В настоящее время известно большое количество заболеваний, патогенез которых обусловлен генетическими нарушениями. Достижения в области генетики и биотехнологии привели к созданию методов, которые позволяют получить практически любой ген, что в конечном счете привело к появлению нового класса лекарственных средств – генотерапевтических препаратов (ГТП). Цель работы – критический анализ международного опыта создания и регистрации генотерапевтических лекарственных препаратов. В обзоре освещены проблемы разработки ГТП, связанные с поиском оптимального подхода для доставки терапевтического гена в клетки-мишени. Обосновано, что перспективными средствами доставки генов являются вирусные векторы, среди которых наибольшей эффективностью и безопасностью обладают препараты на основе аденовируса (AV) и аденоассоциированного вируса (AAV). Рассмотрены современные подходы для генного редактирования, позволяющие модифицировать AV и AAV для повышения эффективности и безопасности ГТП. Данные модификации необходимы для включения в вирусный вектор терапевтического гена большого размера, снижения уровня экспрессии вирусных белков и снижения иммуногенности вирусного вектора. Представлен опыт регистрации ГТП в регуляторных органах США и Европейского союза, в том числе сведения о подкомитетах в структурах FDA и EMA, выполняющих рекомендательные функции. Отмечено, что в Российской Федерации зарегистрирован один ГТП отечественного производства и активно ведутся разработки других препаратов данной группы. Сделано заключение о необходимости формирования отечественной нормативной базы для разработки и регистрации ГТП, а также нормативных рекомендаций в рамках государств – членов Евразийского экономического союза.

Лекарственные препараты на основе рекомбинантных человеческих интерферонов (рчИФН) бета-1а и бета-1b применяют в качестве препаратов первой линии при лечении рассеянного склероза. При этом рчИФН бета-1а и бета-1b имеют структурные отличия, обусловленные использованием эукариотической или прокариотической системы экспрессии соответственно. Согласно международным фармакопейным требованиям необходима оценка подлинности первичной структуры рекомбинантного белка методом пептидного картирования, который предполагает использование стандартного образца сравнения. Международный стандартный образец рчИФН бета-1b для оценки подлинности отсутствует. Цель работы: разработка и аттестация фармакопейного стандартного образца для подтверждения подлинности аминокислотной последовательности очищенного рекомбинантного рчИФН бета-1b методом пептидного картирования. Материалы и методы: рчИФН бета-1b производства АО «ГЕНЕРИУМ»; эндопротеиназа Glu-C из Staphylococcus aureus V8. Исследование проводили методом пептидного картирования с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и метода масс-спектрометрии высокого разрешения. Результаты оценивали с применением статистических методов расчета среднего арифметического, стандартного отклонения, коэффициента вариации. Результаты: разработан и аттестован стандартный образец Государственной фармакопеи Российской Федерации для подтверждения подлинности рчИФН бета-1b (ФСО 3.2.00447). Аттестованная характеристика представлена в виде диапазонов времен удерживания характеристических пиков: абсолютное время удерживания третьего (референтного) пика составило 42,0–43,2 мин, относительное время удерживания первого пика — 0,61–0,66, второго пика — 0,68–0,73, четвертого пика — 1,04–1,06, пятого пика — 1,14–1,15, шестого пика — 1,22–1,24, седьмого пика — 1,29–1,30. Выводы: разработаны требования к ФСО рчИФН бета-1b, в качестве кандидата в стандартный образец выбран полупродукт рчИФН бета-1b, отобранный на стадии до добавления человеческого сывороточного альбумина; проведен контроль качества в соответствии с разработанной спецификацией и проанализирована аминокислотная последовательность молекулы с подтверждением наличия дисульфидной связи; получена аттестованная характеристика ФСО; сравнительный анализ пептидных карт разработанного и аттестованного ФСО рчИФН бета-1b и стандартного образца (СRS) рчИФН бета-1а показал различие данных пептидных карт и, следовательно, необходимость применения разработанного ФСО.

Разработка и применение новых методов контроля качества лекарственных средств предполагает использование большого количества референтного материала для контрольных исследований. Специалистами ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора предложен альтернативный методический подход для определения активности антирабического иммуноглобулина на культуре клеток, внедрение которого в практику диктует необходимость разработки стандартного образца предприятия, аттестованного относительно стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина человека Европейской фармакопеи.

Цель работы: разработка и оценка метрологических характеристик стандартного образца предприятия (СОП) специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на культуре клеток Vero. Материалы и методы: иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади; перевиваемая клеточная культура Vero; фиксированный вирус бешенства (штамм Москва 3253_Vero); стандартный образец активности антирабического иммуноглобулина человека Европейской фармакопеи. Специфическую активность кандидата в СОП и образцов антирабического иммуноглобулина определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток. Учет результатов осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа. Статистическую обработку проводили в соответствии с общей фармакопейной статьей 1.1.0014.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания. Результаты: в ходе испытаний установлена аттестуемая характеристика СОП по показателю «Специфическая активность», соответствующая значению 180,8±18,8 МЕ/мл. Граничные значения доверительного интервала определены при уровне вероятности 0,95. Установлен срок годности СОП – 1,5 года при хранении в соответствии с СанПиН 3.3686-21. По итогам аттестации образцу присвоен номер 41-01-20, разработан и утвержден комплект технической и эксплуатационной документации. Применение разработанного СОП позволяет проводить анализ специфической активности антирабического иммуноглобулина in vitro, выраженной в международных единицах, для подтверждения соответствия требованиям нормативной документации. Выводы: разработан стандартный образец предприятия специфической активности антирабического иммуноглобулина для применения в реакции нейтрализации вируса на клеточной культуре, аттестованный относительно стандартного образца активности антирабического иммуноглобулина человека Европейской фармакопеи.

Оценка содержания активатора прекалликреина является необходимой составляющей контроля специфической безопасности лекарственных препаратов иммуноглобулинов и альбумина человека. Вариабельность свойств биологических реагентов прекалликреина человека, хромогенного субстрата указывает на необходимость стандартизации хромогенного метода использованием компонентов стандартного образца (СО) не только для построения калибровочного графика, но и для подтверждения достоверности, стабильности и воспроизводимости полученных результатов в различных диапазонах значений в пределах регламентированных. Цель работы: совершенствование процедуры контроля качества препаратов из плазмы крови человека по содержанию активатора прекалликреина. Материалы и методы: содержание активатора прекалликреина определяли хромогенным методом по общей фармакопейной статье 1.8.2.0013.18 Государственной фармакопеи Российской Федерации с использованием реагентов прекалликреина различных производителей. СО разрабатывали на основе метода добавок с использованием раствора альбумина человека и реагента ß-фрагмента фактора Хагемана. По результатам определения содержания активатора прекалликреина в компоненте контроля строили контрольные карты Шухарта. Результаты: методом добавок разработан двухкомпонентный СО содержания активатора прекалликреина с регламентированным количеством ß-фрагмента фактора Хагемана; обоснована необходимость комплектации СО реагентом прекалликреина отечественного производства; отраслевой стандартный образец (ОСО) 42-28-445 аттестован с использованием всех доступных реагентов прекалликреина человека, ОСО 42-28-446 – с использованием реагента прекалликреина, входящего в состав набора. Аттестованное значение содержания активатора прекалликреина составило: в компоненте для оценки содержания активатора прекалликреина серии 1 обоих ОСО – 51 МЕ; в компоненте контроля ОСО 42-28-445 при восстановлении в 1,0 мл воды очищенной – 8,3–11,9 МЕ/мл, при восстановлении в 2,0 мл воды очищенной – 5,4–6,6 МЕ/мл; в компоненте контроля ОСО 42-28-446 – 9,1–11,1 и 5,6–6,4 МЕ/мл соответственно. Компонент для оценки содержания активатора прекалликреина предназначен для построения калибровочного графика, компонент контроля – для оценки достоверности результатов испытаний и построения контрольных карт. Анализ полученных карт для компонента контроля позволил оценить стабильность аналитической работы. Выводы: компоненты разработанных СО в сочетании с контрольными картами Шухарта позволяют не только определять содержание активатора прекалликреина, но и контролировать процесс анализа, оценивать его изменения, связанные со сменой серии реагентов. Компонент контроля позволяет оценивать стабильность аналитической работы и обеспечивает стандартность методики.

В настоящее время при лечении рассеянного склероза доказана эффективность препаратов интерферона бета. Одним из важнейших показателей качества, отражающих эффективность и безопасность лекарственных препаратов интерферона бета, является специфическая противовирусная активность. Для определения активности интерферона бета используют биологический метод, который может давать ошибку конечного результата за счет неопределенностей системы, вносящих свой вклад в общую погрешность. В связи с тем что точность оценки величины специфической активности позволяет гарантировать необходимую терапевтическую дозу препарата, особую актуальность приобретает стандартизация и валидация метода определения данного показателя. Цель работы: валидация методики определения специфической активности препаратов интерферона бета человеческого рекомбинантного на примере препарата Инфибета^® с использованием различных сочетаний клетка/вирус. Материалы и методы: в исследовании использовали клетки WISH, Vero, A-549, MDBK в комбинации с вирусом энцефаломиокардита мышей. Испытания проводили биологическим методом, основанным на способности интерферона подавлять цитопатическое действие вируса в культуре клеток. Учет результатов осуществляли с использованием методов математической статистики и пакета программ GraphPadPrism, Statisticа 2/0. Результаты: представлены данные сравнительного анализа результатов определения специфической активности препарата Инфибета^® (интерферон бета-1b) с использованием различных сочетаний клетка/вирус. Сравнение результатов проводили по характеристикам графика зависимости «доза–эффект». Показано, что все испытанные клеточные линии пригодны для постановки методики определения активности интерферона бета биологическим методом. Однако наилучшие результаты получены с использованием клеток A-549, WISH в сочетании с вирусом энцефаломиокардита мышей. На указанных системах клетка/вирус провели определение валидационных характеристик: специфичность, линейность, прецизионность, робастность. Выводы: валидирована методика, позволяющая измерять специфическую активность интерферона бета в диапазоне 4,8–11,2 МЕ/мл с удовлетворительной точностью, что гарантирует получение достоверных результатов анализа. Показана устойчивость методики и ее внутри- и межлабораторная воспроизводимость.

Мукополисахаридоз VI типа (синдром Марото–Лами) — орфанное генетическое заболевание, которое связано с дефицитом лизосомального фермента арилсульфатазы В. Актуальность исследования связана с необходимостью разработки высокопродуктивной клеточной линии-продуцента рекомбинантного фермента арилсульфатазы В. Наиболее перспективным подходом представляется создание клеточных линий-продуцентов, коэкспрессирующих целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. При этом большое практическое значение имеет возможность культивирования клеточных линий-продуцентов в виде суспензии, без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Цель работы: разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного фермента арилсульфатазы В за счет коэкспрессии вспомогательного формилглицин-генерирующего фермента. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Трансфекцию клеток СНО проводили методом электропорации с использованием системы MaxCyte STX. Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы Cell Metric. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Образцы культуральной жидкости анализировали с применением электрофореза в полиакриламидном геле и вестерн-блота. Уровень мРНК измеряли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Результаты: получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент. Достигнуто увеличение выхода активного целевого фермента арилсульфатазы В с 2 до 100 мг/л за счет подбора оптимального соотношения плазмид во время трансфекции. Наибольший выход целевого фермента арилсульфатазы В наблюдался при соотношении плазмид, кодирующих гены арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента, равном 90:10 (%). Выводы: разработаны высокопродуктивные клеточные линии-продуценты рекомбинантного фермента арилсульфатазы В, коэкспрессирующие целевой и вспомогательный ферменты. Коэкспрессия арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента приводит к улучшению ростовых и продукционных характеристик клеточной линии, что, по-видимому, обусловлено модификацией активного центра целевого фермента арилсульфатазы В. Полученные результаты позволят решить проблему низкого выхода фермента, характерную для препаратов подобного класса.

Счетно-фотометрический метод определения невидимых механических включений, описанный в Государственной фармакопее Российской Федерации, предусматривает формирование из образцов лекарственных препаратов пробы объемом не менее 25 мл, необходимой для проведения четырех измерений, каждое объемом 5 мл. Для препаратов, выпускаемых, например, в готовых к использованию преднаполненных шприцах объемом 0,2–0,3 мл, метод требует объединения большого количества первичных упаковок, что экономически затратно. Для дорогостоящих препаратов актуальным является использование малых объемов аналитических проб при проведении испытаний счетно-фотометрическим методом. Применяющиеся на практике счетчики частиц позволяют проводить анализ лекарственных препаратов в объемах от 0,1 мл, но это требует оценки точности методики. Цель работы: оценить точность определения невидимых механических включений счетно-фотометрическим методом с использованием малых объемов аналитических проб. Материалы и методы: в работе использовали счетчик частиц HIAC 9703+; стандартные образцы счетной концентрации, содержащие 0,998×10⁶ частиц/мл и 3800 частиц/мл; суспензии стандартных латексных частиц с заданным размером (20 мкм). Результаты: оценена точность методики определения количества невидимых частиц счетно-фотометрическим методом при использовании малых аналитических проб объемом от 0,1 мл до 5,0 мл: правильность составила 96–100%; повторяемость – 0,8–1,8%; коэффициенты корреляции линейной зависимости расчетного количества частиц от теоретического значения – более 0,999. Проведение измерений с аналитической пробой объемом 0,1 мл нецелесообразно из-за недостаточной точности результатов. Относительное стандартное отклонение результатов измерений количества невидимых частиц, получаемых при использовании аналитических проб объемом от 0,2 до 5,0 мл, не превышает относительной погрешности результатов измерений счетчика частиц. При проведении испытания с использованием малых аналитических проб (0,2–1,0 мл) рекомендуется использовать шприц-пробоотборник объемом 1 мл. Показана необходимость предварительной установки объема преаналитической пробы (не менее 0,1 мл). Сравнительные испытания биологических лекарственных препаратов белковой природы (7 наименований) при использовании стандартной (5,0 мл) и малой (0,5 мл) аналитических проб продемонстрировали сопоставимые результаты. Выводы: анализ результатов проведенных исследований свидетельствует о возможности использования счетно-фотометрического метода с малыми объемами аналитических проб.