biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107biopreparat-720Research ArticleТема номера: ИННОВАЦИОННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ: ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ К РЕАЛЬНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕIssue topic INNOVATIVE BIOLOGICAL PRODUCTS: TRANSLATING FUNDAMENTAL RESEARCH INTO REAL CLINICAL PRACTICEСтандартизация микробиологического метода выявления микоплазменной контаминации в биологических лекарственных препаратах: разработка стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8Standardizing microbiological method to detect mycoplasma contamination in biological products: development of Acholeplasma laidlawii PG8 reference standardhttps://orcid.org/0000-0001-6621-4384СухановаС. М.SukhanovaS. M.
Суханова Светлана Михайловна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Svetlana M. Sukhanova, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
suhanovasm@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9865-4250БердниковаЗ. Е.BerdnikovaZ. E.
Бердникова Зинаида Евтропиевна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Zinaida E. Berdnikova, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
https://orcid.org/0000-0002-8473-7442ФадейкинаО. В.FadeikinaO. V.
Фадейкина Ольга Васильевна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Olga V. Fadeikina, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation20260104202626197107Copyright © Суханова С.М., Бердникова З.Е., Фадейкина О.В., 20262026Суханова С.М., Бердникова З.Е., Фадейкина О.В.Sukhanova S.M., Berdnikova Z.E., Fadeikina O.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/720ВВЕДЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. Выявление микоплазм является одной из наиболее сложных проблем при контроле микробной контаминации биологических лекарственных препаратов (БЛП). Для обнаружения микоплазм в БЛП и стандартизации микробиологического метода контроля необходимы высокочувствительные питательные среды и фармакопейные стандартные образцы (ФСО) тест-штаммов различных видов микоплазм.
ЦЕЛЬ
ЦЕЛЬ. Разработка и аттестация нового фармакопейного стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8 для проведения испытаний биологических лекарственных препаратов на присутствие микоплазм микробиологическим методом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Разработку ФСО проводили согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) с использованием штамма A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116), питательной среды Каган, сыворотки крови лошади. Аттестация ФСО включала определение значения титра штамма A. laidlawii PG8 методом наиболее вероятных чисел и испытания по следующим показателям качества: «Описание», «Наличие вакуума», «Время растворения», «Внешний вид растворенного образца», «Стерильность», «Потеря в массе при высушивании», «Однородность массы (средняя масса и отклонение от средней массы)».
РЕЗУЛЬТАТЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведена разработка ФСО A. laidlawii PG8 и составлена спецификация ФСО. Приготовлены лиофилизированные образцы основного и рабочего банков культуры A. laidlawii PG8. Установлено, что процедура лиофилизации не оказывает существенного воздействия на жизнеспособность штамма. Показана стабильность значений титра штамма (10⁸ КОЕ/мл), культуральных и физико-химических свойств образцов по критически важным для обеспечения качества и надежности показателям в течение двух лет хранения при температуре минус 20–30°С. Аттестованы три серии ФСО A. laidlawii PG8. Значения титра серий ФСО варьировались от 10×10⁸ до 21×10⁸ КОЕ/мл. Показана сопоставимость разработанного ФСО со стандартным образцом Европейской фармакопеи BRP A. laidlawii, серия 1 (титр 2,45×10⁶ КОЕ/мл). На основании результатов исследований ФСО A. laidlawii PG8 включен в Реестр ФСО ГФ РФ.
ВЫВОДЫ
ВЫВОДЫ. Разработан и аттестован новый ФСО A. laidlawii PG8. ФСО может быть использован для оценки ростовых свойств питательных сред, определения наличия ингибирующего действия, а также в качестве положительного контроля при испытаниях БЛП и биологических материалов, применяемых в их производстве, на присутствие микоплазм микробиологическим методом согласно требованиям ГФ РФ. Внедрение ФСО будет способствовать стандартизации и повышению качества контроля БЛП, а также гармонизации требований ГФ РФ с международными стандартами.
INTRODUCTION
INTRODUCTION. Mycoplasmas are one of the most challenging types of microbial contamination to detect in biological products (BP). Detecting micoplasmas in the BPs and standardizing microbiological control method necessitates highly sensitive culture media and pharmacopeial reference standards (RS) for test strains of various mycoplasmas.
AIM
AIM. This study aimed to develop and certify the new pharmacopeial reference standard Acholeplasma laidlawii PG8 for mycoplasma identification in the BPs using the microbiological method.
MATERIALS AND METHODS
MATERIALS AND METHODS. A. laidlawii PG8 (NCPМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116) strain, Kagan's medium, and horse serum was used to develop the reference standard in compliance with the State Pharmacopoeia of the Russian Federation (SP RF). The certification included determination of strain titre by the most probable number method and quality tests for: Description, Vacuum, Reconstitution time, Description of dissolved sample, Sterility, Loss on drying, and Mass homogeneity (average mass and average deviation).
RESULTS
RESULTS. Development and specification of A. laidlawii PG8 reference standard was completed. Lyophilised samples of the master and working bank of A. laidlawii PG8 strain culture were prepared. It was established that the lyophilization process does not significantly affect strain viability. The stability of strain titers (108 CFU/mL), cultural, and physicochemical properties of the samples was demonstrated for critical quality and reliability indicators during two years of storage at -20 to -30°C. Three batches of A. laidlawii PG8 RS were certified. The calculated titer values ranged from 10×108 to 21×108 CFU/mL. The pharmacopoeial reference standard is found to be comparable to the European Pharmacopoeia reference standard A. laidlawii BRP, batch 1 (titer 2.45×106 CFU/mL). As a result of the conducted research, A. laidlawii PG8 RS was included in the Register and Collection of Reference Standards of the Russian Pharmacopoeia.
CONCLUSIONS
CONCLUSIONS. A new A. laidlawii PG8 reference standard has been developed and certified that can be used to evaluate the nutritive properties of culture media; determine the inhibitory effects; and serve as a positive control in BP and material tests for the presence of mycoplasmas using the microbiological method in accordance with SP RF requirements. Introducing the new RS will contribute to standardization and improve BP control, as well as harmonization of the Russian compendial requirements with the international standards.
микоплазмыAcholeplasma laidlawiiмикробная контаминациябиологические лекарственные препаратыконтроль качествастандартный образецФСОмикробиологический методпитательная средастандартизациягармонизацияmycoplasmaAcholeplasma laidlawiimicrobial contaminationbiological productsquality controlreference standardpharmacopoeial reference standardmicrobiological methodculture mediastandardizationharmonizationРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00061-26-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 124022200103-5)This study was conducted by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00061-26-00 (R&D Registry No. 124022200103-5)ВВЕДЕНИЕ
Надежность и достоверность выявления микоплазменной контаминации на всех этапах производства биологических лекарственных препаратов (БЛП) необходимы для обеспечения их качества и безопасности. Микоплазмы способны инфицировать клеточные культуры и вакцинные препараты, изменяя характеристики культуры, используемой для производства вакцин, и конечного продукта, что обусловливает необходимость применения особых приемов для их выявления1 [1–6].
Государственная фармакопея Российской Федерации (ГФ РФ)2, Европейская фармакопея3, Фармакопея США4, Британская5, Индийская6 и Китайская фармакопеи7 рекомендуют для обнаружения микоплазм в загрязненных клеточных субстратах и вирусных штаммах применять метод прямого культивирования и метод индикаторной клеточной культуры. Международные экспертные организации, включая Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ)8, Европейское агентство по лекарственным средствам (European Medicines Agency)9, Международный совет по гармонизации технических требований к лекарственным средствам для медицинского применения (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)10, рассматривают метод прямого культивирования как основной для тестирования банка клеток, посевной партии вирусов, контрольных клеточных культур, контроля вирусного сбора, нерасфасованной (bulk) партии или готовой серии вакцины11 [4].
Проведение испытаний предполагает использование питательных сред, характеристики которых зависят от качества биологических компонентов, что влияет на результаты. Поэтому обязательным условием испытаний является достаточный рост штаммов микоплазм на выбранной питательной среде (ПС). Используемые микроорганизмы должны представлять распространенные виды-контаминанты клеточных культур [7]: Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, M. hyorhinis, M. orale, M. pneumonia, M. synoviae. Для адекватной оценки исследуемых образцов в качестве тест-штаммов рекомендуется применять микроорганизмы, выделенные из патогенного материала, или использовать соответствующие фармакопейные стандартные образцы (ФСО), например стандартные образцы (СО) биологических препаратов Европейской фармакопеи (biological reference preparations, BRP)12 с ограниченным числом пассажей [8]. Стандартизация методов контроля БЛП и материалов, используемых в процессе их производства, представляет собой эффективный способ обеспечения качества и безопасности выпускаемого продукта13. Применение СО для оценки пригодности ПС и определения наличия антимикробного действия самого БЛП позволяет повысить сопоставимость и воспроизводимость результатов для более полной и объективной оценки качества, а также упростить процедуру анализа.
Согласно требованиям ГФ РФ для проведения испытания на присутствие микоплазм рекомендовано использовать СО штаммов, прежде всего Mycoplasma arginini G230, или, в зависимости от типа испытуемого препарата, другие виды микоплазм14, которые на российском рынке отсутствуют. Ранее авторы обосновали необходимость расширения спектра новых СО штаммов, включая широко распространенный штамм, ферментирующий D-глюкозу, и устойчивый к антибиотикам A. laidlawii [9].
Создание новых российских ФСО тест-штаммов микоплазм в условиях ограниченного доступа к зарубежным СО является актуальной задачей. Ее решение позволит усовершенствовать существующую методику испытаний и гармонизировать требования ГФ РФ с международными стандартами.
Цель работы — разработка и аттестация нового фармакопейного стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8 для проведения испытаний БЛП на присутствие микоплазм микробиологическим методом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫМатериалы
В работе использовали штамм A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116) из коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России), полученный из лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (штамм предоставлен Aarhus University, Дания). Использовали лиофилизированные образцы серии «0» (основной банк) и трех рабочих серий кандидата в ФСО — тест-штамма A. laidlawii PG8 (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России); питательные среды: жидкую и полужидкую Каган (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России), согласно требованиям ГФ РФ15; сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм (кат. № 1.1.5.2, ООО «БиолоТ», Россия); ФСО.3.2.00378 М. arginini 230 с действующим сроком годности (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России); стандартный образец Европейской фармакопеи BRP A. laidlawii, серия 116.
Оборудование
Использовали аттестованное оборудование: термостат ТС-1/20 СПУ («Смоленское СКТБ СПУ», Россия); термошкаф (инкубатор) тип B 115 (Binder GmbH); шкаф ламинарный II класса БАВп-01-1,2 (ЗАО «Ламинарные системы», Россия); морозильная камера «Саратов 127» (ООО «СЭПО-ЗЭМ», Россия); дозатор пипеточный с переменным объемом доз, одноканальный (ДПОПц-1-10-5000, ООО «Ленпипет», Россия).
Методы
Лиофилизацию культуры штамма A. laidlawii PG8 проводили на аппарате Epsilon 2-4 LSCplus (Martin Christ, Германия). Образцы хранили при температуре минус 20–30°С.
Качество лиофилизированных образцов оценивали по следующим показателям:
Значение титра (количественный показатель концентрации живых клеток) определяли на полужидкой ПС методом наиболее вероятных чисел (НВЧ), используя десятикратные разведения. Каждое разведение высевали в три пробирки и инкубировали при температуре 37±1°С в течение 7 сут. Регистрировали предельные контрольные разведения, в которых отмечали наличие роста микоплазм, принимая их за значение титра. Расчет титра проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди21. При аттестации титр штамма серии «0» (основной банк) устанавливали посевом 10 образцов на двух партиях ПС, а трех рабочих серий — посевом 5 образцов с последующим расчетом среднего арифметического значения КОЕ/мл.
Критерии приемлемости результатов значения титра. С учетом специфики методики и изменчивого состава ПС значения коэффициента титра в пределах одного порядка (например, 2,5×10⁸, 4,5×10⁸) считали сопоставимыми. Анализ проводили по значениям контрольных разведений (не менее 10⁷) без учета коэффициента.
Оценку стабильности образцов проводили после лиофилизации и через 6, 12, 18 и 24 мес. хранения при температуре минус 20–30°С.
Ростовые свойства питательных сред определяли согласно требованиям ГФ РФ22 с использованием ФСО.3.2.00378 М. arginini 230.
Статистическая обработка результатов. Рассчитывали среднее арифметическое значение (Хср) НВЧ микроорганизмов и относительное стандартное отклонение [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕАнализ стандартного образца Европейской фармакопеи A. laidlawii
С учетом значимости Европейской фармакопеи для гармонизации российских фармакопейных стандартов в работе были определены основные характеристики BRP A. laidlawii23. Экспертный совет Европейской фармакопеи рекомендовал его в качестве тестового микроорганизма для проверки ростовых свойств ПС при испытании методом прямого посева, особенно для вакцин, в производстве которых использовались антибиотики24. Установлено, что BRP A. laidlawii, серия 1, представляет собой замороженную суспензию штамма, прошедшего менее 15 пассажей от исходного клона, выделенного из культуры кератиновых клеток [8]. Предполагаемый расчетный титр серии составляет 2,45×10⁶ КОЕ/мл, с допустимым диапазоном от 3,89×10⁵ до 1,55×10⁷ КОЕ/мл, в условиях хранения при температуре не выше минус 60°С. При подготовке к испытанию в образце подтверждают титр и используют установленное разведение (согласно Европейской фармакопее, не более 100 КОЕ) для посева на ПС.
Приготовление и изучение свойств образцов штамма A. laidlawii PG8 серии «0» — кандидата в ФСО
Для получения серии кандидата в ФСО лиофилизированную культуру штамма A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116) инкубировали в ПС с сывороткой крови лошади при температуре 37±1°С. Через 24–48 ч наблюдали микробный рост, характеризующийся незначительным помутнением и равномерной опалесценцией среды по сравнению с прозрачной контрольной средой . Морфологические свойства соответствовали паспортным данным штамма25.
Для накопления биомассы культуру инкубировали до 4 сут, отмечая при этом увеличение помутнения (рис. 1). Затем полученную суспензию разделяли на аликвоты объемом 1 мл и подвергали лиофилизации. Приготовленные образцы герметизировали и хранили при температуре минус 20–30°С. Изучали морфологические свойства и определяли титр образцов штамма до и после лиофилизации согласно ГФ РФ на полужидкой ПС Каган26. Значения титра, рассчитанного на двух партиях ПС до и после лиофилизации, представлены в таблицах 1 и S1 (опубликована на сайте журнала27).
Фотография выполнена авторами / The photograph was taken by the authors
Рис. 1. Рост штамма A. laidlawii PG8 серии «0» на жидкой питательной среде Каган: 1 — контроль (незасеянная среда), 2 — культура A. laidlawii PG8.
Fig. 1. Growth of A. laidlawii PG8 strain (series "0") on liquid Kagan’s medium: 1, control (uninoculated medium), 2, A. laidlawii PG8 culture.
Для оценки влияния лиофилизации на концентрацию штамма проведен сравнительный анализ титра для исходного образца и образца, подвергшегося процедуре лиофилизации. Анализ показал незначительные различия полученных значений в пределах одного порядка: от 2,5×10⁸ до 15,0×10⁸ КОЕ/мл до лиофилизации и от 5,2×10⁸ до 9,3×10⁸ КОЕ/мл после лиофилизации (табл. 1, S1). Это свидетельствует о приемлемости и сходимости полученных результатов. При оценке влияния среды (две партии ПС) показана стабильность среднего значения НВЧ на уровне около 108 КОЕ/мл. Рост микоплазм наблюдался при максимальных разведениях 10⁻⁸–10⁻⁹, что свидетельствовало о минимальном влиянии лиофилизации на жизнеспособность культуры.
Лиофилизированные образцы были дополнительно охарактеризованы по показателям «Потеря в массе при высушивании» и «Однородность массы». Значение показателя «Потеря в массе при высушивании» составило 3,53% при норме не более 5%28. Однородность массы, оцененная как относительное стандартное отклонение от средней массы образца, была равна 1,62% при средней массе образца 1,0042±0,0163 г29. Полученные результаты подтвердили соответствие лиофилизатов требованиям ГФ РФ30.
При изучении воздействия условий хранения на устойчивость характеристик культуры было установлено, что после 6 мес. хранения при температуре минус 20–30°С параметры образцов оставались сопоставимы с исходными. Титр сохранился на уровне 15×10⁸ КОЕ/мл (табл. S2, опубликована на сайте журнала31). Среднее содержание клеток в 1 мл культуры варьировало в узком диапазоне в пределах 10⁸, что свидетельствовало об однородности суспензии, точности розлива и высокой выживаемости культуры A. laidlawii PG8. Расчет титра образцов серии «0» после 6 мес. хранения представлен в таблице S2.
Анализ показателей качества образцов серии «0», включая сохранение концентрации микробных клеток на уровне 10⁸–10⁹ КОЕ/мл в течение 6 мес. хранения, и сравнение с характеристиками BRP A. laidlawii, серия 132, позволили установить ключевые критерии оценки качества СО. На основании этого разработана спецификация и изготовлены три рабочие серии образцов из серии «0» (основной банк штамма A. laidlawii PG8) для дальнейших исследований стабильности.
Разработка спецификации ФСО A. laidlawii PG8
С учетом российских и международных требований к СО БЛП и лиофилизатам33 [11][12], опыта аттестации и применения ФСО.3.2.00378 М. arginini 230 [9][13], а также характеристик BRP A. laidlawii34, авторами были установлены требования к показателям качества и составлена спецификация ФСО ГФ РФ A. laidlawii PG8. В спецификацию включены методы анализа, нормы и критические показатели для оценки качества образцов и проведения их аттестации на соответствие требованиям к ФСО (табл. 2).
Таблица 2. Спецификация фармакопейного стандартного образца A. laidlawii PG8
Table 2. Specification of A. laidlawii PG8 reference standard
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. ГФ РФ — Государственная фармакопея Российской Федерации, ОФС — общая фармакопейная статья, КОЕ — колониеобразующая единица.
Note. SP RF, State Pharmacopoeia of the Russian Federation; OFS, general pharmacopoeial chapter; CFU, colony-forming unit.
Показатель
Parameter
Метод
Method
Норма
References
Описание (внешний вид) лиофилизата
Description before reconstitution
Визуальный
Visual
Лиофилизированная мелкопористая масса светло-желтого цвета в виде рыхлой таблетки
Light-yellow finely porous lyophilised mass in the form of a friable tablet
Наличие вакуума (герметизация)
Vacuum (container integrity)
Визуальный (ГФ РФ XV изд., ОФС.1.7.1.0018.18)
Visual (SP RF XV, OFS. 1.7.1.0018.18)
Свечение в поле высокочастотного разряда должно быть голубым или розово-голубым
Blue or pink and blue glow in the high-frequency discharge
Время растворения
Reconstitution time
Визуальный
Visual
Время растворения в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида не должно превышать 1 мин
Reconstitution time in 1 mL sterile 0.9% sodium chloride solution is less than 1 min
Описание восстановленного образца
Description after reconstitution
Визуальный
Visual
Суспензия светло-желтого цвета, без осадка и примесей
Light-yellow suspension free of precipitation and impurities
Стерильность
Sterility
Метод прямого посева (ГФ РФ XIV изд., ОФС.1.2.4.0003.15)
Direct inoculation (SP RF XIV, OFS.1.2.4.0003.15
Бактерии и грибы должны отсутствовать
No bacteria or fungi present
Однородность массы дозированной лекарственной формы (средняя масса и отклонение от средней массы)
Mass homogeneity of the weighed dosage forms (average mass and deviation)
Весовой (ГФ РФ XV изд., ОФС.1.4.2.0009)
Weighing (SP RF XV, OFS.1.4.2.0009)
Не более 5%
Not more than 5%
Потеря в массе при высушивании
Loss on drying
Весовой (ГФ РФ XV изд., ОФС.1.2.1.0010)
Weighing (SP RF XV, OFS.1.2.1.0010)
Не более 5%
Not more than 5%
Титр, КОЕ/мл
Titre, CFU/mL
Метод предельных разведений с составлением числовой характеристики по таблице Мак-Креди или по среднему арифметическому значению
Titre calculation by the most probable number method, with numerical interpretation using McCrady’s table or the arithmetic mean
Не ниже 1×10⁷
Not less than 1×10⁷
Дальнейшую аттестацию и оценку образцов проводили согласно разработанной спецификации.
Приготовление рабочих серий штамма A. laidlawi PG8 и аттестация кандидатов в ФСО
Рабочие серии получали из образцов основного банка после 6 мес. хранения по аналогичной процедуре. При высеве разведений 10⁻¹–10⁻⁹ на полужидкую ПС образцов всех трех серий через 96 ч (4 сут) инкубации наблюдали характерный рост в виде колоний светло-желтого цвета как в зоне посева, так и по всей глубине ПС, соответствующий паспортным данным и культуральным свойствам образцов основного банка (рис. 2).
Фотография выполнена авторами / The photograph was taken by the authors
Рис. 2. Рост штамма A. laidlawii PG8 рабочей серии 1 на полужидкой питательной среде Каган: 1 — культура A. laidlawii PG8, 2 — контроль (незасеянная среда).
Fig. 2. Growth of A. laidlawii PG8 strain (working bank batches 1) on semi-liquid Kagan’s medium: 1, A. laidlawii PG8 culture, 2, control (uninoculated medium).
В рамках аттестации образцы трех рабочих серий были проанализированы по параметрам спецификации. Результаты аттестации показали их сопоставимость и воспроизводимость, в первую очередь по титру штамма (табл. 3).
Таблица 3. Результаты аттестации образцов рабочих серий 1, 2 и 3 тест-штамма A. laidlawii PG8
Table 3. Certification results of working bank batches 1, 2, 3, test strain A. laidlawii PG8
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Примечание. КОЕ — колониеобразующая единица; RSD — относительное стандартное отклонение.
Note. CFU, colony-forming unit; RSD, relative standard deviation.
Показатель
Parameter
Требование спецификации
Specification requirement
Результат аттестации образцов
Samples
Рабочая серия 1
Batch 1
Рабочая серия 2
Batch 2
Рабочая серия 3
Batch 3
Описание лиофилизата
Description before reconstitution
Лиофилизированная мелкопористая масса светло-желтого цвета в виде рыхлой таблетки
Light-yellow finely porous lyophilised mass in the form of a friable tablet
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Описание восстановленного образца
Description after reconstitution
Суспензия светло-желтого цвета, без осадка и примесей
Light-yellow suspension free of precipitation and impurities
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Наличие вакуума
Presence of vacuum
Свечение в поле высокочастотного разряда должно быть голубым или розово-голубым
Blue or pink-blue glow in the high-frequency discharge
Розово-голубое свечение
Pink and blue glow
Розово-голубое свечение
Pink and blue glow
Розово-голубое свечение
Pink and blue glow
Время растворения
Reconstitution time
Время растворения в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида не должно превышать 1 мин
Reconstitution time in 1 mL sterile 0.9% sodium chloride less than 1 min
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Стерильность
Sterility
Посторонние бактерии и грибы должны отсутствовать
No extraneous bacteria or fungi present
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Соответствует
Complies
Средняя масса (г) и отклонение от средней массы (RSD, %)
Аverage mass (g) and deviation (RSD, %)
Не более 5%
Not more than 5%
0,05272±0,00079
RSD=1,5%
0,0505±0,00111
RSD=2,1%
0,0489±0,0019
RSD=3,8%
Потеря в массе при высушивании, %
Loss on drying, %
Не более 5%
Not more than 5%
2,91
1,9
2,9
Титр, КОЕ/мл
Titre, CFU/mL
Не ниже 1×10⁷
Not less than 1×10⁷
21×10⁸
19×10⁸
10×10⁸
Оценка значения титра до и после лиофилизации подтвердила незначительное влияние процедуры на устойчивость культуры A. laidlawii PG8 (табл. 4).
Таблица 4. Стабильность титра тест-штамма A. laidlawii PG8 после хранения при температуре минус 20–30 °С
Table 4. Assessment of the culture titre stability of strain A. laidlawii PG8 stored at -20 to -30 °C
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data
Серия
Batch
Титр штамма A. laidlawii PG8, КОЕ/мл
The strain titer A. laidlawii PG8, CFU/mL
Микробная суспензия до лиофилизации
Microbial suspension prior to lyophilisation
Образцы после лиофилизации
Samples, post-lyophilisation
Образцы после 6 мес. хранения
6 months of storage
Образцы после 12 мес. хранения
12 months of storage
Образцы после 18 мес. хранения
18 months of storage
Образцы после 24 мес. хранения
24 months of storage
Основной банк
Master bank
12×10⁸
7,2×10⁸
15×10⁸
10×10⁸
2,9×10⁸
2,9×10⁸
Рабочая серия 1
Working bank batch 1
25×10⁸
21×10⁸
23×10⁸
23×10⁸
21×10⁸
73×10⁸
Рабочая серия 2
Working bank batch 2
45×10⁸
19×10⁸
18×10⁸
73×10⁸
67×10⁸
44×10⁸
Рабочая серия 3
Working bank batch 3
25×10⁸
10×10⁸
13×10⁸
10×10⁸
25×10⁸
11×10⁸
Для проверки пригодности полученных образцов согласно процедуре, принятой в Европейской фармакопее [8], образцы были переданы на экспертизу в независимую лабораторию (Департамент контроля качества ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России). Результаты экспертизы подтвердили полное соответствие качества образцов рабочей серии 1 заявленным требованиям спецификации: выявление характерного роста тест-штамма после инкубации рабочих разведений на полужидкой среде Каган в течение 7 сут при температуре 37±1°С.
В связи с отсутствием отклонений от установленных нормативных требований, серии были признаны пригодными в качестве ФСО для исследования стабильности.
Изучение стабильности свойств образцов основного банка и рабочих серий тест-штамма A. laidlawii PG8
Стабильность лиофилизированных образцов основного банка и трех рабочих серий A. laidlawii PG8 оценивали после 6, 12, 18 и 24 мес. хранения при температуре минус 20–30°С на пяти случайно отобранных образцах каждой серии (табл. 4). Условия хранения не оказали значимого влияния на культуральные свойства. Характер и скорость микробного роста во всех образцах в течение срока хранения оставались неизменными и соответствовали паспортным данным штамма. Титр штамма без учета числовых значений коэффициента стабильно сохранялся в пределах одного порядка (10⁸ КОЕ/мл). Количественные показатели также демонстрировали сравнимые значения в пределах неопределенности измерений.
Таким образом, в течение двух лет хранения характеристики всех серий образцов штамма A. laidlawii PG8 оставались стабильными и соответствовали спецификации.
На основании результатов аттестации разработаны Паспорт и Инструкция по применению ФСО A. laidlawii PG8. Данный ФСО, предназначенный для контроля БЛП на присутствие микоплазм в соответствии с требованиями ОФС.1.7.2.0031.1535, утвержден Приказом № 297 от 25.12.2024 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России и внесен в Реестр ФСО ГФ РФ под реестровым номером ФСО.3.2.0047336.
Разработанный ФСО A. laidlawii PG8 предназначен для использования в испытаниях БЛП на присутствие микоплазм микробиологическим методом согласно требованиям ОФС.1.2.4.003.15. С помощью ФСО возможна оценка пригодности партии питательной среды с уровнем чувствительности не более 100 КОЕ. В испытаниях могут применяться любые ПС, обладающие рост-стимулирующими свойствами в отношении A. laidlawii PG8, включая рекомендованную ГФ РФ полужидкую среду Каган. Данная среда обеспечивает минимальные анаэробные условия, благоприятные для выделения и культивирования как аргининзависимых (M. arginini G230), так и глюкозоферментирующих (A. laidlawii PG8) микоплазм, а также среда позволяет использовать лиофилизированные образцы ФСО A. laidlawii PG8 без предварительного накопления на других средах, что упрощает методику тестирования образцов.
Введение ФСО A. laidlawii PG8 в процедуру микробиологических испытаний БЛП расширяет спектр обнаруживаемой контаминации. ФСО может применяться для оценки качества лекарственных средств и ветеринарных препаратов, в производстве которых использовались антибиотики, а также для оценки иных материалов животного и растительного происхождения, включая сухие питательные среды, потенциально контаминированные микоплазмами. В качестве альтернативы не исключается возможность использования ФСО тест-штамма A. laidlawii PG8 при разработке метода ПЦР диагностики микоплазменной контаминации в различных материалах биологического происхождения.
ВЫВОДЫ
Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены таблицы S1 и S2.
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJЕ. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.М. Суханова — сбор и анализ источников литературы, систематизация и интерпретация результатов, формулировка выводов, научное редактирование и критическая переработка текста рукописи; З.Е. Бердникова — идея исследования, выполнение экспериментальных работ, написание текста рукописи; О.В. Фадейкина — концепция и дизайн исследования, статистическая обработка результатов.
Благодарности. Коллектив авторов выражает искреннюю благодарность и признательность сотрудникам и руководству иммунобиологического сектора Департамента контроля качества ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, принявших участие в апробации стандартного образца.
Additional information. Tables S1 и S2 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.
Authors’contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. S.M. Sukhanova analysed, systematised and interpreted the results, formulated the conclusions, collected and analysed literature data, edited and critically revised the manuscript; Z.E. Berdnikova conceived the study idea, conducted the experiments, and drafted the manuscript; O.V. Fadeikina elaborated study concept and design, statistically processed the results, and drafted the manuscript.
Acknowledgments. The authors express their sincere gratitude and appreciation to the Immunobiological Sector of Quality Control Department, Saint Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Sera and Enterprise for the Production of Bacterial Preparations of the Federal Medical and Biologic Agency of Russia, who participated in the standard approbation.
1. ГОСТ Р 70610-2022. Национальный стандарт Российской Федерации. Яйца куриные инкубационные для иммунобиологических производств. Технические условия.
2. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.
3. 2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5; 2024.
4. <63> USP 46–NF41 Mycoplasma tests. United State Pharmacopeia; 2025.
5. Test for absence of mycoplasmas. British Pharmacopoeia. Vol. 1; 2024.
6. 2.7.4. Test for absence of mycoplasmas. Indian Pharmacopoeia. Vol. 1; 2022.
7. 3301 Test for mycoplasma. Pharmacopoeia of the Peoples’ Republic of China. Vol. III; 2020.
8. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards, Аnnex 2, TRS No 932. WHO; 2004.
9. VICH GL34: Biologicals: testing for the detection of Mycoplasma contamination (EMA/CVMP/VICH/463/2002). EMA; 2013.
10. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество: практическое руководство. СПб: ЦОП «Профессия»; 2017.
11. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5; 2024. <63> USP46-NF41 Mycoplasmas. United State Pharmacopeia; 2025.
12. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf
13. ГОСТ ISO Guide 35-2015. Стандартные образцы. Общие и статистические принципы сертификации (аттестации).
14. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.
15. Там же.
16. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf
17. ОФС.1.8.1.0002 Иммунобиологические лекарственные препараты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.
18. ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1; 2018.
19. ОФС.1.2.1.0010.15 Потеря в массе при высушивании. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.
20. ОФС.1.4.2.0009 Однородность массы дозированных лекарственных форм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.
21. ГОСТ 54653-2011. Удобрения органические. Методы микробиологического анализа.
22. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.
23. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf
24. 2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5; 2024.
25. Паспорт штамма Acholeplasma laidlawii ГКПМ 930002. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
26. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.
27. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s1
28. ОФС. 1.2.1.0010.15 Потеря в массе при высушивании. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.
29. ОФС.1.4.2.0009 Однородность массы дозированных лекарственных форм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.
30. ОФС.1.4.1.0031 Лиофилизаты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.
31. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s2
32. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf
33. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards. Аnnex 2. TRS No 932. WHO; 2004. ГОСТ ISO Guide 35-2015. Стандартные образцы. Общие и статистические принципы сертификации (аттестации). ОФС.1.4.1.0031 Лиофилизаты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.
34. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf
35. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.
36. Реестр Фармакопейных стандартных образцов Государственной фармакопеи Российской Федерации. https://www.regmed.ru/produkt-n-service/fso/fso-registry/fso-of-biological-origin/
ReferencesDavid SA, Volokhov DV, Ye Z, Chizhikov V. Evaluation of Mycoplasma inactivation during production of biologics: egg-based viral vaccines as a model. Appl Environ Microbiol. 2010;76(9):2718–28. https://doi.org/10.1128/AEM.02776-09David SA, Volokhov DV, Ye Z, Chizhikov V. Evaluation of Mycoplasma inactivation during production of biologics: egg-based viral vaccines as a model. Appl Environ Microbiol. 2010;76(9):2718–28. https://doi.org/10.1128/AEM.02776-09Гладин ДП, Козлова НС, Эйдельштейн ИА и др. Микоплазмы. Биологические свойства (лекция). Российские биомедицинские исследования. 2023;8(4):103–15. https://doi.org/10.56871/RBR.2023.58.16.012Gladin DP, Kozlova NS, Edelstein IA, et al. Mycoplasmas. Biological properties (lecture). Russian Biomedical Research. 2023;8(4):103–15 (In Russ.). https://doi.org/10.56871/RBR.2023.58.16.012Леонович ОА. Микоплазма: свойства, методы обнаружения и дезактивации клеточных культур и штаммов вирусов (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2024;60(5):435–44. https://doi.org/10.1134/S0003683824604943Leonovich OA. Mycoplasma: Properties, detection and decontamination methods of cell cultures and viral strains (review). Applied Biochemistry and Microbiology. 2024;60:785–93 (In Russ.). https://doi.org/10.1134/S0003683824604943Kalaivani M, Chaudhary P, Goyal M, et al. Current regulatory and pharmacopoeial status of mycoplasma testing in concern with vaccines safety for human use. J Basic Clin Pharma. 2021;12(S4):001.Kalaivani M, Chaudhary P, Goyal M, et al. Current regulatory and pharmacopoeial status of mycoplasma testing in concern with vaccines safety for human use. J Basic Clin Pharma. 2021;12(S4):001.Medvedeva ES, Mouzykantov AA, Kostenko VV, et al. Adaptation to antimicrobials and pathogenicity in mycoplasmas: Development of ciprofloxacin-resistance and evolution of virulence in Acholeplasma laidlawii. Dokl Biochem Biophys. 2021;501(1):444–8. https://doi.org/10.1134/S1607672921060028Medvedeva ES, Mouzykantov AA, Kostenko VV, et al. Adaptation to antimicrobials and pathogenicity in mycoplasmas: Development of ciprofloxacin-resistance and evolution of virulence in Acholeplasma laidlawii. Dokl Biochem Biophys. 2021;501(1):444–8. https://doi.org/10.1134/S1607672921060028Думченко НБ, Семенцова АО, Нечаева ЕА. Изучение контаминации микоплазменными инфекциями культур клеток насекомых из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Вестник ПНИПУ. Химическая технология и биотехнология. 2023;(3):19–29. EDN: JUIIMNDumchenko NB, Sementsova AO, Nechaeva EA. Research of contamination with mycoplasma infections of cell FBSI SRC VB “Vector” of Rospotrebnadzor. PNRPU Bulletin. Chemical Tecnology and Biotechnology. 2023;(3):19–29 (In Russ.). EDN: JUIIMNRottem S, Kosower NS, Kornspan JD. Contamination of tissue cultures by mycoplasmas. In: Ceccherini-Nelli L, Matteoli B, eds. Biomedical Tissue Culture. 2012. https://doi.org/10.5772/51518Rottem S, Kosower NS, Kornspan JD. Contamination of tissue cultures by mycoplasmas. In: Ceccherini-Nelli L, Matteoli B, eds. Biomedical Tissue Culture. 2012. https://doi.org/10.5772/51518Milne C, Daas A. Establishment of European Pharmacopoeia mycoplasma reference strains. Pharmeuropa Bio. 2006;(1):57– 72. PMID: 17270132Milne C, Daas A. Establishment of European Pharmacopoeia mycoplasma reference strains. Pharmeuropa Bio. 2006;(1):57– 72. PMID: 17270132Суханова СМ, Бердникова ЗЕ, Тихонова АС. Совершенствование методики оценки качества питательной среды для выявления микоплазм. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(3):161–8. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-3-161-168Sukhanova SM, Berdnikova ZE, Tikhonova AS. Ways to improve quality control of culture medium used for mycoplasma detection. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2019;19(3):161–8 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-3-161-168Glantz SA. Primer of Biostatistics. 4th ed. New York: McGraw–Hill; 1994.Glantz SA. Primer of Biostatistics. 4th ed. New York: McGraw–Hill; 1994.Фадейкина ОВ, Волкова РА. Разработка порядка аттестации стандартных образцов биологических лекарственных средств. Химико-фармацевтический журнал. 2017;51(8):44–50. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2017-51-8-44-50Fadeikina OV, Volkova RA. Elaboration of certification procedures for reference standards of biological drugs. Pharm Chem J. 2017;51(8):716–21. https://doi.org/10.1007/s11094-017-1680-6Гегечкори ВИ, Шатилина АА, Шульга НА. Биологические стандартные образцы: актуальные вопросы разработки и порядка аттестации. Эталоны. Стандартные образцы. 2023;19(3):21–9. EDN: RKQAVMGegechkori VI, Shatilina AA, Shulga NA, et al. Biological reference materials: Topical issues of development and certification procedure. Measurement Standards. Reference Materials. 2023;19(3):21–9 (In Russ.). EDN: RKQAVMСуханова СМ, Бердникова ЗЕ, Фадейкина ОВ и др. Анализ стабильности стандартного образца тест-штамма Мycoplasma аrginini G230, используемого при испытании на присутствие микоплазм биологических лекарственных препаратов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(3):331–46. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-331-346Sukhanova SM, Berdnikova ZE, Fadeikina OV, et al. Stability analysis of a standard sample of the Mycoplasma arginini G230 used in testing for the presence of mycoplasmas of biological drugs. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2022;22(3):331–46 (In Russ.). https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-331-346
The authors declare that there are no conflicts of interest present.