Физико-химические и биологические свойства биоподобного и референтного препаратов тканевого активатора плазминогена

Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (международное непатентованное название — алтеплаза), разработанный и зарегистрированный компанией АО «ГЕНЕРИУМ» (Россия), является полным аналогом лекарственного препарата Актилизе®, используемого для лечения заболеваний, сопровождающихся тромбообразованием, таких как инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии и ишемический инсульт. Цель работы: провести комплексное исследование сопоставимости физико-химических и биологических характеристик лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе® для оценки их биоподобия. Материалы и методы: сравнительное пептидное картирование с определением сопоставимости хроматографических профилей триптических гидролизатов проводилось методами ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрии, определение молекулярно-массового распределения — методами масс-спектрометрии и электрофореза в полиакриламидном геле по Леммли. Для определения чистоты и гомогенности препаратов, а также содержания родственных примесей (олигомеров, фрагментов) использовали метод гель-фильтрации; исследование профиля N-гликозилирования осуществляли методом гидрофильной ВЭЖХ, определение тотального содержания сиаловых кислот — методом Свеннерхольма. Оценку связывания белка с фибрином и фибриногеном человека проводили методом поверхностного плазмонного резонанса, сравнение специфической активности — методом лизиса фибринового сгустка. Результаты: в ходе исследований было продемонстрировано полное совпадение пептидных карт анализируемых препаратов, что свидетельствует об идентичности аминокислотной последовательности алтеплазы в составе сравниваемых препаратов. Также сравнительно были определены молекулярная масса и содержание интактной одноцепочечной формы белка в лекарственных препаратах, количественно охарактеризованы посттрансляционные модификации, содержание сиаловых кислот и нейтральных сахаров. При изучении профиля N-гликозилирования обнаружены незначительные различия в процентном содержании мультиантенных комплексных гликанов. Специфичность алтеплазы оценивали при образовании белковых комплексов с природными лигандами алтеплазы — фибрином и ингибитором активатора плазминогена первого типа, при этом достоверных различий обнаружено не было. При сравнении специфической активации фибринолитической активности плазминогена в тесте на скорость лизиса фибринового сгустка была продемонстрирована сопоставимость препаратов Ревелиза® и Актилизе®. Выводы: проведенные сравнительные экспериментальные исследования показали отсутствие различий в структуре, гетерогенности распределения зарядов, содержании примесей, а также специфической активности алтеплазы в составе лекарственного препарата Ревелиза® и референтного препарата Актилизе®, что позволяет сделать вывод о сопоставимости препаратов по физико-химическим и биологическим свойствам.

1. Guzzetta AW, Basa LJ, Hancock WS, Keyt BA, Bennett WF. Identification of carbohydrate structures in glycoprotein peptide maps by the use of LC/MS with selected ion extraction with special reference to tissue plasminogen activator and a glycosylation variant produced by site directed mutagenesis. Anal Chem. 1993;65(21):2953–62.

2. Spellman MW, Basa LJ, Leonard CK, Chakel JA, O’ConnorJV, Wilson S, van Halbeek H. Carbohydrate structures of human tissue plasminogen activator expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 1989;264(24):14100–11.

3. Harris RJ, Leonard CK, Guzzetta AW, Spellman MW. Tissue plasminogen activator has an O-linked fucose attached to threonine-61 in the epidermal growth factor domain. Biochemistry. 1991;30(9):2311–4.

4. Parekh RB, Dwek RA, Thomas JR, Opdenakker G, Rademacher TW, Wittwer AJ, et al. Cell-type-specific and site-specific N-glycosylation of type I and type II human tissue plasminogen activator. Biochemistry. 1989;28(19):7644–62.

5. Wittwer AJ, Howard SC, Carr LS, Harakas NK, Feder J, Parekh RB, et al. Effects of N-glycosylation on in vitro activity of Bowes melanoma and human colon fibroblast derived tissue plasminogen activator. Biochemistry. 1989;28(19):7662–9.

6. Berg DT, Burck PJ, Berg DH, Grinnell BW. Kringle glycosylation in a modified human tissue plasminogen activator improves functional properties. Blood. 1993;81(5):1312–22.

7. Cole ES, Nichols EH, Poisson L, Harnois ML, Livingston DJ. In vivo clearance of tissue plasminogen activator: The complex role of sites of glycosylation and level of sialylation. Fibrinilysis. 1993;7(1):15–22. https://doi.org/10.1016/0268-9499(93)90050-6

8. Chloupek RC, Harris RJ, Leonard CK, Keck RG, Keyt BA, Spellman MW, et al. Study of the primary structure of recombinant tissue plasminogen activator by reversedphase high-performance liquid chromatographic tryptic mapping. J Chromatogr. 1989;463(2):375–96.

9. Kim PY, Tieu LD, Stafford AR, Fredenburgh JC, Weitz JI. A high affinity interaction of plasminogen with fibrin is not essential for efficient activation by tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem. 2012;287(7):4652–61. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.317719

10. Björquist P, Brohlin M, Ehnebom J, Ericsson M, Kristansen C, Pohl G, Deinum J. Plasminogen activator inhibitor type-1 interacts exclusively with the proteinase domain of tissue plasminogen activator. Biochim Biophys Acta. 1994;1209(2):191–202.