Иммунобиологические свойства циркулирующих штаммов Bordetella pertussis: кандидатные штаммы для изготовления коклюшных вакцин

ВВЕДЕНИЕ

Коклюш — высококонтагиозная острая респираторная инфекция, вызываемая бактерией Bordetella pertussis, исторически была основной причиной детской смертности во всем мире [1][2]. В 40–50-х годах XX века применение цельноклеточной коклюшной вакцины (ЦКВ) в развитых странах практически привело к искоренению коклюша. Реактогенность ЦКВ, выражающаяся в болезненности места инъекции, раздражительности и повышении температуры тела, послужила стимулом для разработки и внедрения бесклеточной коклюшной вакцины (БКВ) как менее реактогенного и более стандартизованного препарата. Однако препараты БКВ не оправдали связанных с их применением надежд. Заболеваемость коклюшем возросла на фоне широкого охвата населения прививками БКВ; стали регистрировать эпидемии [3][4]. По мнению ряда ученых [5–8], существует тесная связь между использованием БКВ и возрождением коклюша, что порождает важные вопросы эффективности БКВ и их способности контролировать заболеваемость.

Выделяют несколько основных причин роста заболеваемости коклюшем. Естественная инфекция и вакцины индуцируют различные виды иммунитета. Естественная инфекция и ЦКВ индуцируют Т-клеточный ответ со смещением к Th1/Th17, а БКВ — со смещением к Th2/Th17 [9]. Такое различие вносит вклад в более короткую продолжительность иммунитета и снижение защиты от инфекции при использовании БКВ по сравнению с ЦКВ. Так, введение БКВ не защищало иммунизированных обезьян-бабуинов от колонизации B. pertussis, что позволило носителям передавать бактерии неинфицированным особям [10].

Изменение иммунитета хозяина и общей эпидемиологической ситуации оказывают влияние на популяцию B. pertussis. F.R. Mooi с соавт. утверждали, что популяция B. pertussis развивается под давлением коллективного иммунитета, вызванного БКВ, и что адаптация патогена к имеющемуся уровню иммунитета является одной из причин возрождения коклюша [6]. Адаптацию бактериальных клеток B. pertussis к поствакцинальному иммунитету отмечали и ранее при использовании ЦКВ, но при переходе к использованию БКВ адаптация значительно ускорилась. Адаптация популяции B. pertussis происходит посредством мутаций в промоторных областях генов и областях генома, кодирующих антигены, которые входят также в состав БКВ. Мониторинг циркулирующих штаммов позволил выявить штаммы B. pertussis с мутациями в генах, кодирующих защитные антигены, что вносит вклад в уклонение патогена от иммунной системы [7][8][11–16]. Помимо расхождения состава нуклеотидов в генах (возникновение аллелей одного гена) циркулирующих штаммов и штаммов, входящих в состав БКВ, уклонение от иммунного ответа, вызванного вакциной, может быть связано с полной остановкой экспрессии антигенов. Такое явление наблюдалось для пертактина, белка внешней мембраны, который способствует адгезии B. pertussis к эпителиальным клеткам хозяина [4][17]. Учитывая возникающие отличия в структуре генов, кодирующих защитные антигены циркулирующих и вакцинных штаммов, крайне важно своевременно обнаруживать снижение эффективности коклюшных вакцин. Таким образом, мониторинг изменений иммунобиологических свойств штаммов B. pertussis, которые обусловливают дальнейшую адаптацию возбудителя в ответ на вакцинацию [18], представляет собой современный инструмент контроля эффективности вакцинопрофилактики.

Цель работы — сопоставление иммунобиологических свойств выделенных изолятов циркулирующих штаммов Bordetella pertussis и производственных штаммов, используемых для изготовления цельноклеточной коклюшной вакцины.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Штаммы. В исследовании использовались изоляты современных циркулирующих штаммов Bordetella pertussis 16-16, 31(2)-17, 28(1)-18, 25-16, 33-18, 37-18, 30-18, 1-20, 2-20, выделенные от детей с коклюшем. Штаммы хранятся в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Иммунобиологические свойства штаммов исследовали, используя серии вакцин, полученные из каждого штамма. Серии вакцин были изготовлены в соответствии с регламентом производства коклюшной вакцины № 136-69.

Сыворотки. Серотиповой состав штаммов и их способность экспрессировать свойственные им агглютиногены (фимбрии) определяли с использованием сывороток коклюшных к агглютиногенам 1, 2, 3, адсорбированных для реакции агглютинации сухих (АО «НПО Микроген», Россия).

Питательная среда. Штаммы B. pertussis культивировали на питательной среде КУА (АО «НПО Микроген», Россия). В среду добавляли кровь барана до финальной концентрации 10%.

Стандартные образцы. Для оценки защитной (иммуногенной) и гистаминсенсибилизирующей активностей использовали следующие стандартные образцы: фармакопейный стандартный образец (ФСО) иммуногенной активности коклюшной вакцины ФСО.3.2.00089¹; ФСО.3.2.00087 гистаминсенсибилизирующей активности коклюшной вакцины²; ФСО.3.1.00086 мутности бактериальных взвесей 5 МЕ³.

Экспериментальные животные. Испытания проводили на аутбредных мышах самцах и самках с массой тела 15±1 г; на инбредных мышах самцах и самках линии F1 (C57Bl/6J×CBA) с массой тела 11±1 г; 4-дневных аутбредных мышах. Линия инбредных мышей была выбрана с учетом ее чувствительности к действию коклюшного токсина. Животные поступали из питомника филиала «Андреевка» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России и находились в виварии при стандартных условиях с неограниченным доступом к пище и воде. Температура и относительная влажность в помещении вивария составляла 20–24 °С и 45–65% соответственно. Наблюдение за животными заключалось в ежедневном посещении и внесении записей о состоянии животных в листах регистрации опытов. При оценке защитной активности штаммов B. pertussis регистрировали падеж животных. При оценке специфической токсичности измеряли массу тела мышей. При определении дермонекротического токсина измеряли величину геморрагического некроза, сформировавшегося в месте введения коклюшной суспензии. Эвтаназию вышедших из опыта животных проводили посредством подачи углекислого газа в специальной установке, обеспечивающей гуманное умерщвление животных. Протокол исследования с использованием экспериментальных животных был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (Протокол № 13 от 11.08.2025). Все исследования проводили в соответствии с рекомендациями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях⁴; принципами Международного совета медицинских научных обществ (CIOMS)⁵; Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях⁶; ГОСТ 33216-2014⁷; Решением ЕЭК от 03.11.2016 № 81⁸, Рекомендациями Коллегии ЕЭК от 14.11.2023 № 33⁹; ОФС.1.7.2.0005.15¹⁰ и ФС.3.3.1.0010.15¹¹.

Методы

Изготовленные коклюшные вакцины оценивались по следующим показателям: серологические свойства и антигенная структура (серотипы); гемагглютинирующая, гемолитическая, дермонекротическая активности; вирулентность; остаточная токсичность (тест изменения массы тела мышей); гистаминсенсибилизирующая активность (ГСА) и защитные свойства. Помимо этого, бактериальная культура B. pertussis оценивалась по морфологическим и культуральным свойствам.

Исследование изолятов циркулирующих штаммов проводили согласно МУК 4.2.2317-08¹². Для оценки соответствия изолятов циркулирующих штаммов требованиям, предъявляемым к производственным штаммам, из каждого штамма была изготовлена ЦКВ.

Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Office 2016. Данные по защитной активности обрабатывали путем расчета среднегеометрических значений показателей. Показатель специфической безопасности выражали относительной величиной (%), которую рассчитывали как отношение прироста массы тела вакцинированных животных к приросту массы тела животных контрольной группы. Содержание агглютиногенов соответствовало последнему разведению коклюшной вакцины или титру, при котором проходит реакция со специфической сывороткой на 3 креста; ГСА выражали величиной индекса, который рассчитывали как отношение ГСД_50ФСО к ГСД_{50вакцины}. ГСД_50ФСО обозначает дозу ФСО.3.2.00087 гистаминсенсибилизирующей активности коклюшной вакцины, соответствующей гибели 50% иммунизированных животных после введения гистамина. ГСД_{50вакцины} обозначает дозу вакцины, соответствующую гибели 50% иммунизированных животных после введения гистамина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генотипическая характеристика исследуемых производственных и циркулирующих штаммов B. pertussis впервые представлена О.Ю. Борисовой с соавт. [19]. В таблице 1 приведен результат дополнительного анализа ранее полученных данных, который демонстрирует, что генотипы производственных штаммов значительно отличаются по спектру аллельных вариантов защитных антигенов от генотипов циркулирующих штаммов. Так, общими для некоторых штаммов являются ptxA1, ptxВ2 и fim3-1, тогда как исследуемые штаммы различаются по другим аллелям генов, кодирующих защитные антигены ptxС, ptxР, prn и fim2 (табл. 1).

В соответствии с МУК 4.2.2317-08¹³, циркулирующие штаммы B. pertussis исследовали по следующим показателям: «Морфология», «Культуральные свойства», «Серологические свойства», «Антигенная структура (серотипы)», «Гемагглютинирующая и гемолитическая активность», «Дермонекротическая активность», «Вирулентность», «Токсичность (остаточная токсичность)», «Защитные свойства».

По морфологическим и культуральным свойствам бактерии выделенных штаммов соответствовали требованиям к производственным штаммам. Такие свойства характерны для гладкой S-формы (фаза I) бактерий B. pertussis. Другие иммунобиологические свойства циркулирующих штаммов представлены в таблице 2.

Серотиповой состав. Оценка антигенной структуры показала, что подавляющее большинство штаммов B. pertussis имели серотиповой состав 1.0.3; все выделенные штаммы активно экспрессировали свойственные им фимбрии. Культуры агглютинировались соответствующими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 при разведении сыворотки ≥1:2560. В соответствии с нормативными требованиями разведение сыворотки должно составлять не менее 1:1280. Производственные штаммы имеют серотиповой состав 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3. Среди циркулирующих штаммов отсутствовали бактерии, экспрессирующие одновременно фимбрии 2 и 3, то есть серотип 1.2.3 не выявлен. Таким образом, 6 из 8 циркулирующих штаммов имели серотиповой состав 1.0.3, а остальные два штамма — 1.2.0.

Гемагглютинирующая активность. Все штаммы B. pertussis обладали гемагглютинирующей активностью и агглютинировали эритроциты барана на 3 креста (3+). В соответствии с нормативными требованиями коклюшная суспензия мутностью 10 МЕ должна агглютинировать эритроциты барана на 2 креста (2+). По гемагглютинирующей активности можно выделить активные штаммы. Штаммы 16-16, 31(2)-17, 28(1)-18, 37-18 давали агглютинацию на 3+ в концентрации 10–20 млрд/мл, а штаммы 25-16, 33-18, 30-18 — в концентрации 5 млрд/мл. Наибольшую активность проявили штаммы 1-20 и 2-20; агглютинация на 3+ в разведении 0,313 млрд/мл.

Гемолитическая активность. Все штаммы проявили гемолитическую активность. Единичные колонии бактериальных клеток B. pertussis в тонком слое среды Борде — Жангу были окружены зоной гемолиза.

Дермонекротическая активность была подтверждена при подкожном введении культуры 4-дневным аутбредным мышам. В месте введения живой культуры в концентрации 20 млрд/мл образовывался геморрагический некроз, что соответствовало нормативным требованиям к производственным штаммам B. pertussis.

Вирулентность. Культура B. pertussis должна быть вирулентной для мышей. При внутримозговом заражении значение LD₅₀ не должно превышать 25 млн микробных клеток (мкр. клеток)¹⁴. Циркулирующие штаммы проявили высокую вирулентность, поскольку значения LD₅₀ составляли от 3,623 до 0,851 млн мкр. клеток.

Остаточная токсичность штаммов обусловлена присутствием в вакцине остаточного количества не полностью обезвреженного коклюшного токсина и присутствием липоолигосахарида. Показатель определяли в рекомендованном ВОЗ тесте по изменению массы тела мышей и оценке ГСА. Остаточную токсичность оценивали на протяжении всего срока годности вакцины (1 год). В начале срока хранения вакцины значение показателя специфической токсичности, отражающего остаточную токсичность препарата, находилось практически на самом низком допустимом уровне. В соответствии с требованиями МУК 4.2.2317-08¹⁵ значение показателя должно быть ≥60%. Однако к концу срока годности значения показателя практически у всех циркулирующих штаммов возросли до ≥90%, что указывало на эффективную детоксикацию коклюшного токсина и пролонгированное действие формальдегида, добавляемого в вакцину для нейтрализации токсинов бактериальных клеток B. pertussis. Данное наблюдение указывает на то, что для получения менее реактогенной АКДС-вакцины для сведения с дифтерийным и столбнячным компонентами следует использовать коклюшную суспензию, которая находилась максимально долго (желательно в течение всего срока годности, 1 год) в условиях детоксикации коклюшных токсинов [20]. Добавление формальдегида и особенность его действия необходимо учитывать для получения более безопасного препарата коклюшной вакцины [20].

Защитная активность. Оценка защитной активности коклюшных вакцин, изготовленных из изолятов циркулирующих штаммов, показывает, что 2 штамма, 16-16 и 33-18 B. pertussis, обладают выраженной защитной активностью (табл. 2). Это соответствует нормативному требованию, согласно которому защитная активность должна быть ≥8 МЕ/мл. Полученные результаты по оценке защитной активности штаммов 25-16, 37-18, и 2-20 B. pertussis нуждаются в подтверждении из-за ограниченности опытного материала. Остальные четыре штамма обладают слабой защитной активностью (<8 МЕ/мл).

Таким образом, сопоставление иммунобиологических свойств изолятов циркулирующих штаммов B. pertussis на соответствие нормативным требованиям к производственным штаммам показывает, что все девять изученных штаммов обладают набором свойств, характерных для S-формы бактерий. Все выделенные штаммы активно экспрессируют агглютиногены (фимбрии) и обладают гемагглютинирующей, гемолитической, гистаминсенсибилизирующей, дермонекротической активностями, выраженной вирулентностью и низкой остаточной токсичностью (на момент окончания срока хранения). Два из девяти изученных штаммов продемонстрировали требуемую защитную активность.

Выраженные различия между производственными и циркулирующими штаммами были выявлены при изучении их генотипического разнообразия. Полученные авторами более ранние данные [19] согласуются с данными зарубежных источников и указывают на то, что аллели генов пертактина prn2, коклюшного токсина ptxA1 и промотора коклюшного токсина ptxP3 являются доминирующими [7][21]. Циркулирующие бактерии B. pertussis, несущие эти аллели, могут иметь преимущества в популяции лиц, вакцинированных БКВ с устаревшими вакцинными штаммами в своем составе. Данный фактор может влиять на вакцины, снижая их эффективность.

В настоящее время бактерии B. pertussis, несущие аллель ptxP3, считают причиной эпидемий во всем мире. В конце 80-х годов ХХ века были впервые обнаружены штаммы с аллелем ptxP3, которые теперь встречаются повсеместно. В ряде стран мира частота встречаемости таких штаммов составляет >90%, что ведет к замещению популяции B. pertussis с аллелем ptxP1 [22–24]. Данным штаммам свойственна устойчивость к антибиотикам группы макролидов [12]. Кроме того, штаммы с аллелем ptxP3 продуцируют в 1,6 раза больше коклюшного токсина, чем штаммы с аллелем ptxP1 [25].

Более интенсивная продукция коклюшного токсина штаммами B. pertussis с аллелем ptxP3 по сравнению с ptxP1 объясняет их быстрое глобальное распространение. Коклюшный токсин играет центральную роль в подавлении врожденной и приобретенной формы иммунного ответа [26]. Повышенная продукция коклюшного токсина, с одной стороны, задерживает эффективный иммунный ответ, усиливая передачу возбудителя и, следовательно, приспособленность патогена. Повышенная продукция коклюшного токсина, с другой стороны, может быть выгодной для возбудителя, поскольку организм вынужден вырабатывать более высокие уровни специфических антител для нейтрализации токсина. Коклюшный токсин вызывает патологический лейкоцитоз, связанный с повышенной смертностью младенцев из-за развития легочной гипертензии [27]. Таким образом, распространение штаммов B. pertussis с аллелем ptxP3 может привести к увеличению заболеваемости коклюшем и смертности, в пользу чего есть доказательства высокой вирулентности подобных штаммов [25][28].

Таким образом, ранее высказанное мнение о том, что рост заболеваемости коклюшем обусловлен в основном ослаблением иммунитета, является недостаточно полным. После введения вакцинации были отмечены значительные изменения в популяциях B. pertussis, что предполагает адаптацию патогенов в возобновлении и поддержании коклюша. Адаптация заключается в антигенной дивергенции с вакцинными штаммами и повышенной выработке коклюшного токсина. Антигенная дивергенция влияет на формирование Т-клеток памяти и способность антител эффективно распознавать антиген.

Более высокие уровни коклюшного токсина могут усилить подавление иммунного ответа в организме. По-видимому, эта адаптация B. pertussis привела к сокращению периода эффективного действия коклюшных вакцин и ускорению ослабления иммунитета [6]. Таким образом, вакцины, в состав которых входят устаревшие вакцинные штаммы, не могут эффективно защищать население от современных циркулирующих штаммов B. pertussis, результатом чего является рост заболеваемости коклюшем и возникновение эпидемий. Например, в Российской Федерации показатель заболеваемости коклюшем составил 36,2 на 100 тыс. населения в 2023 г., что в 16,4 раза выше аналогичного показателя 2022 г.¹⁶ [29].

Анализ результатов исследований антигенного полиморфизма клинических изолятов указывает на целесообразность периодической замены производственных штаммов на штаммы, которые преобладают в настоящее время в популяции [6][30]. В документе «Стратегия развития иммунопрофилактики инфекционных болезней на период до 2035 г.»¹⁷ подчеркивается необходимость создания, поддержания и пополнения банка производственных штаммов микроорганизмов с целью обеспечения российских производителей иммунобиологических препаратов образцами производственных штаммов. Два выделенных штамма, 16-16 и 33-18 B. pertussis, имеют современный геном и соответствуют нормативным требованиям к производственным коклюшным штаммам (МУК 4.2.2317-08¹⁸). Данные штаммы могут рассматриваться в качестве кандидатных для введения в состав российской ЦКВ в целях замены устаревших производственных штаммов и могут быть использованы при производстве БКВ.

Мониторинг циркулирующих штаммов B. pertussis важен для выявления спектра генетических изменений, влияющих на адаптацию патогена в условиях вакцинопрофилактики [18]. Перманентная эволюция генома бактерий B. pertussis актуализирует применение комплексного подхода с включением анализа характеристик вакцин, результатов мониторинга циркулирующих штаммов и взаимодействий между ними для решения проблемы роста заболеваемости коклюшем.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ иммунобиологических свойств выделенных в 2016–2020 гг. изолятов циркулирующих штаммов B. pertussis и производственных штаммов, используемых для изготовления цельноклеточной коклюшной вакцины.
2. Анализ иммунобиологических свойств циркулирующих штаммов B. pertussis показывает, что изоляты 16-16 и 33-18 соответствуют всем требованиям к производственным штаммам, изложенным в МУК 4.2.2317-08 Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий.
3. Штаммы 16-16 и 33-18 B. pertussis обладают современным генотипом и перспективны с точки зрения их практического использования в качестве кандидатов для замены устаревших производственных штаммов при изготовлении коклюшных вакцин.
4. Учитывая, что под давлением коллективного иммунитета постоянно происходит адаптация B. pertussis к имеющемуся уровню иммунитета, актуальным представляется регулярное проведение мониторинга генотипов и иммунобиологических свойств циркулирующих штаммов B. pertussis с целью своевременной замены в профилактических препаратах устаревших штаммов на современные.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.А. Алексеева — формулирование цели работы, анализ и систематизация данных научной литературы, анализ и интерпретация результатов исследования, написание и редактирование текста рукописи; Д.Н. Лепихова — проведение экспериментов, сбор и анализ данных научной литературы, редактирование текста рукописи; О.Ю. Борисова — планирование исследования, сбор и анализ данных научной литературы, анализ и интерпретация результатов исследования, редактирование текста рукописи; А.С. Пименова — проведение экспериментов, анализ и интерпретация результатов исследования; редактирование текста рукописи; И.Ю. Андриевская, И.В. Ибрагимхалилова — проведение экспериментов, сбор и анализ данных научной литературы, работа с иллюстративным материалом.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (протокол № 13 от 11.08.2025).

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. I.A. Alekseeva formulated research goals and objectives, analysed and systematised scientific literature data, analysed and interpreted research results, drafted and edited the manuscript text. D.N. Lepikhova conducted experimental research, collected and analysed scientific literature data, and edited the manuscript. O.Yu. Borisova planned the research, generalised experimental data, analysed and interpreted the results, analysed and generalised scientific literature data, and edited the manuscript. A.S. Pimenova conducted experiments, analysed and interpreted research results, and edited the manuscript. I.Yu. Andrievskaya, I.V. Ibragimkhalilova conducted experiments, collected and analysed scientific literature data, and worked with graphic material.

Ethics approval. Local Ethics committee of Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products approved the study under Meeting minutes No. 13 of 11 August 2025.