Получение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка SARS-CoV-2, обладающей повышенной авидностью к специфическим антителам

Важным параметром, оцениваемым при мониторинге иммунной прослойки у населения и эффективности вакцинации населения, является уровень вируснейтрализующих антител. Разработка подхода к выявлению вируснейтрализующих антител к вирусу SARS-CoV-2 с помощью безопасного, простого и быстрого метода, не требующего использования живых вирусов, имеет большое значение для борьбы с пандемией COVID-19. Для разработки тест-систем для проведения иммуноферментного анализа (ИФА), детектирующих потенциально вируснейтрализующие антитела, необходимо получение высокоочищенного рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка, обладающего высокой авидностью к специфическим антителам.

Цель работы: получение и характеристика гомодимерной формы RBD S-белка вируса SARS-CoV-2, а также клеточной линии, продуцирующей рекомбинантный RBD, для создания ИФА тест-системы для выявления потенциально вируснейтрализующих антител.

Материалы и методы: дизайн генетической конструкции проводили in silico. Стабильную клеточную линию получали при помощи трансфекции клеток CHO-S, селекции на антибиотике и отбора оптимального клона. Рекомбинантный RBD очищали с использованием хроматографических методов, получали мономерную и гомодимерную формы RBD. Активность полученных форм анализировали с использованием методов Вестерн-блот, биослойной интерферометрии и непрямго ИФА. Для анализа использовали моноклональные антитела GamXRH19, GamP2C5 и h6g3, а также образцы сывороток крови добровольцев, вакцинированных препаратом Гам-КОВИД-Вак, и невакцинированных добровольцев.

Результаты: получена клеточная линия CHO-S, стабильно продуцирующая рекомбинантный RBD S-белка вируса SARS-CoV-2. Показано, что при культивировании данной клеточной линии в режиме fed-batch более 7 суток рекомбинантный RBD способен образовывать гомодимеры за счет наличия неспаренных цистеинов. Количественный выход очищенного рекомбинантного RBD из культуральной жидкости составил 30–50 мг/л. Мономерная и гомодимерная формы RBD были разделены при помощи гель-фильтрации и охарактеризованы по способности взаимодействовать со специфическими моноклональными антителами, а также сыворотками крови от вакцинированных добровольцев. Продемонстрировано, что именно гомодимерная форма рекомбинантного RBD обладает повышенной авидностью к моноклональным антителам и антителам в сыворотке крови вакцинированных.

Выводы: гомодимерная форма рекомбинантного RBD может являться более предпочтительной для анализа уровня антител к рецептор-связывающему домену S-белка вируса SARS-CoV-2.

1. Yang Y, Du L. SARS-CoV-2 spike protein: a key target for eliciting persistent neutralizing antibodies. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):95. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00523-5

2. Piccoli L, Park Y-J, Tortorici MA, Czudnochowski N, Walls AC, Beltramello M, et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 2020;183(4):1024–42.e21. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.037

3. Рябова ЕИ, Деркаев АА, Есмагамбетов ИБ, Щебляков ДВ, Довгий МА, Бырихина ДВ и др. Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021;21(4):266–78. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278

4. Favorskaya IA, Shcheblyakov DV, Esmagambetov IB, Dolzhikova IV, Alekseeva IA, Korobkova AI, et al. Single-domain antibodies efficiently neutralize SARS-CoV-2 variants of concern. Front Immunol. 2022;13:822159. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.822159

5. Есмагамбетов ИБ, Щебляков ДВ, Егорова ДА, Воронина ОЛ, Деркаев АА, Воронина ДВ и др. Наноантитела — потенциальный терапевтический препарат против лихорадки Эбола. Acta Naturae. 2021;13(4):53–63. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11487

6. Воронина ДВ, Щебляков ДВ, Есмагамбетов ИБ, Деркаев АА, Попова О, Щербинин ДН. Получение нейтрализующих наноантител к стеблевому домену гемагглютинина вируса гриппа типа А. Acta Naturae. 2021;13(4):33–41. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11495

7. Pang NY-L, Pang AS-R, Chow VT, Wang D-Y. Understanding neutralising antibodies against SARS-CoV-2 and their implications in clinical practice. Mil Med Res. 2021;8(1):47. https://doi.org/10.1186/s40779-021-00342-3

8. Shcheblyakov D, Esmagambetov I, Simakin P, Kostina L, Kozlov A, Tsibezov V, et al. Development and characterization of two GP-specific monoclonal antibodies, which synergistically protect non-human primates against Ebola lethal infection. Antiviral Res. 2019;172:104617. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.104617

9. Dogan M, Kozhaya L, Placek L, Gunter C, Yigit M, Hardy R, et al. SARS-CoV-2 specific antibody and neutralization assays reveal the wide range of the humoral immune response to virus. Commun Biol. 2021;4(1):129. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01649-6

10. Takheaw N, Liwsrisakun C, Chaiwong W, Laopajon W, Pata S, Inchai J, et al. Correlation analysis of anti-SARS-CoV-2 RBD IgG and neutralizing antibody against SARS-CoV-2 Omicron variants after vaccination. Diagnostics. 2022;12(6):1315. https://doi.org/10.3390/diagnostics12061315

11. Luo S, Xu J, Cho CY, Zhu S, Whittaker KC, Wang X, et al. Quantitative detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies using indirect ELISA. Lab Med. 2022;53(3):225–34. https://doi.org/10.1093/labmed/lmab085

12. Mehdi F, Chattopadhyay S, Thiruvengadam R, Yadav S, Kumar M, Sinha SK, et al. Development of a fast SARS-CoV-2 IgG ELISA, based on receptor-binding domain, and its comparative evaluation using temporally segregated samples from RT-PCR positive individuals. Front Microbiol. 2021;11:618097. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.618097

13. Shajahan A, Supekar NT, Gleinich AS, Azadi P. Deducing the N- and O-glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2. Glycobiology. 2020;30(12):981–8. https://doi.org/10.1093/glycob/cwaa042

14. Walls AC, Park Y-J, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 2020;181(2):281–92.e6. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058

15. Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, McLellan JS, Crispin M. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike. Science. 2020;369(6501):330–3. https://doi.org/10.1126/science.abb9983

16. Kim JY, Kim Y-G, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;93(3):917–30. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3758-5