ВВЕДЕНИЕ. Основным мероприятием в первичной профилактике заболеваний, вызываемых вирусом папилломы человека (ВПЧ), является вакцинация. Разработка новых вакцин-кандидатов ведется во всем мире, в том числе и в Российской Федерации. В то же время серьезной проблемой на пути к внедрению новых ВПЧ-вакцин в практику здравоохранения является отсутствие четких и однозначных рекомендаций по проведению их доклинических исследований (ДКИ).

ЦЕЛЬ. Анализ нормативных документов, изучение опыта проведения ДКИ ВПЧ-вакцин и обобщение подходов к ДКИ, которые могут быть рекомендованы разработчикам и заявителям при регистрации новых вакцин для профилактики папилломавирусной инфекции, в том числе разрабатываемых в Российской Федерации.

ОБСУЖДЕНИЕ. Изучены как нормативные правовые документы ВОЗ, ICH, ЕЭК, так и результаты экспериментальной части в рамках проведения ДКИ ВПЧ-вакцин. Зарегистрированные и разрабатываемые ВПЧ-вакцины схожи по своим характеристикам и конструктивным особенностям, но могут различаться по спектру перекрываемых серотипов и методам получения капсидного белка L1 ВПЧ. В настоящее время подтверждена роль белка L1 в формировании специфического протективного иммунитета, поэтому отсутствует необходимость проведения тестов заражения с использованием животных моделей. Моделирование папилломатоза может потребоваться при выборе альтернативных иммунологических мишеней или при изучении иного пути введения вакцины, отличного от парентерального. В программу ДКИ могут быть включены отдельные этапы по проведению комплексной оценки новых адъювантов и иных дополнительных компонентов в составе новых ВПЧ-вакцин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. На основании изучения международного опыта систематизированы методы и подходы к проведению ДКИ ВПЧ-вакцин. Сформулированы рекомендации для разработчиков ВПЧ-вакцин по планированию и организации ДКИ, включая изучение иммуногенности, токсикологических свойств, местной переносимости, необходимых для государственной регистрации новых препаратов.

ВВЕДЕНИЕ. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) является одним из самых распространенных типичных возбудителей ОРВИ и инфекций нижних дыхательных путей у детей и взрослых. Уже долгое время применяются препараты моноклональных антител для проведения профилактической пассивной иммунизации недоношенных детей с бронхолегочной дисплазией, однако недавно были лицензированы вакцины для профилактической вакцинации лиц старшего возраста с наличием различных факторов риска тяжелого течения РСВ-инфекции, в первую очередь таких, как хронические заболевания сердечно-сосудистой системы, дыхательной системы и сахарный диабет.

ЦЕЛЬ. Обзор состояния разработки вакцин для активной иммунизации против РСВ-инфекции, включающий эпидемиологическое обоснование разработки, результаты клинических исследований зарегистрированных вакцин, рекомендации по вакцинации населения и обзор перспективных разработок вакцин для профилактики РСВ-инфекции.

ОБСУЖДЕНИЕ. Создать вакцину для профилактики РСВ-инфекции долгое время не удавалось в первую очередь из-за особенностей иммунопатогенеза РСВ-инфекции и генетической гипервариабельности РСВ. Зарубежным исследователям удалось идентифицировать консервативную мишень для нейтрализующих антител, способную индуцировать специфический иммунитет. Такой мишенью является стабилизированный префьюжн (pre-F) капсидный белок РСВ, который при изменении конформационного состояния до F-белка отвечает за проникновение вируса в клетку. На основе рекомбинантных pre-F-белков были созданы субъединичные вакцины, успешно прошедшие ряд клинических исследований (КИ) и одобренные для иммунизации лиц старшего возраста. Также одна из вакцин рекомендована для применения во время беременности с целью профилактики РСВ-инфекции у новорожденных и младенцев. В настоящее время реализуются программы разработки новых РСВ-вакцин на основе мРНК и нереплицирующихся аттенуированных гриппозных векторов. В результате проведенного исследования были изучены и суммированы показатели эффективности и безопасности двух РСВ-вакцин, одобренных к применению в различных странах мира. Оба препарата обладают удовлетворительным профилем безопасности и сопоставимыми показателями профилактической эффективности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Предрегистрационные КИ новых РСВ-вакцин, в том числе разрабатываемых в Российской Федерации, должны включать оценку профилактической эффективности в целевых группах пациентов. При регистрации в Российской Федерации вакцин, уже получивших одобрение ведущих зарубежных регуляторных органов, потребуется проведение ограниченных связующих исследований для подтверждения иммуногенности и безопасности препаратов.

ВВЕДЕНИЕ. Генотипирование вируса Чикунгунья (ЧИКВ) проводится с помощью секвенирования участков генов белков Е1, Е2, nsP1 или всего генома вируса. Имеющиеся наборы реагентов или протокол проведения ПЦР не позволяют генотипировать ЧИКВ, а для секвенирования нуклеиновых кислот требуются дорогостоящее оборудование и материалы, что не всегда доступно. В связи с этим перспективным представляется применение более простого и экономичного метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), который не использовался ранее для определения генотипов ЧИКВ.

ЦЕЛЬ. Изучение возможности применения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации и генотипирования вируса Чикунгунья.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В экспериментальном исследовании использовали РНК штаммов ЧИКВ четырех генотипов: Азиатский (Asian), Западно-Африканский (WAf), Восточно-Центральный Южно-Африканский (ECSA) и Восточно-Центральный Южно-Африканский — линия Индийского океана (ECSA-IOL). Проводили полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с последующей рестрикцией и анализом длин рестрикционных фрагментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Установлено, что фрагмент гена nsP2 длиной 648 п.н. между позициями 3806 и 4453 содержит сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции PspEI, PvuII и DraI, наличие или отсутствие которых составляют различные комбинации и специфичны для каждого из четырех генотипов ЧИВК. Сконструированы праймеры, позволяющие амплифицировать выбранный участок гена, проведены ОТ-ПЦР и анализ ПДРФ.

ВЫВОДЫ. Для быстрого подтверждения подлинности вируса Чикунгунья и его генотипирования может быть успешно использован метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, который позволяет провести анализ в течение нескольких часов и в отсутствие высокотехнологичного оборудования.

ВВЕДЕНИЕ. При разработке и производстве инактивированных вакцин важными критериями безопасности и качества препарата являются полнота инактивации вируса и подлинность вакцинного штамма. Для осуществления контроля качества инактивированных вакцин наиболее перспективным представляется использование молекулярно-биологических методов, отличающихся быстротой получения результата, а также высокими показателями чувствительности и специфичности.

ЦЕЛЬ. Разработка методов количественной полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (кПЦР-РВ) и интегрированной с культуральным методом кПЦР-РВ (ИКМ-кПЦР-РВ) для оценки полноты инактивации вируса Чикунгунья (ЧИКВ), а также метода обратной транскрипции — ПЦР с последующей оценкой полиморфиз ма длин рестрикционных фрагментов (ОТ-ПЦР-ПДРФ) для подтверждения подлинности штамма.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В исследовании использовали РНК штаммов ЧИКВ (по 3 штамма каждого из четырех генотипов (Asian, ECSA, ECSA-IOL, WAF), которые были предваритель но определены секвенированием), штамм ЧИКВ Nika21 (генотип ECSA), инактивированный β-пропиолактоном штамм Nika21, сорбированный на гидроокиси алюминия антиген Nika21. Применяли методы кПЦР-РВ, ИКМ-кПЦР-РВ, ОТ-ПЦР-ПДРФ, реакцию нейтрализации.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Определен фрагмент гена белка nsP1 длиной 218 п.о. между позициями 789 и 1006, который содержит сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, наличие или отсутствие которых составляют различные комбинации и специфичны для каждого из 4 генотипов ЧИКВ. Подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать выбран ный участок гена, отработаны условия проведения ОТ-ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-ПДРФ. Продемонстрирована возможность использования метода ИКМ-кПЦР-РВ для подтверждения полноты инактивации вируса. Показана возможность применения метода ОТ-ПЦР-ПДРФ для установления подлинности вакцинного штамма.

ВЫВОДЫ. Продемонстрированы преимущества применения метода ИКМ-кПЦР-РВ для оценки полноты инактивации антигена вакцинного штамма и метода ОТ-ПЦР-ПДРФ для подтверждения подлинности вакцинного штамма вируса. Данные методы являются более чувствительными и быстрыми относительно традиционных культуральных методов и могут быть использованы на всех этапах технологического процесса производства инактивированных вакцин.

ВВЕДЕНИЕ. Вирусы Марбург и Эбола вызывают тяжелую геморрагическую лихорадку у людей и приматов. В настоящее время не зарегистрированы вакцины для одновременной профилактики вызываемых этими филовирусами заболеваний, способные предотвратить распространение заболевания или снизить его тяжесть. Исследования, направленные на выбор наиболее иммуногенной формы протективного антигена, являются необходимым этапом при разработке эффективных профилактических вакцин.

ЦЕЛЬ. Оценка индукции гуморального иммунного ответа на введение животным рекомбинантных аденовирусных векторов, экспрессирующих различные формы гликопротеина вирусов Эбола и Марбург.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Рекомбинантные аденовирусы человека 5 серотипа получали методом гомологичной рекомбинации в клетках Escherichia coli. Культивирование аденовирусов проводили в культуре клеток HEK293 с последующей очисткой методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности цезия хлорида. Полученные препараты аденовирусов были охарактеризованы на подлинность методом ПЦР и полногеномным секвенированием; по количеству вирусных частиц (спектрофлуориметрия) и инфекционных вирусных частиц (метод ТЦД₅₀). Оценку титра гликопротеин-специфических IgG антител в сыворотке крови иммунизированных животных (мыши) проводили методом иммуноферментного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Получены рекомбинантные аденовирусы человека 5 серотипа, содержащие в своем геноме кассету с одной из форм гена гликопротеина, кодирующего полноразмерный гликопротеин (GP), GP с удаленным муциноподобным доменом, GP с удаленными гликановым кэпом и муциноподобным доменом. Каждую из форм изучали на примере GP четырех представителей филовирусов: вируса Эбола видов Заир, Судан, Бундибугио и вируса Марбург. Показано, что форма GP не оказывает критического влияния на репликативную способность рекомбинантного аденовируса. Установлено, что через 3 нед. после иммунизации наибольший уровень продукции антиген-специфичных антител вызывают аденовирусы, кодирующие полноразмерный GP и GP с удаленным муциноподобным доменом. Вне зависимости от вида филовируса антиген, представленный GP с удаленными гликановым кэпом и муциноподобным доменом, оказался наименее иммуногенным.

ВЫВОДЫ. Наиболее перспективными для разработки филовирусных вакцин на основе рекомбинантных аденовирусных векторов являются конструкции, включающие ген полноразмерного GP и GP с удаленным муциноподобным доменом.

ВВЕДЕНИЕ. Несмотря на существующие подходы к терапии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), полное излечение остается труднодостижимым из-за высокой изменчивости ВИЧ типа 1 (ВИЧ-1), что требует пожизненного приема антиретровирусных препаратов, обладающих серьезными побочными эффектами. Разработка генотерапевтических препаратов с использованием векторов на основе аденоассоциированных вирусов (adeno-associated virus, AAV), кодирующих нейтрализующие антитела широкого спектра действия (широко нейтрализующие антитела), является перспективным направлением для создания долгосрочной терапии в отношении большого количества вариантов вируса.

ЦЕЛЬ. Оценка защитной эффективности препарата КомбиМаб-2, представляющего собой комбинацию трех AAV-векторов (AAV9-VRC07-523, AAV9-10-1074 и AAV9-PGDM1400), кодирующих широко нейтрализующие антитела против ВИЧ-1, на модели гуманизированных мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В исследовании использована животная модель ВИЧ-инфекции на основе иммунодефицитных мышей линии B-NDG, гуманизированных человеческими CD4⁺ Т-лимфоцитами в количестве 1,5×10⁷ клеток на мышь, полученными из лейкоконцентрата здорового донора. В эксперименте использовали две группы мышей. Контрольной группе животных (3 особи) вводили физиологический раствор, опытной группе (5 особей) — Комбимаб-2. Препарат в виде трех отдельных компонентов вводили в разные мышцы за 6 нед. до инфицирования животных вирусом. CCR5-тропный ВИЧ-1 получали путем трансфекции клеток HEK293FT плазмидой рNL4-3(AD8), кодирующей полноразмерный вирус. В течение 4 нед. после заражения проводили мониторинг вирусной нагрузки в плазме крови методом ПЦР с обратной транскрипцией и числа CD4⁺ Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии в периферической крови животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Установлено, что через 6 нед. после введения исследуемого препарата гуманизированным мышам уровень широко нейтрализующих антител в сыворотке крови животных варьировал от 0,17 до 4,0 мкг/мл. После заражения ВИЧ-1 в контрольной группе мышей уровень вирусной нагрузки составил 10⁵ копий/мл через 1 нед., далее наблюдалось увеличение показателя в течение последующих 3 нед. В группе животных, получавших препарат, инфекция развилась только у одной мыши, имевшей самый низкий титр антител. У остальных мышей вирусная нагрузка не детектировалась, что указывает на эффективность препарата при условии достижения концентрации широко нейтрализующих антител в сыворотке крови от 0,5 мкг/мл и выше.

ВЫВОДЫ. Препарат на основе трех AAV-векторов (AAV9-VRC07-523, AAV9-10-1074 и AAV9-PGDM1400) обладает защитной эффективностью в отношении ВИЧ-1 в исследовании на гуманизированных мышах. Представленные данные позволяют рассматривать препарат как перспективное противовирусное средство, что может послужить основой для дальнейшей фармацевтической разработки.

ВВЕДЕНИЕ. Увеличение распространенности штаммов возбудителей заболеваний с множественной лекарственной устойчивостью определяет необходимость применения принципиально новых средств борьбы с бактериями, в том числе лекарственных препаратов бактериофагов. Стабильному внедрению фаготерапии мешает отсутствие общепринятых стандартизированных нормативных правовых и методических документов, регламентирующих проведение доклинических и клинических исследований, а также производство препаратов бактериофагов.

ЦЕЛЬ. Анализ международного опыта в области организации производства и обращения лекарственных препаратов бактериофагов, а также основных нормативных требований к контролю их качества, эффективности и безопасности.

ОБСУЖДЕНИЕ. Разработка препаратов вирулентных бактериофагов в соответствии с существующими требованиями к лекарственным средствам труднореализуема в связи с биологическими характеристиками бактериофагов, большим разнообразием их штаммов, возможными быстрыми изменениями, происходящими как в популяции бактериофагов, так и в популяции возбудителей. В связи с этим целесообразна разработка облегченных подходов к регистрации препаратов фаготерапии и упрощенных методов оценки их эффективности и безопасности. При этом необходима оценка специфических для этой группы препаратов нежелательных явлений, таких как риск развития лизогении и резистентности к бактериофагам, а также возможности переноса генов устойчивости к антибиотикам между штаммами бактерий. Во многих странах мира, в том числе в США, при фармацевтической разработке препаратов бактериофагов используется несколько подходов: концепция «качество через разработку» (Quality by Design); подход, основанный на формировании «мастер-файла на биологическую активную фармацевтическую субстанцию» (Biological Master File), согласно которому подается на одобрение регулирующих органов отдельный пакет документов, охватывающий только часть досье; программа «расширенного доступа» (Expanded Access), открывающая отдельному пациенту возможность применять инновационные препараты без утвержденных протоколов лечения. В России промышленное производство лекарственных препаратов бактериофагов осуществляется в соответствии со стандартами качества, указанными в Государственной фармакопее Российской Федерации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Подходы к фаготерапии и ее регулированию, принятые в мире и на территории Российской Федерации, в значительной степени отличаются. Представляется целесообразным дополнить существующие национальные рекомендации в сфере анализа эффективности и безопасности лекарственных препаратов бактериофагов, в частности регламентировать обязательность проведения доклинических исследований.

ВВЕДЕНИЕ. Для оценки стабильности биологических лекарственных препаратов (БЛП) требуются особые подходы и нормативные требования. В связи с этим необходима разработка актуальных национальных рекомендаций для препаратов данной группы, что является важным условием их безопасного и эффективного использования.

ЦЕЛЬ. Анализ национальных и международных требований к оценке стабильности биологических лекарственных препаратов для последующего обоснования единого регуляторного подхода к определению и подтверждению срока годности препаратов.

ОБСУЖДЕНИЕ. Большинство биотехнологических лекарственных препаратов (БТЛП), учитывая их белковую природу, характеризуются высокой чувствительностью к действию факторов внешней среды, в связи с чем срок годности БТЛП устанавливается на осно ве результатов исследования стабильности, полученных в условиях реального времени. Оценка стабильности в ускоренных и стрессовых условиях используется для обоснования срока годности, а также для характеристики механизма деградации структуры белка, что позволяет выбрать наиболее чувствительные показатели и методы анализа при проведении исследований стабильности. Национальными и международными регуляторными органами разработаны специализированные руководства по исследованию стабильности БЛП различного происхождения. В регуляторной системе Евразийского экономического союза (ЕАЭС) разработаны подходы к оценке стабильности, гармонизированные с международными стандартами. Особенности изучения стабильности вакцин подразумевают, помимо установления срока годности, также определение стабильности восстановленных для применения препаратов и термостабильности при кратковременных нарушениях температурного режима «холодовой цепи».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Испытания стабильности различных групп БЛП (включая биотехнологические и иммунобиологические) имеют свои особенности, что диктует необходимость разработки и совершенствования системы требований к оценке стабильности. Это позво лит оптимизировать процессы обращения БЛП в Российской Федерации и на территории государств — членов ЕАЭС.

ВВЕДЕНИЕ. Для проведения экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» актуальным представляется внедрение альтернативных методов анализа, позволяющих специфически идентифицировать споровый сибиреязвенный антиген с помощью соответствующих диагностических препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации, предназначенных для выявления спор Bacillus anthracis.

ЦЕЛЬ. Оценка возможности применения иммунофлуоресцентного метода и сравнительный анализ результатов его применения с иммунохроматографическим методом при испытании вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали коммерческие серии вакцины сибиреязвенной живой. Применяли коммерческие диагностические препараты российского производства: иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие, набор реагентов: иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-система B. anthracis). Для приготовления мазков и проведения реакции в ИХ тестсистеме готовили рабочие разведения микробных взвесей исходя из общей концентрации спор вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 с помощью фармакопейного стандартного образца мутности бактериальных взвесей 10 МЕ. Регистрировали качественные реакции образования иммунокомплексов.

РЕЗУЛЬТАТЫ. При испытании вакцины сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом при окраске мазков диагностическими иммуноглобулинами в разведениях 1:32 и 1:64 наблюдалась яркая зеленовато-желтая флуоресценция оболочки микробной клетки — оценка интенсивности флуоресценции на 4+ и 3+. При исследовании вакцины сибиреязвенной живой иммунохроматографическим методом выявлен споровый антиген в концентрациях вакцины 10⁸ и 10⁹ спор/мл — зарегистрированы две отчетливые полосы темно-розового цвета, что свидетельствует о формировании иммунопреципитата. Результаты, полученные указанными методами, подтверждают принадлежность исследуемой микробной культуры к виду B. anthracis.

ВЫВОДЫ. Применение иммунохроматографического и иммунофлуоресцентного методов анализа с помощью соответствующих диагностических препаратов, является удобным и надежным подходом для видоспецифического выявления спор B. anthracis СТИ-1 в вакцине сибиреязвенной живой. Полученные результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой по показателю качества «Подлинность» могут быть основанием для рекомендации вышеуказанных методов как альтернативных в качестве дополнения к методу бактериоскопии спор по Цилю — Нильсену, который в настоящее время применяется в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации.