Респираторные вирусы являются основной причиной инфекционных заболеваний у людей. Более 90% вирусов, поражающих дыхательные пути, такие как вирус гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, риновирус, аденовирус и коронавирус, могут вызывать тяжелые заболевания [1][2]. Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) поражают носоглотку, ротоглотку, гортань, трахею, легкие, уши. Респираторные вирусы попадают в организм через дыхательные пути и в основном передаются от человека к человеку путем вдыхания респираторных капель или аэрозолей, выделяемых при кашле и чихании. Нос и рот являются основными местами проникновения вируса. Инкубационный период ОРВИ составляет от 1 до 4 сут в зависимости от конкретного патогена [3]. В настоящее время существующее лечение острой инфекции верхних дыхательных путей является по сути симптоматическим. Осельтамивир — наиболее широко известный противовирусный препарат, однако он специфичен только в отношении вируса гриппа типа А [4].

Интерферон альфа-2b (ИФНα-2b) является биологическим препаратом с иммуномодулирующими свойствами и действует в отношении ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Интерферон участвует в иммунном ответе первой линии защиты организма для предотвращения и искоренения инфекций, вызванных любым из известных респираторных вирусов. Интерферон, связываясь со специфическим рецептором на поверхности клеточной мембраны, запускает внутриклеточные сигнальные каскады, главным образом канонический каскад Jak-STAT [5]. Активация каскада приводит к индукции экспрессии генов, содержащих интерферон-стимулированные элементы (interferon-sensitive response element, ISRE), посредством транскрипционного фактора ISGF3 [6]. Синтезированные интерферон-стимулированные белковые факторы нацелены на ингибирование репликации вирусов на разных стадиях их жизненного цикла [7] и активацию иммунитета [8][9] и участвуют в формировании противовирусной защиты клеток еще до контакта с вирусом.

Применение ИФНα-2b в виде аэрозолей и спреев для лечения и профилактики вирусных инфекций в носоглотке и верхних дыхательных путях имеет такие преимущества, как прямое действие на слизистую оболочку, высокая эффективность и благоприятный профиль безопасности [10]. Такие способы введения интерферона в организм приводят к немедленной и мощной активации иммунной системы, которая не зависит от концентрации интерферона в крови и вызывает минимальные побочные эффекты [11]. Широкий опыт клинического применения препаратов на основе ИФНα-2b и их эффективность позволили рассмотреть высокодозные формы в качестве перспективного средства этиотропной терапии гриппа и ОРВИ, в том числе COVID-19. Новая лекарственная форма «капли для ингаляций, 10 млн МЕ/мл» позволит расширить возможности лечения тяжелых форм респираторных вирусных инфекций.

Цель работы — доклиническое исследование эффективности, субхронической токсичности и токсикокинетики нового лекарственного препарата на основе ИФНα-2b при ингаляционном пути введения.

Задачи исследования — изучение эффективности лекарственного препарата на модели гриппозной пневмонии мышей, субхронической токсичности (с периодом отсроченного наблюдения), безопасности, местной переносимости и токсикокинетики на крысах.

Исследование проводили в соответствии с российскими и международными требованиями, а также в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice)1.

В исследовании использовали экспериментальный лекарственный препарат (ЛП) «Гриппферон® форте, капли для ингаляций 10 млн МЕ/мл» (ООО «Фирн М», Россия). Действующим веществом ЛП является человеческий рекомбинантный ИФНα-2b. В качестве плацебо в исследованиях токсичности и токсикокинетики использовали раствор входящих в состав ЛП вспомогательных веществ, то есть без добавления рекомбинантного ИФНα-2b.

Лабораторные животные содержались в стандартных условиях при температуре 18–26 °C и относительной влажности воздуха 30–70% с 12-часовым световым циклом. Корм и воду обеспечивали аd libitum. Все процедуры были проведены в соответствии с Директивой Европейского союза 2010/63/EU и Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

В ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» изучали эффективность ЛП. При моделировании гриппозной инфекции была проведена адаптация штамма вируса гриппа А/Калифорния/04/2009 (A(H1N1)pdm2009) на самках мышей линии BALB/c. Данная модель позволяет оценить симптомы пневмонии, в том числе поражение легочной ткани. Животных получали из биопитомника ООО «СМК СТЕЗАР».

Изучение токсичности и токсикокинетики ЛП проводили на самцах и самках беспородных белых крыс возрастом 6–8 нед. в ООО «ФАРМАКОГЕН». Животные были получены из НИЦ «Курчатовский институт» — ПЛЖ «Рапполово».

Схема изучения эффективности ЛП представлена в таблице S1 (опубликована на сайте журнала2). Мыши были распределены на 5 групп по 15 животных в каждой. При формировании выборок животных руководствовались рекомендациями Организации экономического сотрудничества и развития3. В группы для оценки выживаемости были включены ≥10 особей. Препараты вводили животным 2 раза/сут. Животные в группах № 1, 3 и 4 подвергались ингаляционному введению веществ в течение 8 сут с помощью небулайзера. Пять животных из каждой группы помещали в ингаляционную камеру и проводили ингаляцию ЛП в течение 10 мин (объем 3 мл). Животным из групп № 1 и 5 исследуемые препараты вводили внутрижелудочно в течение 5 сут.

Ингаляционную терапию проводили с помощью небулайзера «OMRON C25 компрессорный медицинский» (Omron, Италия) при следующих установках: выход аэрозоля — не менее 0,3 мл/мин (0,9% натрия хлорид); подача аэрозоля — от 0,2 до 0,3 мл (2 мл, 1% натрия фторид); скорость подачи аэрозоля — от 0,05 до 0,08 мл/мин (2 мл, 1% натрия фторид). В рабочую камеру небулайзера вносили 3 мл 0,9% раствора натрия хлорида, нагретого до температуры 28–30 °С, и добавляли лечебную дозу препарата до конечной концентрации 923 000 или 451 000 МЕ/кг. При работе небулайзера ЛП переходил в состояние мелкодисперсного аэрозоля; при контакте с дефлектором крупные частицы разбивались на более мелкие с аэродинамическим диаметром от 2,50 до 2,75 мкм. Согласно методическим рекомендациям4 был выбран способ воздействия «все тело», предполагающий использование камеры для проведения ингаляционной терапии. Ингаляционная камера представляла собой пластиковый контейнер размером 35×20×15 см (длина×ширина×высота) с отверстиями в крышке контейнера, закрытыми фильтровальной бумагой. Камера соединялась с небулайзером посредством силиконовой трубки напрямую без использования вкладышей и насадок. Для терапевтического воздействия в ингаляционную камеру помещали по 5 животных одной группы и проводили ингаляцию различных доз ЛП в объеме 3 мл в течение 10 мин.

На вторые сутки от начала эксперимента мышей интраназально инфицировали вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (A(H1N1)pdm2009) в дозе 10⁴,⁵ ТЦИД50/0,1мл, адаптированного к мышам; ТЦИД50 — тканевая цитопатическая инфекционная доза, вызывающая гибель 50% клеток. Наблюдение за животными осуществляли в течение 16 сут — оценивали динамику массы тела животных, продолжительность жизни и выживаемость. Эвтаназию животных проводили на 16 сут после заражения путем дислокации шейных позвонков.

Через 4 сут после заражения в каждой группе подвергали эвтаназии 5 мышей. В стерильных условиях извлекали легкие, гомогенизировали и ресуспендировали в 1 мл холодного стерильного 10 мМ фосфатно-солевого буфера pН 7,2 (кат. № В-60201, «Эко-Сервис», Россия). Суспензию осветляли от клеточного дебриса путем центрифугирования при 2000 g в течение 10 мин. Полученный супернатант (проба вируса) использовали для заражения. Для определения инфекционного титра вируса использовали неразведенную пробу вируса и пробы в разведениях до 1×10⁻⁸ и клетки MDCK5 со средней плотностью 30 000–35 000 клеток на лунку. После фиксирования и инкубирования измеряли оптическую плотность (ОП) при длине волны 570 нм на мультимодальном планшетном ридере Varioskan™ (Thermo Scientific, США). Образцы в лунках считали положительными, если значения ОП в них были меньше на 20% по сравнению с контролем. Инфекционный титр вируса определяли по методу Рида и Менча при измерениях каждой пробы в 4-кратной повторности и выражали в log10ТЦИД50/0,1 мл. Затем рассчитывали среднее значение титра для пяти одинаковых проб [12].

Исследование субхронической токсичности ЛП проводили на беспородных белых крысах обоих полов. Небулайзер компрессионный LD-211 С (Little Doctor International (S) Pte. Ltd., Сингапур) и ингаляционный распылитель LD-N001 тип А (Little Doctor International (S) Pte. Ltd., Сингапур) использовали для проведения ингаляций каждого животного 1 раз/сут в течение 28 сут. Животное помещали в индивидуальный рестрейнер (удерживающее устройство) с конусообразным подвижным фиксатором в области головы и отверстием, что позволяло области носа оставаться свободной. После фиксации головы животного на конус устанавливали небольшую дыхательную маску, подключенную непосредственно к резервуару для ингаляционного раствора небулайзера. В работе использовали распылитель с размером частиц 3,5 мкм (масс-медианный аэродинамический диаметр). После ингаляции животное из рестрейнера помещали в клетку содержания.

Расчет экспериментальных доз основывался на дозах, указанных в проекте инструкции ЛП. Максимальная разовая доза для человека с массой тела 70 кг составляет 5 000 000 МЕ 2 раза/сут или 10 000 000 ME/сут. Таким образом, первая экспериментальная доза препарата составляла 880 952 МЕ/кг/сут, или 0,022 мл ЛП, для крысы средней массой 250 г (с учетом межвидового коэффициента переноса для крыс, равного 6,1). Данная доза в 5,3 раза превышала терапевтическую дозу для человека. Вторая экспериментальная доза превышала первую в 10 раз и составила 8 809 520 МЕ/кг/сут, или 0,22 мл ЛП, что в 53 раза превышает терапевтическую дозу для человека. Животные в группах Плацебо и Контроль получали соответствующие объемы веществ. Используя метод простой рандомизации по критерию массы тела, животных распределяли в 5 групп по 12 самцов и 12 самок в каждой группе. Схема эксперимента представлена в таблице 1.

Ежедневное наблюдение за животными осуществляли в течение 4-недельного введения препаратов, а также в течение 2 нед. после отмены препаратов. Клинический осмотр животных проводили ежедневно. Динамику массы и температуры тела, а также динамику суточного потребления корма и воды регистрировали еженедельно. Животных взвешивали на весах EW-12Ki (AND, Япония). Температуру тела измеряли с использованием электрического термометра Oakton 10T (Oakton Instruments, США).

Физиологические (in vivo) и лабораторные (in vitro) исследования проводили до начала введения препаратов для определения фоновых значений показателей и на 4-й и 6-й нед. после начала введения препаратов. Для оценки поведения животных проводили тест «Открытое поле» на арене ООО «НПК Открытая наука» (Россия). Систолическое артериальное давление у бодрствующих животных измеряли с помощью системы неинвазивного измерения кровяного давления у грызунов «Систола» (ООО «Нейроботикс», Россия). Электрокардиографию у ненаркотизированных крыс выполняли с помощью электрокардиографа «Поли-Спектр-8В» (ООО «Нейрософт», Россия). Электрокардиограммы анализировали при помощи пакета программ (ООО «Нейрософт», Россия) во втором стандартном отведении: измеряли величину зубцов Р, R, S, T и продолжительность интервалов PQ и QT. Частоту дыхательных движений у ненаркотизированных крыс определяли с помощью комплекса оценки кардиореспираторной системы мелких лабораторных животных КОКС-2 (ООО «МКС», Россия).

Гематологический (общий) анализ образцов крови проводили на ветеринарном анализаторе URIT-3020 Vet Plus (URIT Medical Electronic Co., Ltd, Китай). Образцы крови отбирали из хвостовой вены животного в пробирки с К2 ЭДТА Impromini (Guangzhou Improve Medical Instruments Co., Ltd, Китай). Образцы крови для проведения биохимического анализа собирали в пробирки Improvacuter (Guangzhou Improve Medical Instruments Co., Ltd, Китай), содержащие активатор свертывания, после чего центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин на центрифуге медицинской СМ-6 МТ (ELMI, Латвия) и отбирали фракцию сыворотки крови. Биохимические параметры крови (АЛТ, АСТ, общий белок, альбумин, общий билирубин, щелочная фосфатаза, креатинин, мочевина, триглицериды, холестерин и глюкоза) измеряли на автоматическом биохимическом анализаторе RX Daytona (Randox Laboratories Ltd, Великобритания) с помощью специализированных ветеринарных наборов (АО «Диакон-ДС», Россия). Анализ образцов мочи проводили на ветеринарном экспресс-анализаторе мочи URIT-50 Vet (URIT Medical Electronic Co., Ltd., Китай) с помощью индикаторных полосок URIT 11 Vet. Анализ мочи включал оценку следующих параметров: объем мочи, цвет, прозрачность, удельная плотность, рН; количество лейкоцитов, эритроцитов и кетоновых тел; нитриты, уробилиноген, билирубин, общий белок, глюкоза и аскорбиновая кислота.

Половина животных (12 особей) из группы в равном соотношении полов была подвергнута эвтаназии на 29 сут эксперимента. Вторая половина животных была подвергнута эвтаназии на 43 сут, после дополнительного наблюдения в течение 2 нед. Для патоморфологического и патогистологического исследования отбирали образцы ткани головного мозга, тимуса, щитовидной железы с трахеей, легких с бронхами, сердца, печени, желудка, поджелудочной железы, кишечника, почек, надпочечников, селезенки, семенников, яичников и мочевого пузыря. Препараты, зафиксированные и окрашенные гематоксилином и эозином (ООО «Биовитрум», Россия), анализировали на ротационном микроскопе AxioLab (Zeiss, Германия).

Оценка местно-раздражающего действия ЛП была проведена в рамках патоморфологического и патогистологического исследования тканей в месте введения (слизистые оболочки носовой полости).

Нелинейные белые самцы крыс массой 160–190 г были использованы для изучения токсикокинетики ЛП. Препараты вводили с помощью ингалятора компрессорного типа LD-211С при помощи ингаляционного распылителя LD-N001 тип А ежедневно 1 раз/сут в течение 4 нед. Животных распределяли в 5 групп по 5 особей в каждой; препараты вводили животным аналогично схеме исследования субхронической токсичности. На 1 и 28 сут эксперимента у животных забирали кровь из латеральной хвостовой вены до введения препарата и через 30 мин, 2, 6 и 24 ч после введения препарата. Образцы крови центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин на центрифуге медицинской СМ-6 МТ (ELMI, Латвия). Образцы сыворотки крови замораживали при минус 20 °С до проведения анализа.

Определение концентрации ИФНα-2b проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора реагентов «Альфа ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», Россия). Наборы предварительно валидировали с использованием фармацевтической субстанции ИФНα-2b (ООО «Фирн М», Россия) согласно требованиям к валидации биоаналитических методик6. Оптическую плотность образцов измеряли с помощью иммуноферментного анализатора Infinite F-50 (Tecan Austria GmbH, Австрия) при длине волны 450 нм.

Данные, полученные в исследованиях эффективности и токсичности ЛП, анализировали с помощью статистических пакетов GraphPad Prism 9 (GraphPad Software Inc., США) и Statistica 8.0 (Statistica Inc., США). Статистический анализ данных проводили по группам животных одного пола. Нормальность распределения данных проверяли с помощью теста Шапиро — Уилка. Наличие выбросов в выборке оценивали по методу ROUT [13]. Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение». Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Сравнение выживаемости животных проводили с помощью критерия χ²-квадрат. Достоверность изменения массы тела устанавливали с помощью теста Вилкоксона. В исследовании токсичности статистический анализ показателей проводили при помощи дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки для нормально распределенных данных. Тест Краскела — Уоллиса использовали при анализе непараметрических данных в выборках. Статистическую обработку фармакокинетических данных проводили в программе OriginPro (OriginLab Corporation, США).

Эффективность ингаляционного применения ЛП на основе интерферона исследовали после заражения животных вирусом гриппа А/Калифорния/04/2009 (A(H1N1)pdm2009). В эксперименте были сформированы две группы вирусного контроля. Животным в первой группе вирусного контроля (Контроль в/ж) перорально вводили физиологический раствор. На 12 сут эксперимента погибли все животные. Средняя продолжительность жизни животных в группе Контроль в/ж после заражения составляла 7,1 сут, при этом на 12 сут животные теряли >25% массы тела (табл. 2; рис. S1, опубликован на сайте журнала7).

Животные во второй группе вирусного контроля (Контроль инг) получали ингаляции физиологического раствора до и через 8 ч после заражения, и далее по 2 ингаляции в сутки в течение 7 сут. В группе Контроль инг к концу эксперимента погибли все животные. Средняя продолжительность жизни мышей после заражения составила 6,8 сут. Максимальное снижение массы тела животных (23%) наблюдалось на 10 сут (день полной гибели животных).

В обеих группах вирусного контроля титр вируса в ткани легких животных на 4 сут после заражения превышал 6×log10ТЦИД50/0,1 мл (табл. 2), что и обусловливало гибель животных от вирусной пневмонии.

Введение ЛП животным в обеих изучаемых дозах приводило к достоверному снижению смертности (χ²-критерий) на 60% в группах ИФНα-2b 1 доза и ИФНα-2b ½ доза, 100% — в контрольных группах. Кроме того, наблюдалась тенденция к снижению потери массы тела животных по сравнению с группой вирусного контроля, в которой животные получали физиологический раствор перорально. Средняя продолжительность жизни животных из групп, получающих ИФНα-2b, была выше в 1,35–1,50 раза по сравнению с группами вирусного контроля. Полученные клинические показатели тяжести инфекции совпадали с вирусологическими данными. При введении животным ИФНα-2b в обеих дозах наблюдалось статистически значимое снижение титра вируса в легких более чем на 2×lоg10ТЦИД50/0,1 мл по сравнению с группами вирусного контроля. Введение животным препарата сравнения (осельтамивир) 2 раза/сут в дозе 10 мг/кг предотвращало смертность у 66% животных, уменьшало потерю массы тела, увеличивало среднюю продолжительность жизни в 1,7 раза и подавляло размножение вируса в легких животных примерно на 3,8×log10ТЦИД50/0,1 мл.

Ежедневный клинический осмотр не выявил каких-либо симптомов интоксикации у животных во всех экспериментальных группах. Смертельных исходов не наблюдали. Динамика массы тела (рис. 1), температуры тела и потребления корма животными была одинакова во всех группах. Введение ЛП не оказывало существенного влияния на показатели анализа мочи животных.

Значимых различий в поведенческой активности животных (тест «Открытое поле») не обнаружено. У некоторых животных в различных группах наблюдалась тенденция к снижению поведенческой активности относительно фоновых значений. Такая тенденция характерна для животных, повторно попадающих в арену открытого поля и связана с угасанием ориентировочного рефлекса.

Исследование сердечно-сосудистой системы. На 4 нед. ежедневного введения препаратов артериальное давление, частота дыхательных движений и параметры электрокардиограммы, кроме частоты сердечных сокращений, между группами не различались (рис. 2). У самок группы ИФНα-2b 0,22 частота сердечных сокращений была достоверно ниже по сравнению с группой ИФНα-2b 0,022 — 481±24 и 530±24 уд/мин соответственно (p<0,05). Однако группы животных, получавших ЛП, не отличались от группы Контроль или групп Плацебо; отсутствовали различия в группах самцов. Это может свидетельствовать об отсутствии связи наблюдаемого эффекта с введением ЛП. Таким образом, субхроническое введение ЛП не повлияло на результаты физиологического состояния крыс.

Гематологический и биохимический анализ крови. Выраженных различий показателей гематологического (рис. S2, опубликован на сайте журнала8) и биохимического (рис. S3, опубликован на сайте журнала9) анализа крови на 4 нед. введения ЛП не выявлено у животных в исследуемых группах. В ряде случаев, в основном у самок крыс, наблюдались умеренные, но статистически значимые различия показателей между группами, не зависящие от вводимых доз и не выходящие за пределы физиологической нормы, которые, по всей видимости, отражали индивидуальные особенности животных. Количество лейкоцитов и лимфоцитов в крови самок группы Плацебо 0,022 было достоверно (p<0,05) ниже, чем в группах Контроль, Плацебо 0,22 и ИФНα-2b 0,22. Самки в группе Контроль имели меньшее (p<0,05) количество тромбоцитов в крови по сравнению с самками из группы Плацебо 0,022 — (305±72)×10⁹ и (409±35)×10⁹/л соответственно. При этом количество тромбоцитов в крови крыс во всех остальных группах достоверно не отличалось между собой. Аналогичные различия наблюдались по тромбокриту, причем значение этого показателя в группе Контроль было заметно ниже, чем в остальных группах. Данные различия отсутствовали у самцов. Статистически значимые различия показателей у самок можно объяснить изначально более низким тромбокритом и количеством тромбоцитов в группе Контроль (рис. S2, опубликован на сайте журнала10). Кроме того, в образцах крови крыс в группе Плацебо 0,022 были обнаружены более низкие уровни глюкозы по сравнению с остальными группами; выявлены достоверные различия (p<0,05) показателей с группами Контроль и ИФНα-2b 0,022. Из данных биохимического анализа крови на 4 нед. следует, что уровень билирубина крови самцов в группе Контроль (6,85±1,20 мкмоль/л) достоверно различался с таковым (5,75±0,64 мкмоль/л) в группе Плацебо 0,22. Не обнаружено достоверных различий уровней билирубина крови самцов в группе Контроль и животных, получавших ЛП (рис. S3, опубликован на сайте журнала11).

Концентрация мочевины в крови самок крыс, получавших исследуемый ЛП, была выше, чем у животных, получавших плацебо. Разница концентрации мочевины в группах с введением ЛП животным в дозе 0,022 и 0,22 мл/крыса/сут была выше на 30 и 14% к уровню показателя в группах Плацебо соответственно. При этом концентрация мочевины в крови животных в группе ИФНα-2b 0,22 была на 12% ниже (p<0,05), чем в группе ИФНα-2b 0,022. Дозозависимость эффекта не наблюдалась. Достоверные различия между животными, которые получали ЛП, и животными в группе Контроль отсутствовали. В крови самок крыс, получавших плацебо, концентрация мочевины была снижена (p<0,05). Значения концентрации этого показателя в крови самцов крыс в разных группах не различались (рис. S3, опубликован на сайте журнала12). Таким образом, введение ЛП не приводило к значительным патологическим изменениям биохимических показателей крови животных.

Патоморфологическая картина внутренних органов животных в разных группах не различалась и соответствовала норме. В редких случаях наблюдались умеренные различия массовых коэффициентов органов (отношение массы органа к массе тела) между группами. Так, относительная масса сердца самок в группе ИФНα-2b 0,022 была ниже, чем в группе Плацебо 0,022, 0,037±0,003 и 0,044±0,001 г/кг соответственно. Различий между остальными группами, в том числе группой Контроль и группами животных, получавшими большую дозу ЛП, не установлено. Гистологическая картина сердечной мышцы животных во всех группах соответствовала норме: сосуды были умеренно полнокровны; миофибриллы сохраняли поперечную исчерченность; изменений ядер и кардиомиоцитов не выявлено; структура аорты соответствовала норме. Данные различия не повторялись в группах самцов крыс. Относительная масса головного мозга, тимуса, легких, печени, почек, надпочечников, селезенки, семенников и яичников не отличалась у животных в разных группах. Гистологическая картина данных органов, а также поджелудочной и щитовидной желез, кишечника и мочевого пузыря соответствовала норме, различия у животных в разных группах отсутствовали.

Несмотря на то что сосуды коры и мозгового вещества надпочечников были умеренно полнокровные, а клубочковая, сетчатая и пучковая зоны отчетливо выражены, во всех экспериментальных группах у 1 из 6 самцов крыс наблюдалась умеренная вакуольная дистрофия клеток коры надпочечников (рис. 3).

Для изучения местной переносимости были проведены патоморфологическое и патогистологическое исследования, которые не выявили местно-раздражающего действия ЛП. Слизистая оболочка гортани, трахеи и крупных бронхов была гладкая, блестящая, беловатого цвета. В просвете гортани и трахеи отсутствовало содержимое. Кольца трахеи и хрящи гортани были целостны, эластичны. Легкие были равномерно бледно-розового цвета, умеренно воздушные, эластичные, без уплотнений и новообразований. Эпителий трахеи нормальный, не измененный, ядра четкие. Слизистая оболочка, подслизистая основа и фиброзно-хрящевая оболочка были без изменений. Строение легких соответствовало норме. Кровенаполнение было умеренное, стенки сосудов без изменений. Воздушность легочной ткани была сохранена. В бронхах отсутствовали признаки склероза. На основании приведенных результатов можно сделать вывод о том, что исследуемый ЛП при многократном ингаляционном введении грызунам не обладает местно-раздражающим действием.

В исследовании токсикокинетики сравнивали аналитические сигналы ИФНα-2b в образцах сыворотки крови животных с минимальными значимыми сигналами градуировочных графиков в соответствующих аналитических циклах (планшеты для ИФА). Анализ полученных данных показал, что сигналы всех испытуемых образцов, взятых в разных временных точках (все группы животных), не являются статистически достоверными. С помощью выборочного контрольного анализа испытуемых образцов сыворотки крови подтверждена правильность результатов первичного контроля образцов. ИФНα-2b в образцах сыворотки крови не определяется методом ИФА, что делает невозможным построение фармакокинетических кривых и расчет фармакокинетических параметров. ИФА считается общепринятым рекомендуемым методом для надежного контроля ИФНα-2b в образцах крови и, как было подтверждено валидацией, характеризуется достаточной чувствительностью. На основе полученных данных можно заключить, что системное действие ЛП при ингаляционном введении животным в изученной дозе отсутствует.

В доступной литературе авторы не обнаружили сведений о доклинических исследованиях интерферон-содержащих ЛП для ингаляций. Однако с началом пандемии COVID-19 китайские исследователи активно применяли ингаляционное введение интерферона пациентам в инфекционных госпиталях. В работах Q. Zhou с соавт. [14] и R. Jiang с соавт. [15] были изложены результаты исследований безопасности, лечебной и профилактической эффективности разных доз интерферона при лечении легких и среднетяжелых форм COVID-19. В марте 2020 г. Национальной комиссией здравоохранения (National Health Commission) и Национальным управлением традиционной китайской медицины (National State Administration of Traditional Chinese Medicine) был введен в действие «Протокол диагностики и лечения коронавирусной пневмонии»13, в соответствии с которым в госпиталях может применяться ингаляционное введение ИФНα-2b для лечения пациентов с COVID-19.

Учитывая опыт авторов в создании препаратов на основе интерферонов в форме спреев и аэрозолей, был разработан ЛП для ингаляций и начат полный цикл доклинических и клинических исследований. Исходя из данных доклинических исследований Министерство здравоохранения Российской Федерации выдало разрешение № 456 от 23.08.2022 на проведение клинического исследования ЛП (фаза I) на здоровых добровольцах.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены таблица S1 и рисунки S1–S3.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s2

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s3

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Н.В. Панькова — концепция работы, написание текста рукописи, статистическая обработка, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; И.А. Ленёва, И.Н. Фалынскова, А.В. Иванина — проведение эксперимента по изучению эффективности препарата; Е.С. Коровкина — редактирование текста рукописи, построение графиков, статистическая обработка данных, участие в формулировании выводов; О.Э. Хуттунен, А.С. Кирьянова — проведение эксперимента по изучению токсичности; С.В. Шереметьев, Д.В. Лоншаков — проведение токсикокинетического исследования.

Соответствие принципам этики. Исследование было одобрено на заседании комиссии по биоэтике ООО «ФАРМАКОГЕН», протокол заседания № 5/20 от 13.04.2020.

Additional information. Table S1 and Figures S1–S3 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s2

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s3

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. N.V. Pankova conceptualised, drafted and performed the statistical analysis, and approved of the final version of the manuscript for publication. I.A. Leneva, I.N. Falynskova, A.V. Ivanina conducted the experiments to study effectiveness. E.S. Korovkina edited the manuscript, performed plotting and statistical analysis, and formulated the conclusions. O.E. Khuttunen, A.S. Kiryanova conducted the experiments to study toxicity. S.V. Sheremetyev, D.V. Lonshakov performed a toxicokinetic research.

Ethics approval. The Bioethics Committee at OOO PHARMACOGEN approved the study under meeting minutes No. 5/20 of 13 April 2020.

1. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. 2. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-table-s1 3. Organization for Economic Co-operation and Development, OECD. 4. Подходы к проведению хронических ингаляционных экспериментов с наноразмерными аэрозолями на мелких лабораторных животных. Методические рекомендации 1.2.0151–19. М.: Роспотребнадзор; 2019. 5. Madin–Darby canine kidney. 6. Решение Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 85 (ред. от 12.04.2024) «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза».Guideline on bioanalytical method validation. EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev. 1 Corr. 2. EMA; 2011. 7. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s1 8. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s2 9. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s3 10. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s2 11. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-25-4-448-460-fig-s3 12. Там же. 13. http://www.kankyokansen.org/uploads/uploads/files/jsipc/protocol_V7.pdf