенными мутациями (смесь D): в обоих случаях праймеры сработали аномально хуже, приведя к уменьшению чувствительности и скорости реакции, несмотря на то что праймер с двумя мутациями был полностью комплементарен исследуемым образцам.
Таблица 6. Результаты LAMP для 10-кратных разведений РНК вируса кори с мутациями в местах посадки праймеров
Table 6. LAMP results for 10-fold dilutions of measles virus RNA with mismatches in primer binding sites
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. LAMP — петлевая изотермическая амплификация; Ct — пороговый цикл; отриц. — значение Ct не определено. А — реакционная смесь со стандартными праймерами из набора реагентов; C, D, F, G — реакционные смеси с модифицированными праймерами.
Note. LAMP, loop-mediated isothermal amplification; Ct, threshold cycle; neg., samples threshold cycle not determined. A, standard mix with primers from the reagent kit; C, D, F, G, mixes with modified primers.
| Разведение образца Sample dilution | LAMP, Сt | ||||
| Образец 18а / Sample 18а | |||||
| Смесь А / Mix А | Смесь C / Mix C | Смесь D / Mix D | Смесь F / Mix F | Смесь G / Mix G | |
| 10⁻¹ | 11,22 | 13,33 | 30,03 | 11,18 | 32,44 |
| 10⁻² | 13,10 | 21,15 | 36,76 | 14,53 | Отриц. |
| 10⁻³ | 14,72 | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
| Образец 31а / Sample 31а | |||||
| 10⁻¹ | 11,55 | 13,59 | 29,6 | 11,34 | 32,49 |
| 10⁻² | 13,40 | 20,15 | 35,56 | 14,62 | 36,76 |
| 10⁻³ | 26,35 | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | 36,76 | Отриц. / Neg. |
| Образец 32а / Sample 32а | |||||
| 10⁻¹ | 14,02 | 14,02 | 34,69 | 14,87 | 38,01 |
| 10⁻² | 21,67 | 16,46 | Отриц. / Neg. | 22,29 | Отриц. / Neg. |
| 10⁻³ | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. | Отриц. / Neg. |
Молекулярно-генетические методы (ПЦР и LAMP) играют важную роль в ранней диагностике кори, когда пациент наиболее заразен, а ИФА малоинформативен [
Тем не менее несоответствия между праймером и матрицей неизбежны независимо от используемой методики. Любое несовпадение в последовательности праймера снижает термическую стабильность дуплекса праймера и матрицы и может влиять на чувствительность ПЦР или LAMP.
В настоящей работе мы оценили частоту встречаемости мутаций в местах посадки праймеров и зонда, используемых в наборах реагентов на основе LAMP и ПЦР для выявления РНК вируса кори. В отличие от нашего предыдущего исследования, в котором было проанализировано 696 полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса кори [
Согласно полученным данным, более 99% последовательностей полностью комплементарны праймерам, используемым в ПЦР, или имеют только одну замену в местах их посадки. Для LAMP была показана чуть большая вариабельность в области посадки праймеров: 96,5% последовательностей, представленных в базе данных NCBI, комплементарны праймерам или содержат единичные мутации. Таким образом, нам удалось выбрать не только максимально консервативную область в гене нуклеопротеина (919–1008 — для ПЦР, 860–1071 — для LAMP), но и подобрать праймеры, которые могут эффективно выявлять РНК вируса кори в клинических образцах обоими методами, независимо от генотипа.
Анализ последовательностей вируса кори, полученных из клинических образцов от пациентов в Российской Федерации, показал наличие одной мутации в области посадки прямого праймера для ПЦР и по одной мутации в областях праймеров F3 и BIP (B1c и B2) для LAMP. В модельных экспериментах было показано небольшое снижение чувствительности ПЦР в случае единичной мутации при крайне низких концентрациях вируса. Несмотря на расположение мутации в прямом праймере достаточно далеко от 3'-конца праймера (23‑е положение), в крайних разведениях РНК наблюдалось отставание примерно на 4 цикла, где эта мутация присутствовала, а для одного из трех образцов число разведений РНК с положительным результатом было на одно больше при использовании полностью комплементарного прямого праймера.
В случае использования метода LAMP для выявления РНК вируса кори нами установлено, что замены во внешних праймерах F3 и B3, используемых для инициации реакции, не влияют на скорость и чувствительность реакции, что согласуется с данными литературы [
Молекулярно-генетические методы — ПЦР и LAMP — эффективно выявляют РНК вируса кори в клинических образцах независимо от генотипа. При использовании метода ПЦР в большинстве случаев одиночные мутации мало влияли на эффективность амплификации, что согласуется с нашими предыдущими данными по диагностике ВИЧ. В случае LAMP одиночные мутации также в большинстве случаев не влияли на чувствительность анализа, однако влияние структуры петлевых праймеров на скорость реакции требует дальнейшего изучения.
Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены рисунки S1–S3.
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s1
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s2
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s3
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Г.М. Цыганова — планирование и проведение экспериментальной части работы с клиническим материалом, обработка данных, анализ результатов, написание текста рукописи; Е.Д. Богословская — работа с базами данных, биоинформатический анализ; Г.А. Шипулин — дизайн исследования, редактирование текста рукописи; О.Ю. Шипулина — сбор клинического материала; Е.В. Богословская — дизайн исследования, формулировка выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации.
Additional information. Figures S1–S3 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s1
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s2
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s3
Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. G.M. Tsyganova performed the experiments, processed data, analysed the results, and drafted the manuscript. E.D. Bogoslovskaya processed databases and performed bioinformatics analysis. G.A. Shipulin designed the study and edited the article. O.Yu. Shipulina performed the experiments. E.V. Bogoslovskaya designed the study, formulated the conclusions and approved the final version for publication.
1. Surveillance guidelines for measles, rubella and congenital rubella syndrome in the WHO European Region. Update December 2012. WHO Regional Office for Europe; 2012. 2. Клинические рекомендации (утв. Министерством здравоохранения Российской Федерации). 2024. 3. GenBank. National Library of Medicine. National Center for Biotechnology Information. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank 4. https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/large.html 5. https://www-test.jalview.org/development/archive/Version-2_1/ 6. https://usegalaxy.eu/?tool_id=cd_hit 7. https://www.megasoftware.net/ 8. https://www.researchgate.net/figure/FigTree-v143-http-treebioedacuk-software-figtree-Phylogenetic-analysis-of-E1_fig1_353848815 9. https://clades.nextstrain.org/ 10. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s1 11. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s2 12. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-75-84-fig-s3
The authors declare that there are no conflicts of interest present.