Структурная и функциональная стабильность лиофилизированной неинкапсулированной мРНК, синтезированной in vitro, при длительном хранении

ВВЕДЕНИЕ. Низкая физико-химическая стабильность мРНК и зависимость современных мРНК-вакцин от успешности инкапсуляции в липидные наночастицы и соблюдения обязательных условий холодовой цепи ограничивают их хранение и транспортировку. Перспективным подходом является лиофилизация неинкапсулированной мРНК с последующей доставкой методом струйной инжекции. Однако сохранение ее структуры и функциональной активности при длительном хранении изучено недостаточно.

ЦЕЛЬ. Оценка структурной и функциональной стабильности лиофилизированной неинкапсулированной мРНК при длительном хранении и ее иммуногенности в составе трехвалентной мРНК-вакцины против сезонного гриппа, вводимой мышам методом струйной инжекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. мРНК-GFP (мРНК, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP)) лиофилизировали с различными криопротекторами и хранили при −20, 4 и 20 °C. Функциональную активность определяли после трансфекции клеток HEK293 по экспрессии GFP, целостность мРНК — методом микрочипового электрофореза. Иммуногенность лиофилизированной и нелиофилизированной вакцины «мРНК-Вектор-Флю» оценивали на самках инбредных мышей BALB/c после двукратной струйной иммунизации методами ИФА (иммуноферментный анализ), РТГА (реакция торможения гемагглютинации), вирус-нейтрализации и IFN-γ ELISpot (метод иммуноферментных пятен для выявления клеток, секретирующих интерферон-γ).

РЕЗУЛЬТАТЫ. По результатам предварительного скрининга для дальнейших исследований была выбрана композиция с 10% трегалозы, обеспечивавшая сохранение функциональной активности мРНК-GFP на уровне, наиболее близком к контрольному препарату. Лиофилизированная мРНК-GFP сохраняла функциональную активность после 12 мес. хранения при всех исследованных температурах; статистически значимых различий с мРНК, синтезированной непосредственно перед применением, не выявлено (p>0,05). Основная фракция мРНК сохранялась, хотя после 6–12 мес., особенно при 20 °C, выявлялись минорные фракции частично деградированной мРНК. После 3 мес. хранения вакцины при 4 °C средние геометрические титры антител к гемагглютининам вирусов гриппа H1, H3 и HB составили 1:382 000, 1:628 000 и 1:273 000 против 1:710 000, 1:628 000 и 1:328 000 в группе нелиофилизированной вакцины. Титры в РТГА составляли 1:37–1:80, вируснейтрализующих антител — 1:50–1:90; число IFN-γ-секретирующих клеток — 440 и 500 SFC (пятнообразующих клеток) на 1×10⁶ спленоцитов. Значимых межгрупповых различий не выявлено.

ВЫВОДЫ. Лиофилизация с 10% трегалозы обеспечивала сохранение функциональной активности неинкапсулированной мРНК в течение 12 мес., несмотря на признаки частичной деградации при 20 °C. После 3 мес. хранения при 4 °C трехвалентная вакцина сохраняла способность индуцировать гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ у мышей. Полученные данные подтверждают перспективность сочетания лиофилизации и струйной инжекции для разработки стабильных мРНК-вакцин.

1. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines — A new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov. 2018;17(4):261–79. https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243

2. Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov. 2021;20(11):817–38. https://doi.org/10.1038/s41573-021-00283-5

3. Chheda U, Pradeepan S, Esposito E, et al. Factors affecting stability of RNA — Temperature, length, concentration, pH, and buffering species. J Pharm Sci. 2024;113(2):377–85. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2023.11.023

4. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078–94. https://doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0

5. Crommelin DJA, Anchordoquy TJ, Volkin DB, et al. Addressing the cold reality of mRNA vaccine stability. J Pharm Sci. 2021;110(3):997–1001. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.12.006

6. Oude Blenke E, Örnskov E, Schöneich C, et al. The storage and inuse stability of mRNA vaccines and therapeutics: Not a cold case. J Pharm Sci. 2023;112(2):386–403. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2022.11.001

7. Packer M, Gyawali D, Yerabolu R, et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 2021;12(1):6777. https://doi.org/10.1038/s41467-021-26926-0

8. Wang C, Tang X, Jiang C, et al. Intradermal delivery of SARS-CoV-2 RBD3-Fc mRNA vaccines via a needle-free injection system induces robust immune responses in rats. Front Immunol. 2025;16:1530736. https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1530736

9. Abbasi S, Matsui-Masai M, Yasui F, et al. Carrier-free mRNA vaccine induces robust immunity against SARS-CoV-2 in mice and non-human primates without systemic reactogenicity. Mol Ther. 2024;32(5):1266–83. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.03.022

10. Kisakov DN, Karpenko LI, Kisakova LA, et al. Jet injection of naked mRNA encoding the RBD of the SARS-CoV-2 spike protein induces a high level of a specific immune response in mice. Vaccines (Basel). 2025;13(1):65. https://doi.org/10.3390/vaccines13010065

11. Sharabrin SV, Ilyichev AA, Kisakov DN, et al. Needle-free jet-delivered mRNA-vaccine encoding influenza A(H1N1)pdm09 hemagglutinin protects mice from lethal virus infection. Mol Biol. 2025;59(3):376–89. https://doi.org/10.1134/S0026893325700062

12. Yakovlev VA, Litvinova VR, Rudometova NB, et al. Immunogenic and protective properties of mRNA vaccine encoding hemagglutinin of avian influenza A/H5N8 virus, delivered by lipid nanoparticles and needle-free jet injection. Vaccines (Basel). 2025;13(8):883. https://doi.org/10.3390/vaccines13080883

13. Muramatsu H, Lam K, Bajusz C, et al. Lyophilization provides long-term stability for a lipid nanoparticle-formulated, nucleoside-modified mRNA vaccine. Mol Ther. 2022;30(5):1941–51. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2022.02.001

14. Suzuki Y, Miyazaki T, Muto H, et al. Design and lyophilization of lipid nanoparticles for mRNA vaccine and its robust immune response in mice and nonhuman primates. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;30:226–40. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.09.017

15. Khan MFH, Baudin F, Sudalaiyadum Perumal A, Kamen AA. Freeze-drying of mRNA-LNPs vaccines: A review. Vaccines (Basel). 2025;13(8):853. https://doi.org/10.3390/vaccines13080853

16. Arte KS, Chen M, Patil CD, et al. Recent advances in drying and development of solid formulations for stable mRNA and siRNA lipid nanoparticles. J Pharm Sci. 2025;114(2):805–15. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2024.12.013

17. Sharabrin SV, Krasnikova SI, Kisakov DN, et al. A naked lyophilized mRNA vaccine against seasonal influenza, administered by jet injection, provides a robust response in immunized mice. Vaccines (Basel). 2026;14(1):56. https://doi.org/10.3390/vaccines14010056

18. Gross FL, Bai Y, Jefferson S, et al. Measuring influenza neutralizing antibody responses to A(H3N2) viruses in human sera by microneutralization assays using MDCK-SIAT1 cells. J Vis Exp. 2017;(129):56448. https://doi.org/10.3791/56448

19. Gonzalez TJ, Boothby TC. Properties governing dry-state stability of RNA in amorphous sugar formulations. Commun Mater. 2025;6:129. https://doi.org/10.1038/s43246-025-00850-y

20. Liu XH, Song HP, Tao LL, et al. Trehalose-loaded LNPs enhance mRNA stability and bridge the in vitro–in vivo efficacy gap. npj Vaccines. 2025;10:201. https://doi.org/10.1038/s41541-025-01253-3

21. Khan MFH, Sudalaiyadum Perumal A, Kamen AA. Investigation on a freeze-drying process for long-term stability of mRNA-LNPs. Vaccines (Basel). 2026;14(3):242. https://doi.org/10.3390/vaccines14030242