Специфическая активность и токсичность лиофилизированного препарата рекомбинантного гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора человека ( E. coli  BL21/pET-GST-6His-GM): исследования  in vitro  и  in vivo

С. Г. Гамалей; Г. Г. Шимина; Е. А. Вязовая; О. В. Симакова; Т. Г. Ядренкина; О. С. Таранов; В. В. Омигов; К. Ф. Емцова; Т. И. Есина; Е. А. Волосникова; Е. Д. Даниленко

doi:10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118

Специфическая активность и токсичность лиофилизированного препарата рекомбинантного гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора человека (E. coli BL21/pET-GST-6His-GM): исследования in vitro и in vivo

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118

Полный текст:

PDF (Rus) HTML XML Допфайлы

сгенерировать QR код

Содержание

Перейти к:

Резюме

ВВЕДЕНИЕ. Создание новых эффективных препаратов на основе гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) остается актуальной задачей, поскольку изучение биологических эффектов препарата открывает новые перспективы его клинического применения для лечения множества заболеваний – от онкологических и гематологических до нейродегенеративных. В связи с разработкой нового лиофилизированного препарата рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ (рчГМ-КСФ) на основе штамма-продуцента Esсherichia coli BL21/pET-GST-6His-GM необходима оценка его специфической активности и токсичности.

ЦЕЛЬ. Изучение специфической пролиферативной (in vitro) и гемопоэзстимулирующей (in vivo) активности, а также острой и субхронической токсичности нового лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ для подкожного введения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали лиофилизированный рчГМ-КСФ (штамм E. coli BL21/pET-GST-6His-GM) производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Россия). Пролиферативную активность определяли на культуре клеток эритролейкемии человека TF-1 в ХТТ-тесте. Гемопоэзстимулирующую активность оценивали на мышах линии СВА/Calaс (самцы, возраст 2,0–2,5 мес.) с моделью миелосупрессии, индуцированной циклофосфамидом (200 мг/кг, внутрибрюшинно). Препарат рчГМ-КСФ вводили животным подкожно в дозе 90 мкг/кг в течение 4 сут. На 5 сут анализировали лейкограмму. Острую токсичность препарата оценивали при однократном подкожном введении самцам и самкам мышей линии ICR (500 и 1000 мкг/кг), субхроническую – при четырехкратном введении (90 мкг/кг). Через 1 и 7 сут оценивали массу и температуру тела, общий и биохимический анализы крови, проводили макро- и микроскопические исследования внутренних органов, включая сердце, легкое, печень, почки и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Препарат рчГМ-КСФ проявлял выраженную пролиферативную активность на клетках TF-1 (ЕD₅₀=0,48 нг/мл). На мышах с миелосупрессией препарат приводил к увеличению числа сегментоядерных нейтрофилов в 2,1 раза относительно контроля. Однократное и многократное введение препарата рчГМ-КСФ не вызывало гибель животных, не влияло на массу и температуру тела, а также не приводило к значимым изменениям гематологических, биохимических показателей, макро- и микроскопической структуры органов.

ВЫВОДЫ. Новый лиофилизированный препарат рчГМ-КСФ продемонстрировал высокую пролиферативную и гемопоэзстимулирующую активность, а также отсутствие выраженной острой и субхронической токсичности. Полученные результаты обосновывают перспективность дальнейшей фармацевтической разработки данного препарата в качестве эффективного и безопасного гемопоэзстимулирующего средства.

Ключевые слова

гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, рекомбинантные белки, рчГМ-КСФ, лиофилизированный препарат, пролиферативная активность, гемопоэз, острая токсичность, субхроническая токсичность, миелосупрессия, in vitro, in vivo

Для цитирования:

Гамалей С.Г., Шимина Г.Г., Вязовая Е.А., Симакова О.В., Ядренкина Т.Г., Таранов О.С., Омигов В.В., Емцова К.Ф., Есина Т.И., Волосникова Е.А., Даниленко Е.Д. Специфическая активность и токсичность лиофилизированного препарата рекомбинантного гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора человека (E. coli BL21/pET-GST-6His-GM): исследования in vitro и in vivo. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2026;26(1):108-118. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118

For citation:

Gamaley S.G., Shimina G.G., Vyazovaya E.A., Simakova O.V., Yadrenkina T.G., Taranov O.S., Omigov V.V., Emtsova K.F., Esina T.I., Volosnikova E.A., Danilenko E.D. Specific activity and toxicity of lyophilized recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (E. coli BL21/pET-GST6His-GM): in vitro and in vivo study. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2026;26(1):108-118. (In Russ.) https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118

ВВЕДЕНИЕ

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) — гемопоэтический фактор роста, стимулирующий пролиферацию и активность гранулоцитов и макрофагов [1–4]. Это обусловило клиническое использование рекомбинантных аналогов ГМ-КСФ человека (рчГМ-КСФ) при заболеваниях, сопровождающихся миелосупрессией: при последствиях химио- и радиотерапии онкологических заболеваний, тяжелой хронической нейтропении, а также для мобилизации клеток периферической крови при трансплантации костного мозга [5–10]. Расширение знаний о биологических эффектах ГМ-КСФ открывает новые перспективы для его широкого клинического применения [2][11].

Использование препаратов ГМ-КСФ сдерживается их высокой стоимостью и недостаточным присутствием на рынке, что обусловлено низкой продуктивностью штаммов-продуцентов. Ранее созданный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора рекомбинантный штамм Esсherichia coli SG20050/p280_2GМ, содержащий тандем генов ГМ-КСФ [12], и разработанная технология очистки позволили получить рекомбинантный белок с высокой чистотой и пролиферативной активностью [13]. Однако это не привело к полному решению проблемы продуктивности из-за нестабильности плазмиды. С использованием нового подхода, основанного на технологии слитых белков [14], была сконструирована плазмида, обеспечивающая синтез белка, который содержал, помимо последовательности ГМ-КСФ человека, белок глутатион-S-трансферазу (GST). Продуктом нового штамма E. coli BL21/pET-GST-6His-GM являлся рекомбинантный белок, содержащий на N-конце остаток глицина, обладающий гемопоэзстимулирующей и пролиферативной активностью, сравнимой с эталонным препаратом (международный стандартный образец ГМ-КСФ ВОЗ) [15]. Выход белка достигал 8 мг из 1 г биомассы [15]. На основе этого белка была получена лекарственная форма — лиофилизат для подкожного введения. Однако для последующего применения препарата требуется его доклиническая оценка.

Цель работы — изучение специфической пролиферативной (in vitro) и гемопоэзстимулирующей (in vivo) активности, а также острой и субхронической токсичности нового лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ для подкожного введения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Исследуемый препарат. Использовали препарат рчГМ-КСФ в форме лиофилизата для подкожного введения на основе субстанции, полученной из штамма E. coli BL21/pET-GST-6His-GM [15]. Состав лекарственной формы (на 1 мл раствора): 150 мкг рчГМ-КСФ (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора); 50 мг маннитола 5% (CAS № 69-65-8, EC № 200-711-8); 2,42 мг трис(гидроксиметил)аминометан (CAS № 77-86-1, EC № 201-064-4); вода для инъекций («Гротекс», Россия, ЛП-002529) — до 1 мл.

Культура клеток. Для оценки специфической активности рчГМ-КСФ in vitro использовали клеточную линию TF-1 эритролейкемии костного мозга человека (Cell lines service GmbH, Германия)¹. Клетки культивировали в полной среде RPMI-1640 с глутамином (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия), содержащей 1% пенициллин-стрептомицин (Servicebio, Китай), 10% эмбриональную телячью сыворотку (ООО НПП «ПанЭко», Россия), а также 3 нг/мл интерлейкина 3 (ИЛ-3) или 5 нг/мл рчГМ-КСФ. Условия культивирования: температура 37 °С, 5% СО₂, влажность 85%. Для экспериментов использовали клетки 3–4 пассажа после разморозки из криохранилища при температуре жидкого азота.

Экспериментальные животные. Изучение гемопоэзстимулирующей активности проводили на самцах мышей линии СВА/Calaс (2,0–2,5 мес.) массой 19–24 г в соответствии с нормативными требованиями². Для исследования токсичности использовали самцов и самок аутбредных мышей линии ICR (возраст 2,0–2,5 мес., масса 18–21 г). Мыши были получены из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п. Кольцово, Новосибирская область). Животные прошли адаптационный карантин и содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Содержание и манипуляции с животными проводили в соответствии с требованиями Международной конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей³, а также Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях⁴. Протокол исследования был утвержден Биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол № 2 от 14.02.2024).

Методы

Определение активности лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ in vitro. Пролиферативную активность рчГМ-КСФ определяли на клетках TF-1 микрометодом в 96-луночных планшетах (Biologix, Китай) с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилидa (XTT, CDH, Индия) и феназин-метасульфата (PMS, CDH, Индия) [16][17] с модификацией. В качестве эталонного препарата использовали международный стандартный образец ГМ-КСФ ВОЗ — 1st standard for granulocyte macrophage colony stimulating factor (NIBSC code: 88/646)⁵. Суспензию клеток TF-1 в полной среде RPMI (50 мкл, 10⁴ клеток/лунку) инкубировали с препаратами рчГМ-КСФ (диапазон концентраций 8–0,125 нг/мл, 50 мкл/лунку) в течение 72 ч при температуре 37 °С, 5% СО₂ и влажности 85%. По окончании инкубации в каждую лунку вносили 50 мкл реагента ХТТ/PMS и через 3 ч измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре Varioskan LUX (Thermo Scientific, Сингапур) при длинах волн 490/620 нм. Каждое разведение препарата рчГМ-КСФ (исследуемого и стандартного) анализировали в пяти повторах. Рассчитывали среднее значение оптической плотности и определяли уровень пролиферативной активности (индекс пролиферации) в процентах относительно контроля (без добавления ГМ-КСФ). На основании графика зависимости индекса пролиферации от концентрации рчГМ-КСФ определяли величину ED₅₀ — концентрацию препарата, обеспечивающую двукратное увеличение пролиферативного ответа. Расчеты выполняли с использованием Microsoft Excel.

Определение гемопоэзстимулирующей активности лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ in vivo. Исследование проводили на 18 мышах линии СВА/Calaс с цитостатической миелосупрессией, которую моделировали однократным внутрибрюшинным введением циклофосфамида (Sigma-Aldrich, США) в дозе 200 мг/кг по ранее описанному методу [18] с модификацией. Мышей рандомизировали с учетом массы тела на три группы. Через 24 ч после введения циклофосфамида животным опытной группы подкожно в течение 4 сут вводили рчГМ-КСФ в дозе 90 мкг/кг (0,2 мл), которая ранее была определена как эффективная [18]; животным контрольной группы — физиологический раствор. Третья группа (интактный контроль) не получала препаратов. На 5 сут у всех животных отбирали кровь из хвостовой вены. В образцах определяли общее количество лейкоцитов, лейкограмму [19] и абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов. Уровень гемопоэзстимулирующей активности рассчитывали как процентное отношение числа нейтрофилов крови опытных животных к контролю.

Изучение токсичности лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ при однократном и многократном введении. Изучение токсичности препарата проводили в соответствии с общепринятыми подходами⁶. Для оценки острой токсичности мышей ICR рандомизировали по массе тела на три группы (n=20, 10 самцов и 10 самок). Мышам опытных групп 1 и 2 однократно подкожно вводили препарат рчГМ-КСФ в дозах 0,5 и 1 мг/кг, что превышало эффективную дозу в 5 и 11 раз соответственно. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем физиологического раствора.

Для изучения субхронической токсичности мыши были разделены на 2 группы по 10 самцов и 10 самок в каждой. Животным опытной группы ежедневно в течение 4 сут подкожно вводили рчГМ-КСФ в эффективной дозе 90 мкг/кг (0,2 мл). Животные контрольной группы получали эквивалентный объем физиологического раствора по аналогичной схеме.

Через 1 сут после однократного или многократного введения проводили клиническое обследование животных (внешний вид, подвижность, поведенческие характеристики), а также физиологическое, гематологическое и биохимическое исследования. При физиологическом исследовании определяли температуру (термометр ТПЭМ-1, Россия) и массу тела (электронные весы SCОUT II SC 4010, ОHAUS, США). Для гематологического и биохимического анализа у животных отбирали кровь из ретроорбитального синуса. В образцах крови с помощью автоматического гематологического анализатора MicroCC-20 Plus VET (США) определяли количество лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, содержание гемоглобина, показатели гематокрита и тромбокрита, а также проводили расчет лейкограммы [19]. Биохимические показатели определяли с помощью автоматического анализатора Miura 200 (I.S.E. S.r.I., Италия) с использованием коммерческих наборов (АО «Вектор-Бест», Россия).

Для патоморфологического исследования мышей выводили из эксперимента на 1 и 7 сут после однократного и окончания многократного введения препаратов методом дислокации шейных позвонков. Извлеченные внутренние органы (сердце, легкое, печень, почки, надпочечники, селезенка, тимус, головной мозг, спинной мозг, регионарные лимфоузлы, желудок, тонкий и толстый кишечник, ткани из места введения, семенники/яичники) взвешивали на электронных весах GX-200 (AND, Япония) для расчета весовых индексов, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина («БиоВитрум», Россия) в течение 48 ч и подвергали стандартной гистологической обработке с заливкой в парафин⁷. Парафиновые срезы толщиной 4–5 мкм готовили с помощью автоматического ротационного микротома НМ–360 (Германия), окрашивали гематоксилином и эозином, проводили микроскопию и микрофотосъемку (Axio Imager Z1, Zeiss, Германия) с использованием программы Axio Vision 4.8.2 (Zeiss, Германия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statgraphics, Vers 5.0 (Statistical Graphic Сorp., США). Рассчитывали среднее арифметическое и ошибку среднего (М±m). Для оценки межгрупповых различий применяли непараметрический H-критерий Краскела — Уоллиса; для попарных сравнений использовали U-критерий Манна — Уитни. Критический уровень значимости (р) составлял 0,017 для трех попарных сравнений и 0,05 для двух [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Пролиферативная активность препарата рчГМ-КСФ в культуре клеток TF-1

Специфическую активность препарата in vitro оценивали стандартным методом по его способности стимулировать пролиферацию клеточной линии TF-1, чувствительной к ГМ-КСФ⁸ [21]. Графики «доза — эффект» для лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ и стандартного образца ГМ-КСФ оказались практически идентичными (рис. 1). Значения ED₅₀ для рчГМ-КСФ и стандартного образца составили 0,48 и 0,61 нг/мл соответственно, что свидетельствует об их эквивалентной активности. Полученные данные согласуются с нашими предыдущими результатами (ED₅₀ 0,3–0,4 нг/мл) [13] и литературными данными (0,01–0,6 нг/мл) [22].

Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure was prepared by the authors using their own data

Рис. 1. График зависимости пролиферативной активности лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ и стандартного образца ГМ-КСФ в культуре клеток TF-1 от концентрации препарата. ED₅₀ — концентрация препарата рчГМ-КСФ, обеспечивающая двукратное увеличение пролиферативного ответа. Контроль — физиологический раствор.

Fig. 1. Concentration-dependent proliferative activity of rhGM-CSF lyophilizate and reference standard for GM-CSF in TF-1 cell culture. ED₅₀, drug concentration that provides a twofold increase in the proliferative response. Control, saline.

Гемопоэзстимулирующая активность препарата рчГМ-КСФ

На модели цитостатической миелосупрессии, индуцированной циклофосфамидом (200 мг/кг), было показано выраженное угнетение кроветворения: снижение уровня лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов в 8 и 40,7 раза соответственно к 5 сут (данные не приведены). Четырехкратное применение рчГМ-КСФ у мышей в дозе 90 мкг/кг вызывало на 5 сут после введения циклофосфамида статистически значимое повышение абсолютного количества сегментоядерных нейтрофилов в 2,1 раза по сравнению с контролем (рис. 2А). Общее число лейкоцитов также имело выраженную тенденцию к увеличению под влиянием рчГМ-КСФ (рис. 2В).

Рисунки подготовлены авторами по собственным данным / The figures were prepared by the authors using their own data

Рис. 2. Влияние лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ на гематологические показатели крови мышей линии СВА/Calaс с цитостатической миелосупрессией (5 сут после введения циклофосфамида): А — абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов; В — общее количество лейкоцитов крови. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контроля (физиологический раствор), р≤0,05.

Fig. 2. Effect of rhGM-CSF lyophilizate on hematological blood parameters in СВА/Calaс mice with cytostatic myelosuppression (5 days following cyclophosphamide administration): A, absolute number of segmented neutrophils in peripheral blood; B, total number of blood leukocytes. *, statistically significant difference compared to the control group (saline), р≤0.05.

Острая токсичность препарата рчГМ-КСФ

Однократное подкожное введение рчГМ-КСФ мышам линии ICR в дозах 0,5 и 1 мг/кг (в 5 и 11 раз выше эффективной) не вызывало гибели животных, изменений в их поведении, массе и температуре тела, а также не влияло на гематологические показатели по сравнению с контролем (табл. S1, S2, опубликованы на сайте журнала в Приложении 1⁹).

Биохимический анализ крови мышей (табл. 1) не выявил существенного влияния рчГМ-КСФ на белковый (по уровню общего белка, альбумина, мочевины, активности аланинаминотрансферазы) и липидный обмен (по уровню холестерина и триглицеридов). Оценка углеводного обмена по содержанию глюкозы в крови показала, что в группе самок, получавших препарат в дозе 1 мг/кг, отмечалось умеренное повышение уровня глюкозы — на 27,8% через 1 сут после введения препарата, который нормализовался к 7 сут (табл. 1). Препарат не вызывал изменения активности амилазы крови самок и, следовательно, не оказывал токсического эффекта на структуру и функцию поджелудочной железы. У самцов существенных изменений этих показателей не выявлено. Полученные данные указывают на отсутствие токсического действия препарата на углеводный обмен.

Таблица 1. Биохимические показатели крови самцов и самок мышей линии ICR после однократного подкожного введения лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ

Table 1. Biochemical blood parameters in male and female ICR mice following a single subcutaneous administration of rhGM-CSF lyophilizate

Наименование показателя

Parameter

Пол животных

Sex

Группа животных

Group of animals

Контроль

Control

рчГМ-КСФ, 0,5 мг/кг

rhGM-CSF, 0.5 mg/kg

рчГМ-КСФ, 1 мг/кг

rhGM-CSF, 1 mg/kg

Контроль

Control

рчГМ-КСФ, 0,5 мг/кг

rhGM-CSF, 0.5 mg/kg

рчГМ-КСФ, 1 мг/кг

rhGM-CSF, 1 mg/kg

Через 1 сут после введения

1 day following administration

Через 7 сут после введения

7 days following administration

Общий белок, г/л

Total protein, g/L

52,3±0,7

52,9±0,8

50,0±0,8

50,9±1,6

54,0±0,6

55,8±0,9

56,3±1,1

59,9±1,9

56,7±1,9

56,9±1,8

54,5±1,1

59,7±0,7

Альбумин, г/л

Albumin, g/L

27,8±0,4

29,3±0,6

26,9±0,5

28,8±1,4

28,8±0,5

31,0±0,4

27,5±0,3

30,6±1,1

27,9±0,8

29,9±0,9

28,4±1,0

30,0±0,6

Мочевина, ммоль/л

Urea, mmol/L

3,3±0,3

2,5±0,3

3,5±0,4

1,8±0,3

2,8±0,4

2,8±0,3

3,6±0,3

3,7±0,3

3,9±0,2

3,0±0,1

3,3±0,3

3,6±0,3

Глюкоза, ммоль/л

Glucose, mmol/L

10,4±0,5

9,0±0,2

9,7±0,5

9,7±1,5

10,9±0,4

11,5±0,1*

9,9±0,3

8,6±0,3

10,5±0,4

9,2±0,4

9,8±0,6

9,6±0,3

Общий холестерин, ммоль/л

Total cholesterol, mmol/L

3,2±0,1

2,9±0,2

2,9±0,1

3,1±0,3

3,5±0,1

3,8±0,2

4,3±0,1

3,7±0,3

4,4±0,1

3,0±0,2

4,1±0,1

3,6±0,3

Триглицериды, ммоль/л

Triglycerides, mmol/L

2,3±0,1

2,1±0,1

1,8±0,3

1,8±0,1

2,1±0,2

2,4±0,2

2,8±0,2

2,6±0,3

2,8±0,4

2,4±0,2

3,8±0,4

Аланинаминотрансфераза, Е/л

Alanine aminotransferase, U/L

35,8±3,4

26,9±1,5

33,6±6,1

31,9±2,7

35,1±2,4

31,4±1,3

35,6±2,0

40,2±3,0

45,5±1,7

37,7±2,3

39,3±2,3

39,2±0,9

Аспартатаминотрансфераза, Е/л

Aspartate aminotransferase, U/L

118,2±11,2

105,0±9,0

108,9±8,4

112,0±7,6

117,9±4,2

122,1±7,0

142,2±7,5

182,3±19,8

157,9±12,2

156,7±16,5

140,6±15,4

175,6±4,9

Щелочная фосфатаза, Е/л

Alkaline phosphatase, U/L

317,8±20,2

316,0±16,1

331,2±18,0

330,8±22,4

349,6±14,0*

347,8±14,2

338,6±23,2

346,6±32,4

328,0±26,2

334,2±25,6

336,0±21,3

334,2±8,5

Амилаза, Е/л

Amylase, U/L

696,7±17,9

830,5±62,5

713,1±50,3

731,2±51,1

802,1±29,8

818,8±37,3

1065,9±50,6

1081,4±99,7

997,0±49,0

1156,4±89,4

1012,0±70,2

1025,2±50,4

Креатинкиназа, Е/л

Creatine kinase, U/L

217,7±32,7

176,8±15,3

331,5±29,0

201,0±18,6

237,6±10,1

172,4±20,7

208,1±20,0

284,1±17,5

264,8±11,7

229,4±17,4

209,0±16,5

254,4±9,2

Калий, ммоль/л

Potassium, mmol/L

13,1±0,9

14,5±0,5

17,1±1,4

13,9±0,7

14,0±0,2

16,2±0,6

11,5±1,1

14,5±0,4

13,8±0,9

12,4±0,9

12,1±0,6

15,1±0,7

Кальций, ммоль/л

Calcium, mmol/L

2,5±0,2

2,4±0,2

2,7±0,3

2,0±0,0

2,2±0,0

2,5±0,3

2,7±0,1

2,5±0,1

2,4±0,2

2,4±0,1

2,3±0,1

2,5±0,1

Хлориды, ммоль/л

Chloride, mmol/L

112,0±0,7

115,6±1,2

111,1±1,1

116,4±1,8

113,9±0,8

117,7±0,6

107,2±1,3

112,3±0,4

105,4±1,4

110,6±1,5

108,8±1,2

115,0±1,0

Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data

Примечание. * — статистически значимое отличие от группы контроля (физиологический раствор), р≤0,017. Количество животных в группе: n=10.

Note. *, statistically significant difference compared to the control group (saline), p≤0.017. The number of animals in each group was n=10.

Биохимические маркеры функции сердца (аспартатаминотрансфераза, креатинкиназа), печени (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза) и поджелудочной железы (амилаза) оставались в норме, что указывает на отсутствие токсического воздействия препарата на сердечно-сосудистую и пищеварительную системы (табл. 1). Единственным статистически значимым изменением было незначительное и преходящее повышение активности щелочной фосфатазы (примерно на 10%) через 1 сут после введения дозы 1 мг/кг, отмеченное у самцов и самок. Умеренное транзиторное повышение активности фермента не сопровождалось гистологическими нарушениями структуры печени и желчевыводящих путей у мышей опытной группы (табл. 1), характерными для лекарственного токсического повреждения гепатоцитов (печеночно-клеточный механизм) или нарушения оттока желчи (холестатический механизм) [23]. Согласно данным М.Г. Ипатовой с соавт. [23], повышение активности щелочной фосфатазы при холестазе коррелирует с ростом уровня холестерина и триглицеридов, чего в нашем исследовании не наблюдалось. Учитывая незначительную величину изменений, можно заключить, что они не связаны с токсическим воздействием препарата на печень.

Препарат рчГМ-КСФ не вызывал изменений уровня мочевины и электролитов (калий, кальций, хлориды) в крови животных (табл. 1), а также гистологической картины почек (рис. S1), что свидетельствует об отсутствии влияния на выделительную систему.

Весовые индексы внутренних органов самок мышей опытных групп не отличались от контрольных значений (табл. S3, Приложение 1). У самцов через 1 сут после введения препарата наблюдалось снижение весового индекса тимуса на 16,9% (59,5±1,9 против 71,6±3,4 мг/г) с сохранением этой тенденции к 7 сут. Для селезенки также выявлено снижение весового индекса через 7 сут – на 27% относительно контроля (табл. S3). Учитывая иммуномодулирующие свойства рчГМ-КСФ, можно предположить, что эти изменения могут отражать перераспределение клеток в организме, связанное с миграцией клеток из органов иммунной системы. Однако гистологических признаков токсического воздействия рчГМ-КСФ на органы и ткани, в том числе на органы иммунной системы, обнаружено не было (рис. S1).

Субхроническая токсичность препарата рчГМ-КСФ

Четырехкратное подкожное введение рчГМ-КСФ мышам линии ICR в эффективной дозе (90 мкг/кг) не приводило к гибели животных и появлению клинических признаков токсической реакции. Значимых изменений гематологических и биохимических показателей не выявлено, что свидетельствует об отсутствии токсического воздействия на систему крови, основные физиологические системы (сердечно-сосудистая, пищеварительная и выделительная) и обменные процессы (табл. S4, S5, опубликованы на сайте журнала в Приложении 2¹⁰). Обнаруженное незначительное снижение уровня калия у самцов на 7 сут (на 12,4%) не позволяет говорить о нарушениях электролитного обмена (табл. S5). Макроскопическое и гистологическое исследование органов подтвердили отсутствие патологических изменений (рис. S2, Приложение 2).

Весовые индексы органов самцов мышей через 1 сут после окончания введения препарата рчГМ-КСФ не отличались от контрольных показателей. У самок выявлено умеренное статистически значимое снижение весового индекса левой почки на 7 сут (на 13,3%), что, вероятно, связано с изменением тонуса сосудов органа. В этот же период в группе самок отмечена тенденция к незначительному (на 9–11%) снижению весовых индексов тимуса и селезенки (табл. 2).

Таблица 2. Относительная масса внутренних органов самок мышей линии ICR после четырехкратного подкожного введения лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ

Table 2. Relative organ weights in female ICR mice following four subcutaneous administrations of rhGM-CSF lyophilizate

Группа животных *Group of animals*	Масса животного, г *Body weight, g*	Весовые индексы органов, ×10 мг/г / Organ weight indices, ×10 mg/g
		Сердце *Heart*	Легкое *Lung*	Печень *Liver*	Почка / Kidney		Селезенка *Spleen*	Тимус *Thymus*
		Сердце *Heart*	Легкое *Lung*	Печень *Liver*	левая *left*	правая *right*	Селезенка *Spleen*	Тимус *Thymus*
Через 1 сут после окончания введения / 1 day following administration
Контроль / Control	22,4±0,4	52,0±1,4	82,0±2,5	555,8±29,7	59,9±2,6	65,3±3,2	65,0±5,5	59,0±4,0
рчГМ-КСФ, 90 мкг/кг rhGM-CSF, 90 μg/kg	22,2±0,2	52,2±1,2	74,5±2,6	544,3±23,9	60,9±1,9	66,3±3,2	54,2±3,5	70,8±3,9
Через 7 сут после окончания введения / 7 days following administration
Контроль / Control	26,7±0,6	48,4±2,4	72,1±3,5	563,6±18,8	65,3±1,1	65,9±1,9	71,0±6,2	60,5±3,1
рчГМ-КСФ, 90 мкг/кг rhGM-CSF, 90 μg/kg	26,8±0,6	48,6±3,6	74,7±1,8	558,8±20,2	56,6±2,2*	57,9±2,8	64,5±5,4	54,1±1,9

Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data

Примечание. * — статистически значимое отличие по отношению к группе контроля (физиологический раствор), р≤0,05. Количество животных в группе: n=5.

Note. *, statistically significant difference compared to the control group (saline), p≤0.05. The number of animals in each group was n=5.

Таким образом, лиофилизированный препарат рчГМ-КСФ не проявлял токсического действия как при многократном введении мышам в эффективной дозе, так и при однократном введении в дозах, в 5–11 раз превышающих эффективную, что подтверждено отсутствием изменений в клиническом состоянии, поведении, физиологических функциях, обменных процессах, макро- и микроструктуре органов.

В настоящем исследовании продемонстрирована высокая специфическая активность препарата рчГМ-КСФ в культуре клеток и на мышах, а также показано отсутствие токсических свойств при однократном и многократном введении мышам. Полученные данные позволяют рекомендовать препарат рчГМ-КСФ для дальнейших доклинических исследований, включающих изучение общей токсичности на кроликах, иммунологической токсичности, аллергизирующего действия и репродуктивной токсичности.

ВЫВОДЫ

Препарат рчГМ-КСФ в форме лиофилизата для подкожного введения, полученный из штамма-продуцента coli BL21/pET-GST-6His-GM, продемонстрировал высокую специфическую активность: пролиферативную активность in vitro на клетках TF-1 и гемопоэзстимулирующую активность in vivo на мышах с цитостатической миелосупрессией.
Препарат не обладал выраженной острой и субхронической токсичностью на мышах (самцах и самках) при подкожном введении: однократное введение в дозах, в 5–11 раз превышающих эффективную, и многократное введение в эффективной дозе не вызывали гибели животных, клинических признаков интоксикации, снижения массы и температуры тела, а также значимых и стойких изменений гематологических, биохимических показателей, макро- и микроскопической структуры органов.
Высокая специфическая активность и благоприятный профиль безопасности обосновывают перспективность дальнейшей фармацевтической разработки лиофилизированного препарата рчГМ-КСФ в качестве гемостимулирующего средства.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены Приложения 1 и 2.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118-annex1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118-annex2

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.Г. Гамалей — анализ и систематизация данных научной литературы,

Additional information. Supplements 1 and 2 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118-annex1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118-annex2

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. S.G. Gamaley analyzed and systematized literature data, interpreted the анализ и интерпретация результатов исследования, формулировка выводов, написание и редактирование текста рукописи; Г.Г. Шимина — проведение исследований специфической активности in vivo, определение гематологических показателей при изучении острой и субхронической токсичности, статистическая обработка данных, оформление графического материала, написание текста рукописи; Е.А. Вязовая — проведение экспериментальных исследований in vitro, сбор и анализ данных научной литературы; Т.И. Есина, Е.А. Волосникова — получение и анализ препаратов для исследования; О.В. Симакова, Т.Г. Ядренкина, О.С. Таранов, В.В. Омигов, К.Ф. Емцова — проведение экспериментальных исследований острой и субхронической токсичности, статистическая обработка данных, подготовка и оформление таблиц; Е.Д. Даниленко — формирование цели и задач исследования; редактирование текста рукописи; утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Соответствие принципам этики. Исследование проводилось в соответствии с национальными и международными руководствами по гуманному содержанию и использованию животных в научных исследованиях. Протокол-заявка утвержден Биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Протокол №2 от 14.02.2024).

research results, formulated the conclusions, drafted and edited the manuscript. G.G. Shimina conducted in vivo experimental studies of specific activity, detected hematological parameters in the study of acute and subchronic toxicity, processed statistical data, designed the graphs and participated in drafting the manuscript. E.A. Vyazovaya conducted in vitro experiments, collected and analyzed literature data. T.I. Esina, and E.A. Volosnikova obtained and tested drug dosage forms for the research. O.V. Simakova, T.G. Yadrenkina, O.S. Taranov, V.V. Omigov, and K.F. Emtsova conducted experimental studies of acute and subchronic toxicity, processed statistical data, prepared and designed the tables. E.D. Danilenko conceptualized the study, edited and approved the final version of the manuscript for publication.

Ethics approval. The study was conducted in full compliance with national and international guidelines for the humane care and use of animals in scientific research. The study protocol was approved by the Bioethics Committee of State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector” of Rospotrebnadzor (Meetings No.2 dated 02/14/2024).

1. https://sputnik-group.com/catalog/section_1398684/

2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. М.: Гриф и К; 2012.

3. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Strasbourg; 1986. https://norecopa.no/media/2iydns5h/ets-123-original.pdf

4. https://ruslasa.ru/wp-content/uploads/2017/06/Directive_201063_rus.pdf

5. WHO International Standard. 1st standard for granulocyte macrophage colony stimulating factor (human, rDNA derived). NIBSC code: 88/646. https://nibsc.org/documents/ifu/88-646.pdf

6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств: (иммунобиологические лекарственные препараты). М.: Гриф и К; 2012.

7. Там же.

8. 01/2008:1641 Мolgramostim concentrated solution. European Pharmacopoeia. 11th ed.; 2023.

9. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118-annex1

10. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-108-118-annex2

Список литературы

1. Зурочка АВ, Гриценко ВА, Зурочка ВА и др. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и его синтетические аналоги: иммунобиологические эффекты и клиническое применение. Екатеринбург: УрО РАН; 2021. EDN: LXCUQE

2. McCarthy J, Boyle N, McCarthy C. Recombinant GM-CSF drug evaluation review. Immunotherapy. 2025;17(14):983–93. https://doi.org/10.1080/1750743X.2025.2571020

3. Petrina M, Martin J, Basta S. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor has come of age: From a vaccine adjuvant to antiviral immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2021;59:101–10. https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2021.01.001

4. Lazarus HM, Pitts K, Wang T, et al. Recombinant GM-CSF for diseases of GM-CSF insufficiency: Correcting dysfunctional mononuclear phagocyte disorders. Front Immunol. 2023;13:1069444. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1069444

5. Dale DC, Crawford J, Klippel Z, et al. A systematic literature review of the efficacy, effectiveness, and safety of filgrastim. Support Care Cancer. 2018;26(1):7–20. https://doi.org/10.1007/s00520-017-3854-x

6. Rizzo A. Use of granulocyte colony-stimulating factor for adult cancer patients: current issues and future directions. Future Oncol. 2021;17(26):3411–3. https://doi.org/10.2217/fon-2021-0678

7. Mora J, Modak S, Kinsey J, et al. GM-CSF, G-CSF or no cytokine therapy with anti-GD2 immunotherapy for high-risk neuroblastoma. Int J Cancer. 2024;154(8):1340–64. https://doi.org/10.1002/ijc.34815

8. Obrador E, Salvador R, Villaescusa JI, et al. Radioprotection and radiomitigation: From the bench to clinical practice. Biomedicines. 2020;8(11):461. https://doi.org/10.3390/biomedicines8110461

9. Lazarus HM, Ragsdale CE, Gale RP, Lyman GH. Sargramostim (rhu GM-CSF) as cancer therapy (systematic review) and an immunomodulator. A drug before its time? Front Immunol. 2021;12:706186. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.706186

10. Ma M, Yao L, Li M, et al. Granulopoiesis-stimulating factors to prevent adverse effects in the treatment of solid tumors. Cochrane Database Syst Rev. 2024(1):CD015656. https://doi.org/10.1002/14651858.CD015656

11. Зурочка АВ, Зурочка ВА, Добрынина МА, Гриценко ВА. Иммунобиологические свойства гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и синтетических пептидов его активного центра. Медицинская иммунология. 2021;23(5):1031–54. https://doi.org/10.15789/1563-0625-IPO-2216

12. Гилева ИП, Есина ТИ, Волосникова ЕА и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК p280_2GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, штамм E.coli SG 20050/p280_2GM — продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека и способ получения указанного полипептида. Патент Российской Федерации № 2708556; 2019. EDN: GEBQSJ

13. Esina TI, Lebedev LR, Volosnikova EA, et al. Method for obtaining recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Biotechnology in Russia. 2019;(3):68–73. EDN: EBPUDB

14. Qing R, Hao S, Smorodina E, et al. Protein design: From the aspect of water solubility and stability. Chem Rev. 2022;122(18):14085–179. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c00757

15. Волосникова ЕА, Волкова НВ, Гогина ЯС и др. Остаток глицина на N-конце рекомбинантного GM-CSF не снижает его гранулоцитпоэзстимулирующую активность. Биотехнология. 2025;41(1):69–77. https://doi.org/10.56304/S0234275825010120

16. Kitamura T, Tange T, Terasawa T, et al. Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin. J Cell Physiol. 1989;140(2):323–34. https://doi.org/10.1002/jcp.1041400219

17. Гражданцева АА, Сиволобова ГФ, Ткачева АВ и др. Высокоэффективная продукция биологически активного секретируемого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека рекомбинантным вирусом осповакцины. Биотехнология. 2015;31(5):13–21. EDN: VLDZWR https://doi.org/10.1134/S0003683816070036

18. Шимина ГГ, Батенева АВ, Гамалей СГ и др. Исследование гемостимулирующих свойств рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;20(4):268–76. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-4-268-276

19. Новицкий ВВ, Евтушенко ОМ. Руководство к практическим занятиям по гематологии. Томск: Сибирский медицинский университет; 1999. EDN: SIFWVP

20. Гржибовский АМ, Иванов СВ, Горбатова МА. Сравнение количественных данных трех и более независимых выборок с использованием программного обеспечения STATISTICA и SPSS: параметрические и непараметрические критерии. Наука и здравоохранение. 2016;(4):5–37. EDN: WKPWYL

21. Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Яковлев АК и др. Особенности определения специфической активности биотехнологических лекарственных средств. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017;17(1):13–26. EDN: YHSSGL

22. Hercus TR, Bagley CJ, Cambareri B, et al. Specific human granulocyte-macrophage colony- stimulating factor antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91(13):5838–42. https://doi.org/10.1073/pnas.91.13.5838

23. Ипатова МГ, Мухина ЮГ, Шумилов ПВ. Интерпретация биохимического анализа крови при патологии печени. Синдром холестаза. Часть 2. Практика педиатра. 2017;(4):18–28. EDN: ZMQPTH

Об авторах

С. Г. Гамалей

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Россия

Гамалей Светлана Георгиевна