ОБЗОРЫ
Подготовка научных принципов разработки неоригинальных биотерапевтических (биоподобных, биоаналоговых) препаратов была начата в Европе в начале 2000-х гг., в 2009 г. они были утверждены на международной конференции ВОЗ в Сеуле с участием стран с развитой фарминдустрией. В США закон о биоподобных препаратах принят в 2012 г., за основу были взяты документы и рекомендации, подготовленные ЕМА и одобренные ВОЗ. В 2015 г. FDA опубликовало очередную редакцию основных документов, касающихся биоподобных препаратов. В основе нормативных требований США по разработке и регистрации биоподобных препаратов лежит пошаговая сравнительная оценка биоподобного и оригинального препаратов по атрибутам качества, эффективности и безопасности в соответствии с рекомендациями ВОЗ/ЕМА. При этом по таким вопросам, как дизайн сравнительных исследований качества (физико-химических и биологических свойств), присвоение Международного непатентованного наименования и взаимозаменяемость биоподобных препаратов, нормативные требования США отличаются от национальных рекомендаций других стран, в том числе ЕМА (ВОЗ).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
На каждый разработанный биомедицинский клеточный продукт (БМКП), прошедший доклинические исследования, производитель (разработчик) составляет спецификацию, которая входит в состав регистрационного досье при подаче заявления на государственную регистрацию БМКП. В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 января 2017 г. № 14н «Об утверждении формы спецификации на биомедицинский клеточный продукт» спецификация должна содержать сведения об идентичности (подлинности) клеточной линии, входящей в состав БМКП, которая включает: морфологические характеристики, экспрессию специфических маркеров, экспрессию специфических генов, экспрессию специфических белков, а также маркеры стабильности клеточной линии. В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствует практический опыт проведения экспертизы качества БМКП. Цель работы: обоснование методических подходов к определению идентичности (подлинности) клеточных линий, входящих в состав БМКП, в рамках экспертизы качества на модельной клеточной линии DF-2 при использовании методов, позволяющих характеризовать морфологический, генетический, иммунофенотипический и цитогенетический профиль клеточной линии. Материалы и методы: объектом исследования была клеточная линия DF-2 — дермальные фибробласты человека (мезенхимные стволовые клетки) — получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). В работе использовали следующие методы анализа: морфологический анализ; метод проточной цитометрии для иммунофенотипирования модельной клеточной линии DF-2; метод коротких тандемных повторов для построения аллельного профиля модельной клеточной линии; цитогенетическое исследование — DAPI-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом. Результаты: в статье представлены методические подходы к определению подлинности препаратов, содержащих жизнеспособные клетки человека (аналогов БМКП), используемые в мировой практике, а также представлены результаты экспериментального определения показателя «Идентичность (подлинность)» на модельной клеточной линии. Выводы: методы оценки подлинности БМКП должны гарантировать однозначную идентификацию клеточной линии в соответствии с представленной спецификацией. В результате проведенных исследований отработана процедура экспертной оценки идентичности (подлинности) модельной клеточной линии.
Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (международное непатентованное название — алтеплаза), разработанный и зарегистрированный компанией АО «ГЕНЕРИУМ» (Россия), является полным аналогом лекарственного препарата Актилизе®, используемого для лечения заболеваний, сопровождающихся тромбообразованием, таких как инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии и ишемический инсульт. Цель работы: провести комплексное исследование сопоставимости физико-химических и биологических характеристик лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе® для оценки их биоподобия. Материалы и методы: сравнительное пептидное картирование с определением сопоставимости хроматографических профилей триптических гидролизатов проводилось методами ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии, определение молекулярно-массового распределения — методами масс-спектрометрии и электрофореза в полиакриламидном геле по Леммли. Для определения чистоты и гомогенности препаратов, а также содержания родственных примесей (олигомеров, фрагментов) использовали метод гель-фильтрации; исследование профиля N-гликозилирования осуществляли методом гидрофильной ВЭЖХ, определение тотального содержания сиаловых кислот — методом Свеннерхольма. Оценку связывания белка с фибрином и фибриногеном человека проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, сравнение специфической активности — методом лизиса фибринового сгустка. Результаты: в ходе исследований было продемонстрировано полное совпадение пептидных карт анализируемых препаратов, что свидетельствует об идентичности аминокислотной последовательности алтеплазы в составе сравниваемых препаратов. Также сравнительно были определены молекулярная масса и содержание интактной одноцепочечной формы белка в лекарственных препаратах, количественно охарактеризованы посттрансляционные модификации, содержание сиаловых кислот и нейтральных сахаров. При изучении профиля N-гликозилирования обнаружены незначительные различия в процентном содержании мультиантенных комплексных гликанов. Специфичность алтеплазы оценивали при образовании белковых комплексов с природными лигандами алтеплазы — фибрином и ингибитором активатора плазминогена первого типа, при этом достоверных различий обнаружено не было. При сравнении специфической активации фибринолитической активности плазминогена в тесте на скорость лизиса фибринового сгустка была продемонстрирована сопоставимость препаратов Ревелиза® и Актилизе®. Выводы: проведенные сравнительные экспериментальные исследования показали отсутствие различий в структуре, гетерогенности распределения зарядов, содержании примесей, а также специфической активности алтеплазы в составе лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе®, что позволяет сделать вывод о сопоставимости препаратов по физико-химическим и биологическим свойствам.
На сегодняшний день в технологии вакцины чумной живой используется комбинированный способ концентрирования микробных клеток, состоящий из трех операций суммарной продолжительностью 18 ч. К недостаткам получения концентрата в рамках существующей технологии вакцины относятся ее многооперационность, энергозатратость, продолжительность и, как следствие, малый выход концентрированной суспензии (0,04 л с 1 л нативной культуры). Цель работы состояла в оптимизации процесса концентрирования микробных клеток Yersinia pestis ЕV с применением установки тангенциальной микрофильтрации с фильтродержателем АСФ-020. Материалы и методы: в исследованиях использовали вакцинный штамм Yersinia pestis ЕV линии НИИЭГ (Научно-исследовательский институт эпидемиологии и гигиены). Для глубинного выращивания нативной культуры применяли реактор БИОР-0,25. Содержание живых микробных клеток определяли циторефрактометрическим методом. Оценку параметров окислительного метаболизма осуществляли с использованием хроноамперометрического метода. Физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины чумной живой сухой определяли в соответствии с ФС.3.3.1.0022.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания. Результаты: конструктивные особенности внедряемого оборудования позволили осуществлять мембранную фильтрацию микробной суспензии, используя в качестве емкости промежуточного хранения реактор БИОР-0,25, тем самым исключив три технологические операции. Общая концентрация микробов в суспензии, полученной регламентным и оптимизированным способами, составляла не менее 120 млрд м.кл./мл. Сравнительное изучение влияния различных гидродинамических режимов в рабочих полостях фильтрующих установок АСФ-009 и АСФ-020 существенно не повлияло на морфометрические и физиологические свойства микробных культур. На основании экспериментальных данных составлен материальный баланс процесса мембранной фильтрации. Выход концентрата с 1 л нативной культуры по оптимизированной технологии достигал 0,17 л, продолжительность процесса сократилась до 4 ч. Выводы: оптимизирован процесс концентрирования микробных клеток Y. pestis ЕV в технологическом процессе производства чумных вакцин. Сравнительное изучение морфометрических и физиологических свойств культур чумного микроба в процессе их концентрирования по оптимизированной технологии не выявило существенных отличий по сравнению с регламентной.
Согласно существующей в мире практике референс-материалы для оценки специфической активности препаратов очищенного туберкулина изготавливают из расчета использования в течение нескольких десятилетий, что предполагает их высокую стабильность. Так, туберкулин PPD-S, изготовленный в США в 1944 г., используется для международного стандарта очищенного туберкулина до настоящего времени в виде лиофилизатов в ампулах (PPDT), содержащих 5000 IU каждая. Материал для отечественного стандартного образца очищенного туберкулина ОСО ППД-Л-2 получен в 1973 г. в Ленинградском НИИВС. Многолетнее применение этой субстанции для контроля производственных серий очищенного туберкулина ППД-Л обусловлено высокой стабильностью показателя специфической активности ОСО ППД-Л-2, что должно периодически подтверждаться в широкомасштабном исследовании на различных экспериментальных моделях в соответствии с требованиями Всемирной организации здравоохранения. Цель работы: оценить долгосрочную стабильность субстанции отраслевого стандартного образца очищенного туберкулина (ОСО ППД-Л-2) путем подтверждения его специфической активности относительно международного стандарта очищенного туберкулина и определить возможность использования этой субстанции для приготовления лиофилизованных образцов референс-препарата. Материалы и методы: специфическую активность ОСО ППД-Л-2 определяли относительно международного стандарта PPDT в соответствии с методикой, указанной в ФС.3.3.1.0023.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания, используя морских свинок, вакцинированных различными субштаммами БЦЖ, или сенсибилизированных вирулентными микобактериями («живыми» или «инактивированными») в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO TRS 45, 1987). Результаты: анализ полученных данных позволил заключить, что величина показателя относительной активности ОСО ППД-Л-2 варьировала в 3–4 раза в зависимости от использованного для вакцинации морских свинок субштамма БЦЖ (модели сенсибилизации животных). Такое влияние модели титрования проявлялось при сравнении специфической активности туберкулинов, полученных различными методами осаждения туберкулопротеина (ППД-Л-2 и PPDT), т.е. отличающихся по составу антигенов. На животных, сенсибилизированных микобактериями туберкулеза, специфическая активность установленной ранее дозы ОСО ППД-Л-2 эквивалентна международному стандарту. Выводы: Полученные в данном исследовании результаты оценки специфической активности ОСО ППД-Л-2 соответствуют данным, полученным при разработке и аттестации этого референс-материала в 1980-х годах, и подтверждают долгосрочную стабильность порошка-полуфабриката отечественного стандартного образца очищенного туберкулина. В то же время получение лиофилизированной формы ОСО, помимо экономической целесообразности, исключило бы определенное количество возможных ошибок, которые неизбежны при выполнении ежегодной процедуры приготовления и контроля разведений субстанции, и позволило бы сохранить ее количество, что увеличивает перспективы дальнейшего многолетнего использования ППД-Л-2 в качестве отраслевого стандартного образца.
ХРОНИКА
ISSN 2619-1156 (Online)