АКТУАЛЬНОСТЬ. Применение стандартного образца (СО), аттестованного в установленном порядке, является необходимым элементом стандартизации методики и обеспечивает возможность получения сопоставимых результатов при оценке показателей качества лекарственных средств в различных лабораториях, что важно при контроле качества биологических лекарственных средств (БЛС). При государственной регистрации лекарственного средства предусмотрено предоставление сведений о СО, однако конкретные требования к данному разделу досье отсутствуют, что обусловливает актуальность их разработки для дальнейшего включения в соответствующее руководство.

ЦЕЛЬ. Разработка требований к материалам раздела «Стандартные образцы» в досье на биологические лекарственные средства при их регистрации.

ОБСУЖДЕНИЕ. Проведен анализ международной (документы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Евразийского экономического союза) и российской нормативной правовой базы для СО БЛС, документов Международной организации по стандартизации (ISO) и Росстандарта, а также опыта аттестации и применения СО для контроля качества БЛС в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Рассмотрены особенности аттестации СО для БЛС с учетом различий методик измерений и методик испытания. Сформулированы основные требования к формированию материалов раздела по СО в досье на БЛС. Методики, использующиеся для аттестации СО (методики испытания), должны быть описаны в соответствии с требованиями к написанию стандартной операционной процедуры; необходимые валидационные характеристики методики должны быть установлены в адекватных валидационных исследованиях. Сформулированы требования к аттестации первичных СО для подтверждения структуры рекомбинантных белков новых БЛС. Установление значений аттестованных характеристик и критических показателей качества должно проводиться для СО, технология производства которого описана и соответствует рекомендациям ВОЗ или требованиям надлежащей производственной практики (GMP). Основные этапы аттестации являются общими для всех видов СО. Исследования стабильности СО для установления срока годности должны проводиться методом естественного старения. Ускоренные испытания стабильности могут быть полезны для изучения механизма деградации и влияния кратковременных отклонений от регламентированных условий хранения. В соответствии с рекомендациями ВОЗ должны быть установлены изменения в отношении СО, которые требуют одобрения регуляторным органом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Систематизированы требования к формированию материалов раздела по стандартным образцам в досье на биологические лекарственные средства для подготовки соответствующего руководства. Разработка этих требований обеспечит единый подход заявителей, разработчиков лекарственных средств и экспертов уполномоченного органа к подготовке, аттестации, оформлению документов на стандартные образцы и ускорит их рассмотрение при регистрации.

АКТУАЛЬНОСТЬ. Методика определения специфической активности рекомбинантных интерферонов предусматривает использование стандартного образца в качестве меры сравнения. Доступность международного стандартного образца (МСО), обычно используемого для оценки качества препаратов указанного типа, в настоящее время ограничена, в связи с чем при оценке качества интерферонов целесообразно применять фармакопейные стандартные образцы (ФСО), которые предварительно аттестуют с использованием МСО при их наличии.

ЦЕЛЬ. Аттестация фармакопейного стандартного образца для оценки специфической активности рекомбинантного интерферона α-2b.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Определение специфической активности проводили в реакции подавления интерфероном цитопатического действия вируса на культуре клеток в сравнении с активностью МСО интерферона α-2b (WHO International Standard Interferon alpha 2b (Human, rDNA derived). В исследовании использовали клетки линий A549 и MDBK в комбинации с вирусами везикулярного стоматита (VSV) и энцефаломиокардита (EMC). Исследование проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ОФС.1.7.2.0002.15). Учет результатов осуществляли инструментальным и визуальным методами. При расчетах использовали методы математической статистики; учет влияния факторов промежуточной прецизионности проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В соответствии с разработанной программой и методикой аттестации проведена аттестация ФСО человеческого рекомбинантного интерферона α-2b (ФСО чрИФН-α-2b), предназначенного для оценки качества соответствующего препарата по показателям «Специфическая активность» (определение противовирусной активности на культуре клеток), «Подлинность» (реакция нейтрализации). Входной контроль кандидата в ФСО по показателям спецификации подтвердил его соответствие требованиям нормативной документации. По результатам испытаний установлено значение специфической активности ФСО: 4,47×10⁸ МЕ/мл, расширенная неопределенность: 8,12×10⁷ МЕ/мл (коэффициент охвата 2, уровень доверия ~95%). Срок годности ФСО чрИФН-α-2b установлен по сроку годности соответствующего препарата при хранении при температуре не выше минус 40 °С. Допускается хранение размороженного ФСО при температуре 2–8 °С в течение 1 мес.

ВЫВОДЫ. Аттестован ФСО для оценки специфической активности рекомбинантного интерферона α-2b. По результатам аттестации ФСО включен в Реестр фармакопейных стандартных образцов Государственной фармакопеи Российской Федерации с реестровым номером ФСО.3.2.00455 и наименованием «Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный (специфическая активность)». Внедрение аттестованного ФСО чрИФН-α-2b позволит проводить оценку качества всех отечественных препаратов интерферона указанного типа по показателям «Специфическая активность», «Подлинность» на надлежащем научно-методическом уровне и обеспечит независимость отечественных производителей и органов контроля качества препаратов от импорта МСО.

АКТУАЛЬНОСТЬ. При контроле качества препаратов терапевтических моноклональных антител важной задачей является определение остаточного белка А, появление которого связано с вымыванием из носителя в процессе аффинной хроматографической очистки антител. Иммуноферментное определение белка А осложняется эффектом влияния присутствия неродственных соединений (иммуноглобулины) в образце (эффект матрицы), что может приводить к ложноотрицательным результатам анализа. Для повышения эффективности иммуноферментного анализа (ИФА) необходимо разработать этап пробоподготовки образцов, позволяющий необратимо разорвать связь в комплексе «белок А – моноклональное антитело».

ЦЕЛЬ. Разработка и валидация аналитической методики иммуноферментного определения остаточного белка А в фармацевтических субстанциях терапевтических моноклональных антител с использованием набора реагентов для ИФА на основе реактивов собственного производства (in-house).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В качестве антигена использовали рекомбинантный белок А. Наработку поликлональных антител к белку А проводили путем иммунизации кур с последующим отбором яиц и выделением из них антител. Специфичные к белку А антитела очищали с применением аффинной хроматографии. Остаточный белок А определяли после предварительной пробоподготовки образцов с помощью сэндвич-ИФА. Валидацию методики проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ОФС.1.1.0012).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Наработаны, выделены и очищены куриные антитела (IgY) против рекомбинантного белка А. Разработаны условия пробоподготовки и методика для проведения иммуноферментного определения остаточного белка А. Подобраны оптимальные составы буферных растворов, в том числе состав денатурирующего буфера для разрушения комплекса «белок А – моноклональное антитело». Проведена валидация разработанной методики. Измеряемые значения белка А при оценке правильности методики находились в пределах 83–108% от номинального, при оценке межлабораторной прецизионности – в пределах 96–116%, при оценке повторяемости – до 13%. Нижний предел количественного определения составил 10 нг/мл при минимально необходимом разведении 1:10. Аналитическая область методики – от 10 до 40 нг/мл. Методика показала сопоставимые результаты по сравнению с аналогичным набором реагентов иностранного производства.

ВЫВОДЫ. Разработанная методика определения остаточного белка А c использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа на основе реактивов собственного производства позволяет минимизировать эффект матрицы в препаратах терапевтических моноклональных антител. Применение методики позволит решить проблему импортозамещения и снизить затраты на контроль качества российских иммунобиологических препаратов.

АКТУАЛЬНОСТЬ. При контроле качества протеолитических ферментов, входящих в состав лекарственных препаратов, активность протеаз определяется спектрофотометрически, измерением амидазной или эстеразной активности с синтетическим субстратом, и протеолитической по методу Ансона. Данные методы требуют специальных субстратов, обладают низкой чувствительностью, а их специфичность может оказаться недостаточной и приводить к серьезным ошибкам. Альтернативный подход определения активности протеаз реализуется путем количественного масс-спектрометрического измерения, которое обеспечивается добавлением к продуктам гидролиза испытуемого фермента пептида с изотопной меткой. Такой подход позволяет определять протеолитическую активность, причем по гидролизу конкретных пептидных связей, одновременно с подтверждением подлинности и специфичности испытуемого образца с высокой чувствительностью и без использования специальных субстратов.

ЦЕЛЬ. На примере трипсина и казеина исследовать возможность определения активности фермента методом количественной масс-спектрометрии с меткой ¹⁸О одновременно с подтверждением подлинности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовали трипсин, казеин, H₂¹⁸O (НПО «Изотоп», Россия). Разделение пептидов проводили с помощью системы ВЭЖХ Agilent 1100, масс-спектры получали с использованием масс-спектрометра MALDI-TOF/TOF Bruker Ultraflex II. Количественный масс-спектрометрический анализ проводили, применяя пептид сравнения. Пептид получали путем гидролиза казеина трипсином с последующей очисткой с помощью ВЭЖХ. Для получения пептида с изотопной меткой ¹⁸О исходный пептид высушивали и инкубировали в воде H₂¹⁸О. Количественное определение продукта проводили с применением масс-спектрометрии MALDI-TOF. Для определения активности фермента и расчета константы Михаэлиса (К_М) использовали метод количественной масс-спектрометрии с меткой ¹⁸О.

РЕЗУЛЬТАТЫ. При гидролизе казеина трипсином идентифицированы фрагменты, соответствующие цепям этого белка. Получен изотопно-меченый стандарт, концентрация которого была рассчитана масс-спектрометрически. Определена скорость гидролиза казеина трипсином и рассчитана К_М для трипсина, которая составила 13,65±0,60 мкМ. Стандартное отклонение значений повторных измерений показало, что ошибка измерений оказалась меньше по сравнению со спектрофотометрическим методом, а минимальная установленная чувствительность предложенного метода составила 0,50±0,08 мкМ.

ВЫВОДЫ. Подтверждена возможность применения метода количественного масс-спектрометрического анализа с меткой ¹⁸О для определения активности ферментов на примере трипсина. Установленная чувствительность позволяет оценивать активность фермента одновременно с определением его подлинности и специфичности. Предложенный подход является универсальным, не требует дорогостоящих материалов и реактивов, а также может быть легко адаптирован для определения активности практически любой протеазы.

АКТУАЛЬНОСТЬ. Применение российских диагностических препаратов для оценки качества вакцин, поиск альтернативных методов, в том числе серологических исследований (испытаний), особенно актуальны в современных условиях санкций.

ЦЕЛЬ. Показать возможность применения для оценки качества вакцины бруцеллезной живой и вакцины туляремийной живой по показателю «Подлинность» в серологических исследованиях (испытаниях)  альтернативных методов: иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Применяли фармакопейный стандартный образец (ФСО) мутности бактериальных взвесей 10 МЕ; вакцину бруцеллезную живую (вакцинный штамм Brucella abortus 19 BА) — ФСО и две коммерческие серии; вакцины туляремийные живые (вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ) — ФСО и образец кандидата в ФСО. Все ФСО аттестованы ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Использовали российские коммерческие диагностические препараты для серологических исследований: сыворотки диагностические — поливалентную бруцеллезную сухую для РА и туляремийную сухую для РА; диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуноглобулиновый жидкий; тест-системы диагностические для выявления в ИФА возбудителей бруцеллеза и туляремии. Статистический анализ ИФА проводили в программе Microsoft Excel (P=0,95), РА и РНГА оценивали качественно.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Получены положительные результаты для всех исследуемых серий: вакцины бруцеллезной живой — в РА, вакцины туляремийной живой — в развернутой РА. Во всех испытаниях в РНГА вакцины туляремийной живой (концентрация 6,25×10⁶ м.к./мл, как в положительном контроле) наблюдалась гемагглютинация. Во всех испытаниях методом ИФА значения оптической плотности (D) обеих вакцин и положительного контроля были приближены: для вакцины туляремийной живой и вакцины бруцеллезной живой (цельные, концентрацией 1,0×10⁹ м.к./мл) D=2,133±0,273 (в контроле 1,942±0,056) и D=0,127±0,013 (в контроле 0,123±0,007) соответственно. Результаты свидетельствуют о наличии в образцах бруцеллезного или туляремийного микроба, что подтверждает подлинность вакцин.

ВЫВОДЫ. Серологические испытания методами ИФА, РА и РНГА с использованием российских диагностических препаратов показали возможность их применения для оценки качества вакцины бруцеллезной живой и вакцины туляремийной живой по показателю «Подлинность». Простой визуальный учет результатов, невысокая стоимость, экономия времени и относительно большой срок годности диагностических препаратов позволяют рекомендовать РА с российскими диагностическими сыворотками как альтернативный метод для оценки качества вакцины бруцеллезной живой и вакцины туляремийной живой по показателю «Подлинность». Вследствие трудоемкости и неэкономичности методов ИФА и РНГА рекомендовать их для оценки качества вакцин нецелесообразно. Результаты могут служить основанием для внесения метода РА в нормативные документы на вакцину бруцеллезную живую и вакцину туляремийную живую в качестве альтернативного метода.

АКТУАЛЬНОСТЬ. Сложность стандартизации иммунобиологических лекарственных препаратов, в том числе вакцины БЦЖ, обусловливает необходимость совершенствования статистического подхода к анализу стабильности показателей качества препарата. Одним из инструментов анализа качества являются контрольные карты Шухарта (ККШ), использование которых позволяет выявлять и анализировать тренды изучаемых процессов как в режиме реального времени, так и ретроспективно.

ЦЕЛЬ. Оценка показателей качества вакцины БЦЖ для иммунотерапии рака мочевого пузыря с применением контрольных карт Шухарта для мониторинга стабильности процессов производства и проведения испытаний по показателям качества.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Значение коэффициента корреляции (r) при анализе данных производителя и ИЦ составило от 0,34 до 0,70. Проверка данных испытательного центра с помощью критерия согласия Пирсона выявила нормальное распределение для показателей качества: «Дисперсность» (χ²=14,03) и «Потеря в массе при высушивании» (χ²=4,93). При анализе ККШ по показателям качества «Потеря в массе при высушивании» и «Специфическая активность» были обнаружены признаки выхода процесса производства и/или процесса проведения испытания при оценке качества из состояния статистической управляемости. При мониторинге показателей качества «Общее содержание бактерий» и «Дисперсность» выявлено, что было достигнуто состояние статистической управляемости. Определены контрольные границы для дальнейшего мониторинга стабильности результатов по показателю «Дисперсность» в реальном времени.

ВЫВОДЫ. Подтверждена применимость ККШ для оценки качества вакцины БЦЖ для иммунотерапии рака мочевого пузыря при проведении контроля в испытательном центре. Показана необходимость внедрения постоянного мониторинга стабильности показателей качества для повышения стандартизации процессов при производстве вакцины и методик проведения испытаний, что позволит обеспечить высокий уровень выпускаемой продукции.

АКТУАЛЬНОСТЬ. Учитывая множественную устойчивость к антимикробным препаратам Pseudomonas aeruginosa – одного из основных возбудителей очаговых и генерализованных форм гнойно-воспалительных заболеваний у людей с ослабленным иммунитетом, актуальной представляется разработка эффективных профилактических вакцин против P. aeruginosa, а также усиление защитных свойств вакцин путем подбора адъювантов. Является перспективным использование флагеллина жгутиков P. aeruginosa как индуктора системы врожденного иммунитета за счет взаимодействия с толл-подобным рецептором 5 типа (TLR5) и активатора Т-клеточного иммунного ответа в качестве компонента или адъюванта при разработке вакцин.

ЦЕЛЬ. Получение рекомбинантного флагеллина С Р. aeruginosa и изучение его иммуногенных, протективных и адъювантных свойств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Нуклеотидную последовательность гена fliC синтезировали с помощью ПЦР на основе матричной ДНК Р. aeruginosa РА-103 и встраивали в плазмиду pQE-30 для последующей экспрессии в клетках Escherichia coli М15. Очистку рекомбинантного флагеллина С (FliC) Р. aeruginosa проводили в два этапа: выделение телец включения и их последующее растворение в буферных растворах, содержащих мочевину и гуанидин гидрохлорид. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно двукратно с двухнедельным интервалом с использованием очищенного рекомбинантного белка FliC (доза – 50 мкг на животное) и его комбинацией с поверхностным антигеном Klebsiella pneumoniae (соотношение 1:1). Образцы сыворотки крови иммунизированных мышей исследовали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие специфических антител к FliC. Защитные свойства FliC оценивали при экспериментальном внутрибрюшинном заражении мышей культурами Р. aeruginosa РА-103 и K. pneumoniae № 204.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Получен штамм-продуцент рекомбинантного флагеллина С. Проведена наработка рекомбинантного белка FliC и его очистка (степень чистоты 97,6%). При анализе образцов сыворотки иммунизированных мышей в ИФА и оценке защитных свойств от экспериментально вызываемой инфекции показано, что очищенный рекомбинантный белок FliC обладал иммуногенными свойствами. В группе мышей, иммунизированных FliC, индекс эффективности защитных свойств при инфицировании P. aeruginosa соответствовал 3,0, что свидетельствует о протективном эффекте FliС. Рекомбинантный белок FliC проявлял адъювантные свойства при сочетанном использовании с поверхностным антигеном K. pneumoniae при инфицировании K. pneumonia – индекс эффективности составил 6,1.

ВЫВОДЫ. Очищенный рекомбинантный флагеллин С Р. aeruginosa обладал протективной активностью при экспериментальной синегнойной инфекции у мышей и проявлял адъювантные свойства при сочетанном введении с поверхностным антигеном K. pneumoniae, увеличивая его иммуногенность. Использование рекомбинантного флагеллина С перспективно для создании кандидатной вакцины против синегнойной инфекции.

АКТУАЛЬНОСТЬ. В связи с увеличением числа случаев возникновения инфекций пародонта, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, способными формировать биопленки в полости рта, и недостаточной эффективностью противомикробных препаратов в борьбе с биопленками, актуальной задачей представляется выделение бактериофагов, активных в отношении данных бактерий.

ЦЕЛЬ. Выделение бактериофагов, активных в отношении Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Actinomyces oris, изучение их биологических свойств и подбор оптимальных параметров культивирования системы «фаг-клетка» для получения чистых линий бактериофагов с высокими титрами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериофаги выделяли из биообразцов слюны, зубного налета и содержимого пародонтального кармана и определяли их характеристики: оптимальные значения множественности инфекции, время культивирования системы «фаг-клетка», устойчивость к различным температурам и рН, стабильность при хранении. Морфологию фагов изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Морфологию негативных колоний, литическую активность, спектр хозяев и специфичность оценивали, используя спот-тестирование и метод Грациа. В работе использовали бактерии из коллекции штаммов НПЦ «Микромир».

РЕЗУЛЬТАТЫ. Выделены и изучены биологические свойства трех новых изолятов бактериофагов, активных в отношении A. oris (vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35), и бактериофага, активного в отношении Ag. actinomycetemcomitans (vB_AacS_1/Dc-1). Фаги бактерий A. oris отнесены к подовирусам, а бактериофаг vB_AacS_1/Dc-1 – к сифовирусам. Фаги образуют полностью прозрачные бляшки округлой формы без ореола, диаметром от 0,8±0,1 до 4,0±0,2 мм. Установлено, что для получения чистых линий фагов с максимальными значениями титра оптимальными являются следующие параметры: значение множественности инфекции – 0,1–10, время культивирования системы «фаг-клетка» – 8–12 ч. Выявлена способность бактериофагов A. oris лизировать штаммы Actinomyces naeslundii. Из 15 исследуемых штаммов A. оris, бактериофаги vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35 лизировали 10, 8 и 12 бактериальных штаммов соответственно, а изолят фага vB_AacS_1/Dc-1 проявлял литическую активность в отношении обоих тестируемых штаммов Ag. actinomycetemcomitans. Исследуемые фаги продемонстрировали стабильность при абиотическом стрессе и длительном хранении.

ВЫВОДЫ. Выделены три новых бактериофага, активных в отношении A. oris, и один бактериофаг, активный в отношении Ag. actinomycetemcomitans, а также изучены их биологические свойства. Выделенные бактериофаги являются перспективными для дальнейших научных исследований на клинических штаммах, а также для проведения полногеномного секвенирования.