Preview

БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение

Расширенный поиск

Увеличение продуктивности клеточной линии-продуцента арилсульфатазы B за счет коэкспрессии формилглицин-генерирующего фермента

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-1-80-93

Полный текст:

Аннотация

Мукополисахаридоз VI типа (синдром Марото–Лами) — орфанное генетическое заболевание, которое связано с дефицитом лизосомального фермента арилсульфатазы В. Актуальность исследования связана с необходимостью разработки высокопродуктивной клеточной линии-продуцента рекомбинантного фермента арилсульфатазы В. Наиболее перспективным подходом представляется создание клеточных линий-продуцентов, коэкспрессирующих целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. При этом большое практическое значение имеет возможность культивирования клеточных линий-продуцентов в виде суспензии, без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Цель работы: разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного фермента арилсульфатазы В за счет коэкспрессии вспомогательного формилглицин-генерирующего фермента. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Трансфекцию клеток СНО проводили методом электропорации с использованием системы MaxCyte STX. Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы Cell Metric. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Образцы культуральной жидкости анализировали с применением электрофореза в полиакриламидном геле и вестерн-блота. Уровень мРНК измеряли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Результаты: получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент. Достигнуто увеличение выхода активного целевого фермента арилсульфатазы В с 2 до 100 мг/л за счет подбора оптимального соотношения плазмид во время трансфекции. Наибольший выход целевого фермента арилсульфатазы В наблюдался при соотношении плазмид, кодирующих гены арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента, равном 90:10 (%). Выводы: разработаны высокопродуктивные клеточные линии-продуценты рекомбинантного фермента арилсульфатазы В, коэкспрессирующие целевой и вспомогательный ферменты. Коэкспрессия арилсульфатазы В и формилглицин-генерирующего фермента приводит к улучшению ростовых и продукционных характеристик клеточной линии, что, по-видимому, обусловлено модификацией активного центра целевого фермента арилсульфатазы В. Полученные результаты позволят решить проблему низкого выхода фермента, характерную для препаратов подобного класса.

Об авторах

С. С. Тимонова
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Тимонова Софья Сергеевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



К. А. Смолова
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Смолова Ксения Александровна, кандидат химических наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



Д. Т. Зарипова
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Зарипова Долия Тагировна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



М. С. Пантюшенко
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Пантюшенко Марина Семеновна, кандидат биологических наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



М. А. Королева
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Королева Мария Александровна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



Р. Л. Анисимов
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Анисимов Роман Львович, кандидат биологических наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



Р. А. Хамитов
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Хамитов Равиль Авгатович, доктор медицинских наук, профессор

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



А. А. Пискунов
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Пискунов Александр Александрович, кандидат биологических наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



В. Н. Бадэ
АО «ГЕНЕРИУМ»
Россия

Бадэ Вероника Николаевна, кандидат биологических наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская область, 601125



Список литературы

1. Mikami T, Kitagawa H. Biosynthesis and degradation of glycans of the extracellular matrix: sulfated glycosaminoglycans, hyaluronan, and matriglycan. In: Barchi JJ, ed. Comprehensive Glycoscience. 2nd ed. Elsevier B.V.; 2021. P. 29–62. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819475-1.00018-3

2. Matalon R, Matalon KM, Radhakrishnan GL. Chapter 35. The mucopolysaccharidoses. In: Rosenberg RN, Pascual JM, eds. Rosenberg’s Molecular and Genetic Basis of Neurological and Psychiatric Disease. 5th ed. Elsevier Inc.; 2015. P. 347–63. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-410529-4.00031-0

3. Pastores GM. Lysosomal Storage Disorders: Principles and Practice. World Scientific; 2009. https://doi.org/10.1142/7250

4. Mehta A, Winchester B, eds. Lysosomal Storage Disorders: A Practical Guide. John Wiley & Sons, Ltd.; 2012. https://doi.org/10.1002/9781118514672

5. Remondino RG, Tello CA, Noel M, Wilson AF, Galaretto E, Bersusky E, Piantoni L. Clinical manifestations and surgical management of spinal lesions in patients with mucopolysaccharidosis: a report of 52 cases. Spine Deform. 2019;7(2):298–303. https://doi.org/10.1016/j.jspd.2018.07.005

6. Vollebregt AAM, Hoogeveen-Westerveld M, Kroos MA, Oussoren E, Plug I, Ruijter GJ, at al. Genotype–phenotype relationship in mucopolysaccharidosis II: predictive power of IDS variants for the neuronopathic phenotype. Dev Med Child Neurol. 2017;59(10):1063–70. https://doi.org/10.1111/dmcn.13467

7. Burrow TA, Leslie ND. Review of the use of idursulfase in the treatment of mucopolysaccharidosis II. Biologics. 2008;2(2):311–20.

8. Harmatza P, Hendriksz CJ, Lampe C, McGill JJ, Parini R, Leão-Teles E, et al. The effect of galsulfase enzyme replacement therapy on the growth of patients with mucopolysaccharidosis VI (Maroteaux-Lamy syndrome). Mol Genet Metab. 2017;122(1-2):107–12. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2017.03.008

9. Harmatz P, Giugliani R, D Schwartz IV, Guffon N, Teles EL, Miranda MCS, et al. MPS VI Study Group. Longterm follow-up of endurance and safety outcomes during enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis VI: Final results of three clinical studies of recombinant human N-acetylgalactosamine 4-sulfatase. Mol Genet Metab. 2008;94(4):469–75. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2008.04.001

10. Wiegmann EМ, Westendorf E, Kalus I, Pringle TH, Lübke T, Dierks T. Arylsulfatase K, a novel lysosomal sulfatase. J Biol Chem. 2013;288(42):30019–28. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.499541

11. Ghosh D. Three-dimensional structures of sulfatases. Methods Enzymol. 2005;400:273–93. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(05)00016-9

12. Ruijter J, de Ru MH, Wagemans T, Ijlst L, Lund AM, Orchard PJ, at al. Heparan sulfate and dermatan sulfate derived disaccharides are sensitive markers for newborn screening for mucopolysaccharidoses types I, II and III. Mol Genet Metab. 2012;107(4):705–10.https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2012.09.024

13. Reed MJ, Purohit A, Woo LWL, Newman SP, Potter BVL. Steroid sulfatase: molecular biology, regulation, and inhibition. Endocr Rev. 2005;26(2):171–202. https://doi.org/10.1210/er.2004-0003

14. Peng J, Alam S, Radhakrishnan K, Mariappan M, Rudolph MG, May C, et al. Eukaryotic formylglycine-generating enzyme catalyses a monooxygenase type of reaction. FEBS J. 2015;282(17):3262–74. https://doi.org/10.1111/febs.13347

15. Appel MJ, Bertozzi CR. Formylglycine, a post-translationally generated residue with unique catalytic capabilities and biotechnology applications. ACS Chem Biol. 2015;10(1):72–84. https://doi.org/10.1021/cb500897w

16. Dierks T, Miech C, Hummerjohann J, Schmidt B, Kertesz MA, von Figura K. Posttranslational formation of formylglycine in prokaryotic sulfatases by modification of either cysteine or serine. J Biol Chem. 1998;273(40):25560–4. https://doi.org/10.1074/jbc.273.40.25560

17. Dierksa T, Schlotawa L, Frese M-A, Radhakrishnan K, von Figura K, Schmidt B. Molecular basis of multiple sulfatase deficiency, mucolipidosis II/III and Niemann–Pick C1 disease — lysosomal storage disorders caused by defects of non-lysosomal proteins. Biochim Biophys Acta. 2009;1793(4):710–25. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2008.11.015

18. Diez-Roux G, Ballabio A. Sulfatases and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005;6:355–79. https://doi.org/10.1146/annurev.genom.6.080604.162334

19. Demydchuk M, Hill CH, Zhou A, Bunkóczi G, Stein PE, Marchesanet D, at al. Insights into Hunter syndrome from the structure of iduronate-2-sulfatase. Nat Commun. 2017;8:15786. https://doi.org/10.1038/ncomms15786

20. Ulmer JE, Vilén EM, Namburi RB, Benjdia A, Beneteau J, Malleron A, et al. Characterization of glycosaminoglycan (GAG) sulfatases from the human gut symbiont Bacteroides thetaiotaomicron reveals the first GAG-specific bacterial endosulfatase. J Biol Chem. 2014;289(35):24289–303. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.573303

21. Dierks T., Dickmanns A., Preusser-Kunze A., Schmidt B., Mariappan M., Figura K, et al. Molecular basis for multiple sulfatase deficiency and mechanism for formylglycine generation of the human formylglycine-generating enzyme. Cell. 2005;121(4):541–52. https://doi.org/10.1016/j.cell.2005.03.001

22. Dickmanns A, Schmidt B, Rudolph MG, Mariappan M, Dierks T, Figura K, Ficner R. Crystal structure of human pFGE, the paralog of the Calpha-formylglycine-generating enzyme. J Biol Chem. 2005;280(15):15180–7. https://doi.org/10.1074/jbc.M414317200

23. Mariappan M, Preusser-Kunze A, Balleininger M, Eiselt N, Schmidt B, Gande SL, et al. Expression, localization, structural, and functional characterization of pFGE, the paralog of the Cα-formylglycine-generating enzyme. J Biol Chem. 2005;280(15):15173–9.https://doi.org/10.1074/jbc.M413698200

24. Sardiello M, Annunziata I, Roma G, Ballabio A. Sulfatases and sulfatase modifying factors: an exclusive and promiscuous relationship. Hum Mol Genet. 2005;14(21):3203–17. https://doi.org/10.1093/hmg/ddi351

25. Peng J, Alam S, Radhakrishnan K, Mariappan M, Rudolph MG, May C, et al. Eukaryotic formylglycine-generating enzyme catalyses a monooxygenase type of reaction. FEBS J. 2015;282(17):3262–74. https://doi.org/10.1111/febs.13347

26. Тимонова СС, Павелко ВИ, Кирик ИА, Бадэ ВН, Малыгина ТО, Хамитов РА, Пискунов АА. Принцип оперативного выбора лидерных клонов-продуцентов моноклональных антител при создании стабильных клеточных линий на основе СНО. Биотехнология. 2019;35(4):65–72. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-4-65-72

27. Muralidharan-Chari V, Wurz Z, Doyle F, Henry M, Diendorfer A, Tenenbaum SA, et al. PTSelect™: a post-transcriptional technology that enables rapid establishment of stable CHO cell lines and surveillance of clonal variation. J Biotechnol. 2021;325:360– 71. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.09.025

28. Steger K, Brady J, Wang W, Duskin M, Donato K, Peshwa M. CHO-S antibody titers >1 gram/liter using flow electroporation-mediated transient gene expression followed by rapid migration to high-yield stable cell lines. J Biomol Screen. 2015;20(4):545–51. https://doi.org/10.1177/1087057114563494

29. Brown AJ, Gibson S, Hatton D, James DC. Transcriptome-based identification of the optimal reference CHO genes for normalisation of qPCR data. Biotechnol J. 2018;13(1). https://doi.org/10.1002/biot.201700259

30. Chopra A, Willmore WG, Biggar KK. Protein quantification and visualization via ultraviolet-dependent labeling with 2,2,2-trichloroethanol. Sci Rep. 2019;9(1):13923. https://doi.org/10.1038/s41598-019-50385-9


Рецензия

Для цитирования:


Тимонова С.С., Смолова К.А., Зарипова Д.Т., Пантюшенко М.С., Королева М.А., Анисимов Р.Л., Хамитов Р.А., Пискунов А.А., Бадэ В.Н. Увеличение продуктивности клеточной линии-продуцента арилсульфатазы B за счет коэкспрессии формилглицин-генерирующего фермента. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(1):80-93. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-1-80-93

For citation:


Timonova S.S., Smolova K.A., Zaripova D.T., Pantyushenko M.S., Koroleva M.A., Anisimov R.L., Khamitov R.A., Piskunov A.A., Bade V.N. Increasing productivity of arylsulfatase B-producing cell line by coexpression of formylglycine-generating enzyme. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2022;22(1):80-93. (In Russ.) https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-1-80-93

Просмотров: 249


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2221-996X (Print)
ISSN 2619-1156 (Online)