Туберкулез, вызываемый Mycobacterium tuberculosis, остается одной из основных причин смертности от инфекционных болезней в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2022 г. было зарегистрировано более 10 млн новых случаев заболевания, а число летальных исходов составило около 1,3 млн1. Лечение осложняется ростом числа случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и широкой лекарственной устойчивостью [1][2], а также тяжелыми инфекциями, вызванными нетуберкулезными микобактериями, такими как M. avium complex и M. abscessus complex, у иммунокомпрометированных пациентов [3].

Антибиотикотерапия микобактериальных инфекций сопряжена с рядом ограничений, к которым относятся длительность курса лечения (6–24 мес.), высокая токсичность препаратов и формирование лекарственной устойчивости [4][5], что стимулирует поиск альтернативных методов лечения, таких как фаготерапия [6].

Интерес к медицинскому применению бактериофагов (фаготерапия), снизившийся в эру антибиотиков, возрождается в условиях кризиса антибиотикорезистентности [7][8]. В частности, микобактериофаг D29 обладает литической активностью в отношении широкого спектра микобактерий, включая патогенные M. tuberculosis, M. abscessus, а также нетуберкулезные M. smegmatis и др. [9]. Преимуществами фага D29 являются высокая специфичность к микобактериям, способность лизировать как быстро-, так и медленнорастущие штаммы, а также низкая токсичность для эукариотических клеток [10]. Однако применение свободных фагов в клинической практике ограничивается их низкой стабильностью при хранении [11]. Инкапсуляция фагов в липосомы позволяет защитить вирусные частицы от деградации и воздействия факторов внешней среды (pH, ферменты, иммунная система), а также обеспечить контролируемое высвобождение [12][13]. Липосомальные системы доставки увеличивают время циркуляции фагов в организме [14] и повышают эффективность доставки в очаг инфекции [15], в том числе ингаляционным путем [16]. В то же время исследования липосомальных форм микобактериофагов, в частности данные об их долгосрочной стабильности, остаются ограниченными [17][18].

Цель работы — оценить долгосрочную (6 мес.) стабильность липосомальной формы микобактериофага D29 в условиях хранения при 4 °C по комплексу физико-химических и функциональных показателей для обоснования ее дальнейшего доклинического изучения.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Микобактериофаг D29 размножали в культуре Mycobacterium smegmatis mc² 155, которую выращивали на плотной питательной среде Миддлбрука 7H10 (HiMedia, Индия). Суспензию M. smegmatis mc² 155 культивировали в 50 мл жидкой питательной среды Миддлбрука 7H9 (HiMedia, Индия), содержащей 1 мМ CaCl2, до достижения оптической плотности 1,0. Инкубацию проводили в течение 1 сут при перемешивании (70 об/мин, 37 °С), затем добавляли 5 мл микобактериофага D29 с титром 10⁷–10⁸ бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл) для обеспечения множественности заражения, близкой к 0,1, для оптимизации выхода зрелых фаговых частиц. После дополнительной суточной инкубации в тех же условиях суспензию центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин) и фильтровали супернатант через стерильный мембранный фильтр 0,22 мкм (Merck Millipore, США).

Титр фага определяли методом серийных десятикратных разведений. Готовили серию последовательных десятикратных разведений очищенного фагового препарата в стерильном фаговом буферном растворе (0,01 M Tris-HCl, 5 мМ MgS04, 0,1 М NaCl, pH 7,5). Аликвоту каждого разведения (100 мкл) наносили на поверхность плотной агаризованной питательной среды 7H10 в чашках Петри, предварительно засеянных плотным газоном M. smegmatis mc² 155. После адсорбции фага при комнатной температуре в течение 20 мин чашки инкубировали при 37 °C 24 ч до появления четких зон лизиса (бляшек). Подсчет бляшек проводили в тех разведениях, в которых их количество составляло от 5 до 100 на чашку. Титр фага (БОЕ/мл) рассчитывали по формуле (1):

, (1)

где N — среднее количество бляшек в разведении, D — коэффициент разведения, V — объем пробы, внесенной на чашку (0,1 мл). Для последующей инкапсуляции использовали препараты с титром не менее 1×10⁹ БОЕ/мл. Данный критерий был установлен для обеспечения высокой стартовой нагрузки фага в липосомы.

Микобактериофаг D29, полученный в культуре M. smegmatis mc² 155, очищали от компонентов лизата микобактерий, содержащего смесь липаз, протеаз и разрушенных молекул ДНК, с помощью анионообменной хроматографии на сорбенте Sepromax (Galak, Китай) на хроматографе BioLogic LP (BioRad, США). Препарат микобактериофага D29 наносили на колонку, предварительно уравновешенную фаговым буферным раствором (0,01 M Tris-HCl, 5 мМ MgS04, 0,1 М NaCl, pH 7,5). После сбора фракций первого пика увеличивали молярность раствора до 1 M NaCl и собирали фракции второго пика, содержащие фаговые частицы. Препарат диализовали против фагового буферного раствора в течение 1 сут на магнитной мешалке RCT Basic IKA MAG (IKA, Германия) (110 об/мин, 4 °С) и стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм).

Липидную пленку формировали из смеси 30 мг фосфатидилхолина (Sigma-Aldrich, США) и 10 мг холестерина (Sigma-Aldrich, США) путем растворения компонентов в 3 мл 95% этанола и высушивания на роторном испарителе (RV 3 V-C, IKA Германия). Далее липидную пленку ресуспендировали в 3 мл очищенного препарата микобактериофага D29 путем встряхивания колбы с компонентами в течение 5 мин. Полученные многослойные липосомы последовательно экструдировали через фильтры с помощью стерильного шприца для получения однослойных липосом: однократно через фильтр 5 мкм (Merck Millipore, США), затем 19 раз через фильтр 0,45 мкм (Merck Millipore, США) и дополнительно однократно через новый фильтр 0,45 мкм.

Стабильность липосомальной формы микобактериофага D29 исследовали в течение 6 мес. при температуре хранения 4 °C с использованием следующих методов.

Определение литической активности по Грациа.

Данный метод является стандартом оценки активности фагов [19]. В основе метода лежит подсчет БОЕ на M. smegmatis mc² 155 методом серийных разведений, что позволяет оценить сохранение литической способности фага после инкапсуляции и в процессе хранения. Для проведения исследования образец липосомальной суспензии предварительно обрабатывали 1% раствором тритона X-100 (Servicebio, Китай) в течение 10 мин при комнатной температуре для полного разрушения липидных мембран и высвобождения инкапсулированных фаговых частиц. Далее проводили серийные десятикратные разведения и определяли титр БОЕ на газоне M. smegmatis mc² 155 на плотной питательной среде 7Н10. После адсорбции и инкубации при 37 °C в течение 24 ч проводили подсчет бляшек.

Степень инкапсуляции фага (%) характеризует эффективность включения вирусных частиц в липосомальные везикулы. После центрифугирования липосом при 14000 об/мин (Minispin, Eppendorf, Германия) проводили определение доли инкапсулированных фагов с помощью ПЦР-РВ [20]. Для амплификации использовали праймеры (НПК «Синтол», Россия): D29-F (5'-agccgatcagaagcacgggc-3') и D29-R (5'-agcggctcttaggaggggcc-3'), а также флуоресцентный ДНК-зонд Pb_D29_up_FAM (5'-(FAM)-agccacgaactcgcgacccacgg-(RTQ1)-3'). Амплификацию проводили с использованием прибора CFX96 (Bio-Rad, США). Состав реакционной смеси (25 мкл): 5 мкл образца ДНК, 1× ПЦР-буфер (500 мМ KCl, 10 мМ Tris-НCl, pH 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, смесь dNTP (по 250 мкМ каждого), 3 пмоль ДНК-зонда Pb_D29_up_FAM, 5 пмоль каждого праймера (D29-F и D29-R) и 2,5 ед. Taq-полимеразы. Протокол амплификации: начальная денатурация при 95 °C в течение 2 мин, далее 40 циклов: 15 с — 95 °C (денатурация), 40 с — 63 °C (отжиг и элонгация).

Степень инкапсуляции (Е, %) микобактериофага в липосомах рассчитывали по формуле (2):

, (2)

где Ctобщий — пороговый цикл для исходного препарата, Ctосадок — пороговый цикл для осадка, Vосадок — объем осадка, Vобщий — объем препарата.

Дзета-потенциал липосомальных препаратов измеряли методом лазерной доплеровской электрофоретической подвижности с использованием анализатора Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical, Великобритания). Данный показатель свидетельствует о коллоидной стабильности и отсутствии агрегации частиц [21].

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) позволяет визуализировать морфологию бактериофагов и липосом, оценить их размеры и целостность, а также выявить возможные структурные изменения липосомальных везикул (агрегация, фрагментация или деформация мембраны) при хранении [22]. Образцы липосомальной суспензии готовили методом отрицательного контрастирования с использованием 2% водного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (pH 7,0). Каплю препарата наносили на медные сетки, покрытые формваровой пленкой, инкубировали в течение 1 мин, после чего удаляли избыток жидкости фильтровальной бумагой и наносили контрастирующий раствор на 30 с. Избыток красителя удаляли и сетки высушивали на воздухе. Образцы визуализировали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-1400Plus (JEOL, Япония) с цифровой камерой Gatan Rio (Gatan, США) в режиме светлого поля при ускоряющем напряжении 60–80 кВ.

Параметры контроля стабильности липосомальной формы микобактериофага D29 представлены в таблице 1.

Исследование включало три последовательных этапа. На первом этапе готовили очищенный препарат микобактериофага D29 (объем 15 мл). Препарат хранили при температуре 4 °C не более 14 сут до дальнейшего использования. За 24 ч до начала второго этапа оценивали литическую активность препарата методом титрования по Грациа. В случае если титр фага определялся в диапазоне 10⁸–10⁹ БОЕ/мл, переходили к следующему этапу. Данная временная точка была обозначена как «точка 0».

На втором этапе получали липосомальную форму микобактериофага методом экструзии. После приготовления препарата отбирали пробы для комплексного анализа: определения литической активности методом Грациа (100 мкл), оценки степени инкапсуляции (2 пробы по 100 мкл), измерения дзета-потенциала (100 мкл) и ПЭМ (200 мкл). Все пробы хранили при 4 °C не более 7 сут.

На третьем этапе исследовали стабильность препарата в процессе хранения. Пробы отбирали через 1,5; 3; 4,5 и 6 мес. Объемы проб, условия анализа и температурный режим (4 °C) были идентичны таковым для исходного образца (точка 0). Для всех образцов определяли литическую активность, степень инкапсуляции, дзета-потенциал и морфологию липосом.

Все количественные измерения проводили в трех повторностях для каждой временной точки. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD).

Исследование стабильности липосомальной формы микобактериофага D29 в течение 6 мес. хранения при температуре 4 °C продемонстрировало высокую стабильность липосом (табл. 2). Литическая активность липосом сохранялась на исходном уровне значений (~10⁹ БОЕ/мл) в течение 4,5 мес. с незначительным снижением до (7,2±0,4)×10⁸ БОЕ/мл к 6 мес. Степень инкапсуляции фага также оставалась стабильной, незначительно снизившись с 34,1±1,5 до 30,2±1,8% за 6 мес., что соответствует установленному критерию (потери <15%).

Показатель дзета-потенциала сохранял стабильные значения (от –6,1±0,3 до –8,2±0,5 мВ) на протяжении всего срока хранения, что свидетельствует об отсутствии агрегации частиц и коллоидной стабильности суспензии.

Данные ПЭМ-микроскопии (рис. 1) подтвердили сохранение липосомальных везикул во всех временных точках. После 4,5 и 6 мес. хранения у части везикул отмечена измененная морфология (деформация, нарушение сферической формы), что может быть связано с частичной дестабилизацией липидной мембраны [23]. Важно, что эти изменения не привели к значительному снижению функциональной активности или степени инкапсуляции.

Сохранение литической активности в пределах одного порядка величины свидетельствует о стабильности разработанной липосомальной формы в данных условиях хранения и сохранении способности к специфическому взаимодействию с клетками-мишенями. Эти данные согласуются с результатами исследований других липосомальных фаговых препаратов, демонстрирующих сохранение активности фагов при длительном хранении [13], что является ключевым требованием для разработки и клинического применения лекарственных форм.

Относительно незначительное изменение степени инкапсуляции микобактериофага D29 в липосомах после 6 мес. хранения (более 88% от исходной степени инкапсуляции) свидетельствует об отсутствии существенной деградации липидных мембран и сохранении целостности липосомальных везикул. Представленные результаты коррелируют с данными о высокой стабильности липосом на основе фосфатидилхолина и холестерина при хранении, которая обеспечивается низкой проницаемостью и жесткостью бислоя, что препятствует деградации инкапсулированных агентов [23]. Метод ПЦР-РВ продемонстрировал свою эффективность для точного количественного определения доли инкапсулированных фаговых частиц, что ранее было показано в работе S. Cinquerrui с соавт. [20].

Постоянство дзета-потенциала указывает на отсутствие агрегации липосомальных частиц и сохранение коллоидной стабильности системы, что предотвращает флокуляцию, седиментацию и обеспечивает равномерное распределение частиц в суспензии. Эти результаты согласуются с данными о коллоидной стабильности липосом, описанными M. Immordino с соавт. [24].

Таким образом, липосомальная форма микобактериофага D29 продемонстрировала высокую стабильность по уровню литической активности, степени инкапсуляции, дзета-потенциалу после 6 мес. хранения при температуре 4 °C, что удовлетворяет установленным критериям стабильности для препаратов длительного хранения.

Настоящее исследование имеет ряд ограничений. Оценка стабильности проводилась только в условиях фиксированной температуры (4 °C), что не позволяет экстраполировать полученные данные на иные температурные режимы хранения или транспортировки. Кроме того, использованная модель in vitro не учитывает влияние биологических жидкостей и ферментов макроорганизма на целостность липосомальной мембраны. Дальнейшие этапы работы предусматривают оценку стабильности разработанной лекарственной формы в условиях, моделирующих температурные колебания, а также изучение кинетики высвобождения фага in vitro в средах, имитирующих бронхоальвеолярный лаваж, и ex vivo на изолированных макрофагах.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: В.В. Авдеев — проведение экспериментальных работ (электронная микроскопия, анализ стабильности); валидация методик; анализ данных; участие в интерпретации результатов исследования; оформление иллюстративного материала; критический анализ и доработка текста рукописи; М.Б. Лапенкова — разработка и оптимизация методик исследования; проведение экспериментальных работ (приготовление липосомальных форм, определение титра фагов, ПЦР-РВ, измерение дзета-потенциала, хранение образцов); статистическая обработка; визуализация результатов; написание и редактирование текста рукописи; М.А. Владимирский — концепция и координация исследования; формулирование целей и задач; разработка методологии исследования; интерпретация полученных данных; написание, критический анализ и доработка текста рукописи; утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows: V.V. Avdeev performed the experiments (electron microscopy, stability analysis of suspensions), validated the techniques, analyzed the data, participated in the interpretation of research results, designed illustrative material, critically analyzed and revised the manuscript; M.B. Lapenkova developed and optimized research methods, performed the experiments (preparation of liposomal forms, phage titer test, qPCR, zeta potential measurement, sample storage), processed statistical data, visualized the results, drafted and edited the manuscript; M.A. Vladimirsky conceptualized and coordinated the research, formulated the aim and objectives, developed research methodology, interpreted the data obtained, drafted, analyzed and revised the manuscript, and approved the final version for publication.

1. Global tuberculosis report 2023. Geneva: WHO; 2023.