К вакцинам предъявляются особые нормативные требования для оценки их качества, эффективности и безопасности. Учитывая, что Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) является основной международной организацией, координирующей проведение мероприятий по борьбе с вспышками инфекционных заболеваний, начиная с 2005 г. ВОЗ начала разработку документов, касающихся вопросов оценки качества, безопасности и эффективности вакцин. Ведущими мировыми регуляторными органами (FDA, ЕМА и др.) подготовлены рекомендации для проведения доклинических исследований вакцин.

Цель работы — критический анализ нормативных требований для доклинической оценки эффективности и безопасности вакцин, подготовленных зарубежными национальными и международными регуляторными органами.

Проведенный анализ показал, что начиная с 2000-х гг. ВОЗ и ведущими регуляторными органами мира было подготовлено более 40 нормативных документов, в которых описаны те или иные стороны проведения доклинических исследований эффективности и безопасности вакцин. Документы можно разделить на две группы: документы, посвященные общим вопросам доклинических исследований вакцин, и документы, касающиеся оценки качества, эффективности и безопасности определенных видов вакцин. В Российской Федерации последняя редакция рекомендаций для доклинической оценки качества, безопасности и эффективности иммунобиологических лекарственных препаратов была опубликована в 2013 г. и не содержит информации относительно препаратов последнего поколения. В настоящее время проводится работа по подготовке нормативно-правовой базы, касающейся лекарственных средств, в том числе вакцин, на территории государств — членов Евразийского экономического союза (ЕАЭС). Представленный в статье анализ нормативных документов по доклиническим исследованиям эффективности и безопасности вакцин может быть полезен для подготовки гармонизированных рекомендаций по соответствующим группам вакцин в рамках ЕАЭС, а также разработчикам, фармпроизводителям и ученым-исследователям, занимающимся созданием и доклиническими исследованиями вакцин.

В 1980 г. Всемирная ассамблея здравоохранения официально провозгласила искоренение натуральной оспы в мире, что позволило в развитых странах отменить профилактическую вакцинацию против этого заболевания. Однако из-за постоянно циркулирующих и вновь возникающих ортопоксвирусов, а также отсутствия популяционного иммунитета необходимо наличие в чрезвычайных ситуациях противооспенных вакцин, отвечающих современным требованиям к иммунобиологическим препаратам.

Цель работы — анализ безопасности и эффективности в условиях отсутствия популяционного иммунитета к ортопоксвирусам оспенной вакцины третьего поколения на основе штамма MVA вируса вакцины, отвечающей повышенным требованиям иммуногенности и безопасности, особенно с учетом применения ее для лиц с отклонениями в состоянии здоровья. Проанализирован опыт применения противооспенных вакцин. Среди противооспенных вакцин третьего поколения особое место занимает вакцина на основе вируса вакцины, штамм MVA (modified vaccinia virus Ankara), выпускаемая компанией Bavarian Nordic под тремя названиями (в Европе — Imvanex, в США — Jynneos™, в Канаде — IMVAMUNE®), поскольку он безопасен и может использоваться для конструирования векторных вакцин. Результаты клинических исследований вакцины на основе штамма MVA на здоровых добровольцах и лицах с различными отклонениями в здоровье показали, что основные побочные реакции легкой степени тяжести (эритема, болезненность, зуд, припухлость) в основном регистрировали в месте введения вакцины. Из системных побочных реакций отмечены утомление, головная боль, миалгия, озноб; у незначительной части — инфекция верхних дыхательных путей, тошнота, гастроэнтерит, которые самопроизвольно проходили в течение первых суток. Вакцина не вызывает нарушений сердечной деятельности, включая миоперикардит, может быть применена для лиц с экземой, атопическим дерматитом и воспалительными кожными заболеваниями, ею можно вакцинировать ВИЧ-инфицированных, больных туберкулезом, лиц с нарушениями сердечной деятельности, а также детей младшего возраста, подростков и беременных женщин. Определена оптимальная иммунизирующая доза вакцины при внутрикожном введении, равная 1×10⁸ ЦПД₅₀. Выявлено, что при двукратном введении в данной дозе вакцина индуцирует выраженный гуморальный и клеточный иммунный ответ, сопоставимый по уровню с иммунитетом после однократного введения вакцины первого поколения, а также бустирует иммунитет, ранее сформировавшийся при иммунизации противооспенной вакциной первого поколения. Вакцина Jynneos™ в настоящее время одобрена CDC (США) для профилактики оспы обезьян у взрослых в возрасте 18 лет и старше.

Лихорадка Чикунгунья представляет собой острое инфекционное заболевание, которое вызывается вирусом Чикунгунья (ЧИКВ) и распространяется комарами. В последние десятилетия эта инфекция зарегистрирована в более чем 100 странах и превратилась в глобальную проблему для здравоохранения. В связи с тем что антигенные различия между генотипами ЧИКВ незначительны и повторные случаи инфицирования практически не регистрируют, вакцина могла бы не только предотвратить заболевание и возможную потерю трудоспособности, но и уменьшить эпидемическое распространение ЧИКВ среди населения.

Цель работы — анализ направлений разработки вакцинных препаратов для профилактики лихорадки Чикунгунья, оценка перспективных препаратов, вышедших на этапы доклинических (ДКИ) и клинических исследований (КИ), а также анализ перспектив и проблем вывода препаратов на фармацевтический рынок.

Анализ научной литературы показал, что при разработке вакцин, продолжающейся уже несколько десятилетий, используются как традиционные, так и новейшие технологические платформы. Каждая технологическая платформа имеет свои недостатки и преимущества. На данном этапе около 25 разработок достаточно успешно прошли этап ДКИ и более 7 находятся на разных стадиях КИ. Самыми популярными являются платформа живых аттенуированных вакцин, а также платформа вакцин с использованием векторных конструкций. Препараты, находящиеся в разных фазах КИ, представлены живыми аттенуированными вакцинами (четыре препарата), инактивированным (один препарат), содержащим вирусоподобные частицы (один препарат) и созданным на основе мРНК (один препарат). Для всех семи вакцин была продемонстрирована перекрестная защита от штаммов ЧИКВ разных генотипов или на стадии ДКИ in vivo и/или на стадии КИ in vitro. Исследования продолжаются, что подтверждает наличие не только научного интереса, но также ожиданий системы здравоохранения к выводу на фармацевтический рынок эффективных вакцин против лихорадки Чикунгунья.

В настоящее время в Российской Федерации пристальное внимание уделяется вопросам, связанным с вакцинопрофилактикой инфекции, вызываемой SARS-CoV-2. Повышение доверия населения к проведению вакцинации новыми препаратами в большой степени связано с гарантией отсутствия побочного действия, вызванного контаминацией. Высокий риск загрязнения биологических препаратов, в числе которых вакцины для профилактики коронавирусной инфекции, обусловленный природой используемого сырья и свойствами препаратов, служит дополнительным фактором необходимости применения эффективных подходов к выявлению контаминирующих агентов.

Цель работы — оценить возможность усовершенствования процедуры проведения испытания на стерильность вакцин для профилактики коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2.

В статье представлены результаты анализа методик, предложенных разработчиками для проведения испытания по показателю «Стерильность» десяти зарегистрированных в нашей стране отечественных препаратов вакцин для профилактики COVID-19. Изучены специфические особенности препаратов, включая физико-химические свойства, наличие антимикробных компонентов и другие критически значимые факторы, влияющие на правильность постановки испытания. Показана возможность усовершенствования процедуры исследования препаратов по показателю «Стерильность». В качестве основных направлений авторами рассматривается предложение разработки альтернативной методики на основе второго фармакопейного метода (ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность, Государственная фармакопея Российской Федерации XIV изд.), а также применение универсальной питательной среды. Использование данных рекомендаций для усовершенствования утвержденных и разработки новых методик позволит повысить надежность и расширит возможности проведения испытания как в процессе производства, так и при экспертизе с целью регистрации обновленных вариантов вакцин для профилактики коронавирусной инфекции и последующего их ввода в гражданский оборот. Предложенные подходы могут быть применены для оценки качества по показателю «Стерильность» и других лекарственных средств.

Важным параметром, оцениваемым при мониторинге иммунной прослойки у населения и эффективности вакцинации населения, является уровень вируснейтрализующих антител. Разработка подхода к выявлению вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 с помощью безопасного, простого и быстрого метода, не требующего использования живых вирусов, имеет большое значение для борьбы с пандемией COVID-19. Для разработки тест-систем для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), детектирующих потенциально вируснейтрализующие антитела, необходимо получение высокоочищенного рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка, обладающего высокой авидностью к специфическим антителам.

Цель работы: получение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка вируса SARS-CoV-2, а также клеточной линии, продуцирующей рекомбинантный RBD, для создания ИФА тест-системы для выявления потенциально вируснейтрализующих антител.

Материалы и методы: дизайн генетической конструкции проводили in silico. Стабильную клеточную линию получали при помощи трансфекции клеток CHO-S, селекции на антибиотике и отбора оптимального клона. Рекомбинантный RBD очищали с использованием хроматографических методов, получали мономерную и гомодимерную формы RBD. Активность полученных форм анализировали с использованием методов Вестерн-блот, биослойной интерферометрии и непрямго ИФА. Для анализа использовали моноклональные антитела GamXRH19, GamP2C5 и h6g3, а также образцы сывороток крови добровольцев, вакцинированных препаратом Гам-КОВИД-Вак, и невакцинированных добровольцев.

Результаты: получена клеточная линия CHO-S, стабильно продуцирующая рекомбинантный RBD S-белка вируса SARS-CoV-2. Показано, что при культивировании данной клеточной линии в режиме fed-batch более 7 суток рекомбинантный RBD способен образовывать гомодимеры за счет наличия неспаренных цистеинов. Количественный выход очищенного рекомбинантного RBD из культуральной жидкости составил 30–50 мг/л. Мономерная и гомодимерная формы RBD были разделены при помощи гель-фильтрации и охарактеризованы по способности взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами, а также сыворотками крови от вакцинированных добровольцев. Продемонстрировано, что именно гомодимерная форма рекомбинантного RBD обладает повышенной авидностью к моноклональным антителам и антителам в сыворотке крови вакцинированных.

Выводы: гомодимерная форма рекомбинантного RBD может являться более предпочтительной для анализа уровня антител к рецептор-связывающему домену S-белка вируса SARS-CoV-2.

Лихорадка Западного Нила — зоонозная природно-очаговая арбовирусная инфекция с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя. Заболевание протекает в виде острого лихорадочного интоксикационного синдрома, в тяжелых случаях — с развитием нейроинфекции. Выделяют несколько генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила, ВЗН (West Nile virus, WNV), циркулирующих на территории Российской Федерации и имеющих разную патогенность для человека. В связи с этим разработка и внедрение в клиническую лабораторную практику диагностического набора реагентов для дифференциации генотипов ВЗН является актуальной задачей.

Цель работы: проведение технических и клинических испытаний для оценки качества, эффективности и безопасности диагностического набора реагентов «Амплиген-WNV-генотип-1/2/4» для выявления РНК и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Материалы и методы: определение диагностической чувствительности и специфичности набора реагентов «Амплиген-WNV-генотип-1/2/4» (ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора) проводили методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием 216 образцов клинического и 204 образцов биологического материала. В качестве метода сравнения применяли секвенирование по Сенгеру. Статистическую обработку результатов клинических испытаний проводили в соответствии с ГОСТ Р 53022.3-2008.

Результаты: в ходе испытаний установлено, что аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР-РВ c набором реагентов «Амплиген-WNV-генотип-1/2/4» составила 1×10⁴ ГЭ/мл при выявлении кДНК ВЗН генотипов 1, 2, 4. При оценке специфичности набора положительных результатов с кДНК гетерологичных вирусов в пробах с концентрацией 1×10⁶ ГЭ/мл не выявлено. Диагностическая чувствительность набора реагентов составила не менее 98,5%, диагностическая специфичность — не менее 99%, при доверительной вероятности 90% при анализе каждого из показателей.

Выводы: набор реагентов «Амплиген-WNV-генотип-1/2/4» может быть рекомендован для применения в клинической лабораторной диагностике для обнаружения РНК и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила.

Расширение номенклатуры клеточных культур для вирусологии и биотехнологии повышает вероятность успешного реагирования на угрозы, связанные со вспышками известных и новых инфекционных заболеваний человека. Поиск восприимчивых к широкому спектру вирусов клеточных культур является актуальной задачей.

Цель работы: изучить чувствительность новых диплоидных клеточных культур животного происхождения (фибробласты почки и гортани плода свиньи) к вирусам Coxsackievirus B5 (CVB5) и Herpes simplex virus-1 (HSV-1).

Материалы и методы: клеточные культуры фибробластов почки и гортани плода здоровой свиноматки получены методом щадящей трипсинизации. Чувствительность новых клеточных культур фибробластов почки и гортани плода свиньи (ФППС и ФГПС) к указанным вирусам определяли по степени цитопатического действия (ЦПД), выраженной в процентном соотношении. Изучение инфекционной активности вируса CVB5 проводили методом ПЦР в режиме реального времени с оценкой относительной величины порогового цикла амплификации (C_t); HSV-1 — количественным титрованием вируссодержащей жидкости (ВСЖ), значение показателя выражали в 50% тканевой цитопатической дозе (ТЦД₅₀).

Результаты: получены диплоидные клеточные культуры ФППС и ФГПС. Выявлены высокая чувствительность клеток ФППС к вирусу CVB5 с ЦПД 87,5±3,3% на 3 пассаже и удовлетворительная концентрация энтеровирусной РНК в ВСЖ, характеризующаяся значением порогового цикла на уровне 22–24 C_t. Чувствительность клеточной культуры ФППС к HSV-1 соответствовала 92,1±5,5% ЦПД, инфекционная активность — 10^4,25 ТЦД₅₀/0,2 мл. У клеток ФГПС к изучаемым вирусам определены низкие показатели ЦПД и инфекционной активности.

Выводы: новая диплоидная клеточная культура ФППС с подтвержденной чувствительностью к тестируемым вирусам (CVB5 штамма CB5-8100 и HSV-1 штамма HSV-1/L-2) с высоким уровнем ЦПД имеет перспективы использования в вирусологии и биотехнологии. Клеточная культура ФГПС может быть кандидатом для тестирования других представителей CVB5 и HSV-1.

Рост случаев заболевания лихорадкой Чикунгунья регистрируется в странах Карибского бассейна, Центральной и Южной Америки и Юго-Восточной Азии. Специфического лечения против этого заболевания нет, лечение проводится симптоматическое, что делает разработку вакцин против лихорадки Чикунгунья весьма актуальной. Для разработки инактивированной цельновирионной вакцины против лихорадки Чикунгунья важен выбор чувствительной культуры клеток, которая обеспечивает высокую продукцию вируса, а также используется в производстве вакцинных препаратов.

Цель работы: изучение чувствительности различных линий клеток к заражению вирусом Чикунгунья и подбор метода культивирования клеток для максимального накопления и сбора вируса с монослоя.

Материалы и методы: в работе использовали вирус Чикунгунья штамм CHIKV_Nic, линии клеток ФЭК, MRC-5, Vero и 4647; титрование проводили на клетках линии С6/36. При подборе метода культивирования использовали культуральный флакон, клеточную фабрику, роллерную бутыль. Чувствительность клеточных линий к репродукции вируса выявляли по степени накопления инфекционного агента в культуральной жидкости (КЖ). Результат титрования учитывали на 5 сут по выраженному цитопатическому действию вируса.

Результаты: наибольшую чувствительность к заражению и максимальное накопление вируса в КЖ продемонстрировали клеточные линии 4647 и Vero. Клетки линий ФЭК и MRC-5 накапливали вирус в меньших концентрациях. Максимальные титры накопления вируса в КЖ клеточной линии Vero (7,10–7,75 lg ТЦД₅₀/мл) отмечались через 48 ч с момента заражения; оптимальной является множественность заражения (MOI) в диапазоне 0,001– 0,0001 MOI/кл. При множественности заражения 0,0001 MOI/кл накопление вируса в клетках линии Vero при роллерном культивировании происходит на 2 сут с максимальным титром вируса 8,6±0,2 lg ТЦД₅₀/мл.

Выводы: линия клеток Vero соответствует требованиям стабильности и безопасности при производстве вакцины против лихорадки Чикунгунья. Определена минимальная множественность заражения культуры клеток вирусом Чикунгунья. Применение роллерного метода позволяет получить наиболее высокий выход клеточной культуры и, соответственно, наиболее высокое значение титра вируса в КЖ.