Стандартизация микробиологического метода выявления микоплазменной контаминации в биологических лекарственных   препаратах: разработка стандартного образца  Acholeplasma laidlawii  PG8

С. М. Суханова; З. Е. Бердникова; О. В. Фадейкина

doi:10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107

Стандартизация микробиологического метода выявления микоплазменной контаминации в биологических лекарственных препаратах: разработка стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8

С. М. Суханова, З. Е. Бердникова, О. В. Фадейкина

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107

Полный текст:

PDF (Rus) HTML XML Допфайлы

сгенерировать QR код

Содержание

Перейти к:

Резюме

ВВЕДЕНИЕ. Выявление микоплазм является одной из наиболее сложных проблем при контроле микробной контаминации биологических лекарственных препаратов (БЛП). Для обнаружения микоплазм в БЛП и стандартизации микробиологического метода контроля необходимы высокочувствительные питательные среды и фармакопейные стандартные образцы (ФСО) тест-штаммов различных видов микоплазм.

ЦЕЛЬ. Разработка и аттестация нового фармакопейного стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8 для проведения испытаний биологических лекарственных препаратов на присутствие микоплазм микробиологическим методом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Разработку ФСО проводили согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) с использованием штамма A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116), питательной среды Каган, сыворотки крови лошади. Аттестация ФСО включала определение значения титра штамма A. laidlawii PG8 методом наиболее вероятных чисел и испытания по следующим показателям качества: «Описание», «Наличие вакуума», «Время растворения», «Внешний вид растворенного образца», «Стерильность», «Потеря в массе при высушивании», «Однородность массы (средняя масса и отклонение от средней массы)».

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведена разработка ФСО A. laidlawii PG8 и составлена спецификация ФСО. Приготовлены лиофилизированные образцы основного и рабочего банков культуры A. laidlawii PG8. Установлено, что процедура лиофилизации не оказывает существенного воздействия на жизнеспособность штамма. Показана стабильность значений титра штамма (10⁸ КОЕ/мл), культуральных и физико-химических свойств образцов по критически важным для обеспечения качества и надежности показателям в течение двух лет хранения при температуре минус 20–30°С. Аттестованы три серии ФСО A. laidlawii PG8. Значения титра серий ФСО варьировались от 10×10⁸ до 21×10⁸ КОЕ/мл. Показана сопоставимость разработанного ФСО со стандартным образцом Европейской фармакопеи BRP A. laidlawii, серия 1 (титр 2,45×10⁶ КОЕ/мл). На основании результатов исследований ФСО A. laidlawii PG8 включен в Реестр ФСО ГФ РФ.

ВЫВОДЫ. Разработан и аттестован новый ФСО A. laidlawii PG8. ФСО может быть использован для оценки ростовых свойств питательных сред, определения наличия ингибирующего действия, а также в качестве положительного контроля при испытаниях БЛП и биологических материалов, применяемых в их производстве, на присутствие микоплазм микробиологическим методом согласно требованиям ГФ РФ. Внедрение ФСО будет способствовать стандартизации и повышению качества контроля БЛП, а также гармонизации требований ГФ РФ с международными стандартами.

Ключевые слова

микоплазмы, Acholeplasma laidlawii, микробная контаминация, биологические лекарственные препараты, контроль качества, стандартный образец, ФСО, микробиологический метод, питательная среда, стандартизация, гармонизация

Для цитирования:

Суханова С.М., Бердникова З.Е., Фадейкина О.В. Стандартизация микробиологического метода выявления микоплазменной контаминации в биологических лекарственных препаратах: разработка стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2026;26(1):97-107. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107

For citation:

Sukhanova S.M., Berdnikova Z.E., Fadeikina O.V. Standardizing microbiological method to detect mycoplasma contamination in biological products: development of Acholeplasma laidlawii PG8 reference standard. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2026;26(1):97-107. (In Russ.) https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107

ВВЕДЕНИЕ

Надежность и достоверность выявления микоплазменной контаминации на всех этапах производства биологических лекарственных препаратов (БЛП) необходимы для обеспечения их качества и безопасности. Микоплазмы способны инфицировать клеточные культуры и вакцинные препараты, изменяя характеристики культуры, используемой для производства вакцин, и конечного продукта, что обусловливает необходимость применения особых приемов для их выявления¹ [1–6].

Государственная фармакопея Российской Федерации (ГФ РФ)², Европейская фармакопея³, Фармакопея США⁴, Британская⁵, Индийская⁶ и Китайская фармакопеи⁷ рекомендуют для обнаружения микоплазм в загрязненных клеточных субстратах и вирусных штаммах применять метод прямого культивирования и метод индикаторной клеточной культуры. Международные экспертные организации, включая Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ)⁸, Европейское агентство по лекарственным средствам (European Medicines Agency)⁹, Международный совет по гармонизации технических требований к лекарственным средствам для медицинского применения (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)¹⁰, рассматривают метод прямого культивирования как основной для тестирования банка клеток, посевной партии вирусов, контрольных клеточных культур, контроля вирусного сбора, нерасфасованной (bulk) партии или готовой серии вакцины¹¹ [4].

Проведение испытаний предполагает использование питательных сред, характеристики которых зависят от качества биологических компонентов, что влияет на результаты. Поэтому обязательным условием испытаний является достаточный рост штаммов микоплазм на выбранной питательной среде (ПС). Используемые микроорганизмы должны представлять распространенные виды-контаминанты клеточных культур [7]: Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma gallisepticum, M. hyorhinis, M. orale, M. pneumonia, M. synoviae. Для адекватной оценки исследуемых образцов в качестве тест-штаммов рекомендуется применять микроорганизмы, выделенные из патогенного материала, или использовать соответствующие фармакопейные стандартные образцы (ФСО), например стандартные образцы (СО) биологических препаратов Европейской фармакопеи (biological reference preparations, BRP)¹² с ограниченным числом пассажей [8]. Стандартизация методов контроля БЛП и материалов, используемых в процессе их производства, представляет собой эффективный способ обеспечения качества и безопасности выпускаемого продукта¹³. Применение СО для оценки пригодности ПС и определения наличия антимикробного действия самого БЛП позволяет повысить сопоставимость и воспроизводимость результатов для более полной и объективной оценки качества, а также упростить процедуру анализа.

Согласно требованиям ГФ РФ для проведения испытания на присутствие микоплазм рекомендовано использовать СО штаммов, прежде всего Mycoplasma arginini G230, или, в зависимости от типа испытуемого препарата, другие виды микоплазм¹⁴, которые на российском рынке отсутствуют. Ранее авторы обосновали необходимость расширения спектра новых СО штаммов, включая широко распространенный штамм, ферментирующий D-глюкозу, и устойчивый к антибиотикам A. laidlawii [9].

Создание новых российских ФСО тест-штаммов микоплазм в условиях ограниченного доступа к зарубежным СО является актуальной задачей. Ее решение позволит усовершенствовать существующую методику испытаний и гармонизировать требования ГФ РФ с международными стандартами.

Цель работы — разработка и аттестация нового фармакопейного стандартного образца Acholeplasma laidlawii PG8 для проведения испытаний БЛП на присутствие микоплазм микробиологическим методом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В работе использовали штамм A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116) из коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России), полученный из лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (штамм предоставлен Aarhus University, Дания). Использовали лиофилизированные образцы серии «0» (основной банк) и трех рабочих серий кандидата в ФСО — тест-штамма A. laidlawii PG8 (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России); питательные среды: жидкую и полужидкую Каган (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России), согласно требованиям ГФ РФ¹⁵; сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм (кат. № 1.1.5.2, ООО «БиолоТ», Россия); ФСО.3.2.00378 М. arginini 230 с действующим сроком годности (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России); стандартный образец Европейской фармакопеи BRP A. laidlawii, серия 1¹⁶.

Оборудование

Использовали аттестованное оборудование: термостат ТС-1/20 СПУ («Смоленское СКТБ СПУ», Россия); термошкаф (инкубатор) тип B 115 (Binder GmbH); шкаф ламинарный II класса БАВп-01-1,2 (ЗАО «Ламинарные системы», Россия); морозильная камера «Саратов 127» (ООО «СЭПО-ЗЭМ», Россия); дозатор пипеточный с переменным объемом доз, одноканальный (ДПОПц-1-10-5000, ООО «Ленпипет», Россия).

Методы

Лиофилизацию культуры штамма A. laidlawii PG8 проводили на аппарате Epsilon 2-4 LSCplus (Martin Christ, Германия). Образцы хранили при температуре минус 20–30°С.

Качество лиофилизированных образцов оценивали по следующим показателям:

«Описание», «Время растворения» и «Внешний вид восстановленного образца» — визуально;
«Наличие вакуума» (в упаковке для контроля попадания воздуха и предотвращения ухудшения свойств культуры) — визуально в поле высокочастотного разряда¹⁷;
«Стерильность» (отсутствие посторонней микрофлоры) — методом прямого посева¹⁸;
«Потеря в массе при высушивании» — весовым методом¹⁹;
«Однородность массы (средняя масса и отклонение от средней массы)» — весовым методом²⁰ (для оценки точности проводимого розлива, косвенно показывающего равномерность распределения клеток между экземплярами серии).

Значение титра (количественный показатель концентрации живых клеток) определяли на полужидкой ПС методом наиболее вероятных чисел (НВЧ), используя десятикратные разведения. Каждое разведение высевали в три пробирки и инкубировали при температуре 37±1°С в течение 7 сут. Регистрировали предельные контрольные разведения, в которых отмечали наличие роста микоплазм, принимая их за значение титра. Расчет титра проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди²¹. При аттестации титр штамма серии «0» (основной банк) устанавливали посевом 10 образцов на двух партиях ПС, а трех рабочих серий — посевом 5 образцов с последующим расчетом среднего арифметического значения КОЕ/мл.

Критерии приемлемости результатов значения титра. С учетом специфики методики и изменчивого состава ПС значения коэффициента титра в пределах одного порядка (например, 2,5×10⁸, 4,5×10⁸) считали сопоставимыми. Анализ проводили по значениям контрольных разведений (не менее 10⁷) без учета коэффициента.

Оценку стабильности образцов проводили после лиофилизации и через 6, 12, 18 и 24 мес. хранения при температуре минус 20–30°С.

Ростовые свойства питательных сред определяли согласно требованиям ГФ РФ²² с использованием ФСО.3.2.00378 М. arginini 230.

Статистическая обработка результатов. Рассчитывали среднее арифметическое значение (Х_ср) НВЧ микроорганизмов и относительное стандартное отклонение [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ стандартного образца Европейской фармакопеи A. laidlawii

С учетом значимости Европейской фармакопеи для гармонизации российских фармакопейных стандартов в работе были определены основные характеристики BRP A. laidlawii²³. Экспертный совет Европейской фармакопеи рекомендовал его в качестве тестового микроорганизма для проверки ростовых свойств ПС при испытании методом прямого посева, особенно для вакцин, в производстве которых использовались антибиотики²⁴. Установлено, что BRP A. laidlawii, серия 1, представляет собой замороженную суспензию штамма, прошедшего менее 15 пассажей от исходного клона, выделенного из культуры кератиновых клеток [8]. Предполагаемый расчетный титр серии составляет 2,45×10⁶ КОЕ/мл, с допустимым диапазоном от 3,89×10⁵ до 1,55×10⁷ КОЕ/мл, в условиях хранения при температуре не выше минус 60°С. При подготовке к испытанию в образце подтверждают титр и используют установленное разведение (согласно Европейской фармакопее, не более 100 КОЕ) для посева на ПС.

Приготовление и изучение свойств образцов штамма A. laidlawii PG8 серии «0» — кандидата в ФСО

Для получения серии кандидата в ФСО лиофилизированную культуру штамма A. laidlawii PG8 (ГКПМ 930002, ATCC 23206, NCTC 10116) инкубировали в ПС с сывороткой крови лошади при температуре 37±1°С. Через 24–48 ч наблюдали микробный рост, характеризующийся незначительным помутнением и равномерной опалесценцией среды по сравнению с прозрачной контрольной средой . Морфологические свойства соответствовали паспортным данным штамма²⁵.

Для накопления биомассы культуру инкубировали до 4 сут, отмечая при этом увеличение помутнения (рис. 1). Затем полученную суспензию разделяли на аликвоты объемом 1 мл и подвергали лиофилизации. Приготовленные образцы герметизировали и хранили при температуре минус 20–30°С. Изучали морфологические свойства и определяли титр образцов штамма до и после лиофилизации согласно ГФ РФ на полужидкой ПС Каган²⁶. Значения титра, рассчитанного на двух партиях ПС до и после лиофилизации, представлены в таблицах 1 и S1 (опубликована на сайте журнала²⁷).

Фотография выполнена авторами / The photograph was taken by the authors

Рис. 1. Рост штамма A. laidlawii PG8 серии «0» на жидкой питательной среде Каган: 1 — контроль (незасеянная среда), 2 — культура A. laidlawii PG8.

Fig. 1. Growth of A. laidlawii PG8 strain (series "0") on liquid Kagan’s medium: 1, control (uninoculated medium), 2, A. laidlawii PG8 culture.

Таблица 1. Определение титра штамма A. laidlawii PG8 серии «0» по таблице Мак-Креди (до лиофилизации)

Table 1. Titre determination of A. laidlawii PG8 strain, batch "0", using McCrady's table (prior to lyophilisation)

Номер пробирки *Test tube number*	Разведение *Dilution*	*Наличие роста A. laidlawii* PG8 на 7 сут инкубации (три повторности) Growth of the A. laidlawii PG8 on Day 7 of incubation (in triplicate)**
Номер пробирки *Test tube number*	Разведение *Dilution*	Партия среды 79 *Medium batch 79*	Партия среды 154 *Medium batch 154*
1–8	10⁻¹–10⁻⁸	+ + +	+ + +
9	10⁻⁹	– – –	+ + –
10	10⁻¹⁰	– – –	– – –
Предельное разведение Limiting dilution		10⁻⁸	10⁻⁹
Числовая характеристика (Мак-Креди) Numerical interpretation (McCrady)		300	320
НВЧ в трех повторностях, КОЕ/мл MPN in triplicate, CFU/mL		2,5×10⁸	15,0×10⁸
Среднее арифметическое НВЧ, КОЕ/мл MPN arithmetic mean, CFU/mL		8,7×10⁸

Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data

Примечание. «+» — наличие роста микоплазм; «–» — отсутствие роста микоплазм; НВЧ — наиболее вероятное число; КОЕ — колониеобразующая единица.

Note. +, growth of mycoplasmas; –, no growth of mycoplasmas; MPN, most probable number; CFU, colony-forming unit.

Для оценки влияния лиофилизации на концентрацию штамма проведен сравнительный анализ титра для исходного образца и образца, подвергшегося процедуре лиофилизации. Анализ показал незначительные различия полученных значений в пределах одного порядка: от 2,5×10⁸ до 15,0×10⁸ КОЕ/мл до лиофилизации и от 5,2×10⁸ до 9,3×10⁸ КОЕ/мл после лиофилизации (табл. 1, S1). Это свидетельствует о приемлемости и сходимости полученных результатов. При оценке влияния среды (две партии ПС) показана стабильность среднего значения НВЧ на уровне около 108 КОЕ/мл. Рост микоплазм наблюдался при максимальных разведениях 10⁻⁸–10⁻⁹, что свидетельствовало о минимальном влиянии лиофилизации на жизнеспособность культуры.

Лиофилизированные образцы были дополнительно охарактеризованы по показателям «Потеря в массе при высушивании» и «Однородность массы». Значение показателя «Потеря в массе при высушивании» составило 3,53% при норме не более 5%²⁸. Однородность массы, оцененная как относительное стандартное отклонение от средней массы образца, была равна 1,62% при средней массе образца 1,0042±0,0163 г²⁹. Полученные результаты подтвердили соответствие лиофилизатов требованиям ГФ РФ³⁰.

При изучении воздействия условий хранения на устойчивость характеристик культуры было установлено, что после 6 мес. хранения при температуре минус 20–30°С параметры образцов оставались сопоставимы с исходными. Титр сохранился на уровне 15×10⁸ КОЕ/мл (табл. S2, опубликована на сайте журнала³¹). Среднее содержание клеток в 1 мл культуры варьировало в узком диапазоне в пределах 10⁸, что свидетельствовало об однородности суспензии, точности розлива и высокой выживаемости культуры A. laidlawii PG8. Расчет титра образцов серии «0» после 6 мес. хранения представлен в таблице S2.

Анализ показателей качества образцов серии «0», включая сохранение концентрации микробных клеток на уровне 10⁸–10⁹ КОЕ/мл в течение 6 мес. хранения, и сравнение с характеристиками BRP A. laidlawii, серия 1³², позволили установить ключевые критерии оценки качества СО. На основании этого разработана спецификация и изготовлены три рабочие серии образцов из серии «0» (основной банк штамма A. laidlawii PG8) для дальнейших исследований стабильности.

Разработка спецификации ФСО A. laidlawii PG8

С учетом российских и международных требований к СО БЛП и лиофилизатам³³ [11][12], опыта аттестации и применения ФСО.3.2.00378 М. arginini 230 [9][13], а также характеристик BRP A. laidlawii³⁴, авторами были установлены требования к показателям качества и составлена спецификация ФСО ГФ РФ A. laidlawii PG8. В спецификацию включены методы анализа, нормы и критические показатели для оценки качества образцов и проведения их аттестации на соответствие требованиям к ФСО (табл. 2).

Таблица 2. Спецификация фармакопейного стандартного образца A. laidlawii PG8

Table 2. Specification of A. laidlawii PG8 reference standard

Показатель

Parameter

Метод

Method

Норма

References

Описание (внешний вид) лиофилизата

Description before reconstitution

Визуальный

Visual

Лиофилизированная мелкопористая масса светло-желтого цвета в виде рыхлой таблетки

Light-yellow finely porous lyophilised mass in the form of a friable tablet

Наличие вакуума (герметизация)

Vacuum (container integrity)

Визуальный (ГФ РФ XV изд., ОФС.1.7.1.0018.18)

Visual (SP RF XV, OFS. 1.7.1.0018.18)

Свечение в поле высокочастотного разряда должно быть голубым или розово-голубым

Blue or pink and blue glow in the high-frequency discharge

Время растворения

Reconstitution time

Визуальный

Visual

Время растворения в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида не должно превышать 1 мин

Reconstitution time in 1 mL sterile 0.9% sodium chloride solution is less than 1 min

Описание восстановленного образца

Description after reconstitution

Визуальный

Visual

Суспензия светло-желтого цвета, без осадка и примесей

Light-yellow suspension free of precipitation and impurities

Стерильность

Sterility

Метод прямого посева (ГФ РФ XIV изд., ОФС.1.2.4.0003.15)

Direct inoculation (SP RF XIV, OFS.1.2.4.0003.15

Бактерии и грибы должны отсутствовать

No bacteria or fungi present

Однородность массы дозированной лекарственной формы (средняя масса и отклонение от средней массы)

Mass homogeneity of the weighed dosage forms (average mass and deviation)

Весовой (ГФ РФ XV изд., ОФС.1.4.2.0009)

Weighing (SP RF XV, OFS.1.4.2.0009)

Не более 5%

Not more than 5%

Потеря в массе при высушивании

Loss on drying

Весовой (ГФ РФ XV изд., ОФС.1.2.1.0010)

Weighing (SP RF XV, OFS.1.2.1.0010)

Не более 5%

Not more than 5%

Титр, КОЕ/мл

Titre, CFU/mL

Метод предельных разведений с составлением числовой характеристики по таблице Мак-Креди или по среднему арифметическому значению

Titre calculation by the most probable number method, with numerical interpretation using McCrady’s table or the arithmetic mean

Не ниже 1×10⁷

Not less than 1×10⁷

Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data

Примечание. ГФ РФ — Государственная фармакопея Российской Федерации, ОФС — общая фармакопейная статья, КОЕ — колониеобразующая единица.

Note. SP RF, State Pharmacopoeia of the Russian Federation; OFS, general pharmacopoeial chapter; CFU, colony-forming unit.

Дальнейшую аттестацию и оценку образцов проводили согласно разработанной спецификации.

Приготовление рабочих серий штамма A. laidlawi PG8 и аттестация кандидатов в ФСО

Рабочие серии получали из образцов основного банка после 6 мес. хранения по аналогичной процедуре. При высеве разведений 10⁻¹–10⁻⁹ на полужидкую ПС образцов всех трех серий через 96 ч (4 сут) инкубации наблюдали характерный рост в виде колоний светло-желтого цвета как в зоне посева, так и по всей глубине ПС, соответствующий паспортным данным и культуральным свойствам образцов основного банка (рис. 2).

Фотография выполнена авторами / The photograph was taken by the authors

Рис. 2. Рост штамма A. laidlawii PG8 рабочей серии 1 на полужидкой питательной среде Каган: 1 — культура A. laidlawii PG8, 2 — контроль (незасеянная среда).

Fig. 2. Growth of A. laidlawii PG8 strain (working bank batches 1) on semi-liquid Kagan’s medium: 1, A. laidlawii PG8 culture, 2, control (uninoculated medium).

В рамках аттестации образцы трех рабочих серий были проанализированы по параметрам спецификации. Результаты аттестации показали их сопоставимость и воспроизводимость, в первую очередь по титру штамма (табл. 3).

Таблица 3. Результаты аттестации образцов рабочих серий 1, 2 и 3 тест-штамма A. laidlawii PG8

Table 3. Certification results of working bank batches 1, 2, 3, test strain A. laidlawii PG8

Показатель

Parameter

Требование спецификации

Specification requirement

Результат аттестации образцов

Samples

Рабочая серия 1

Batch 1

Рабочая серия 2

Batch 2

Рабочая серия 3

Batch 3

Описание лиофилизата

Description before reconstitution

Лиофилизированная мелкопористая масса светло-желтого цвета в виде рыхлой таблетки

Light-yellow finely porous lyophilised mass in the form of a friable tablet

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Описание восстановленного образца

Description after reconstitution

Суспензия светло-желтого цвета, без осадка и примесей

Light-yellow suspension free of precipitation and impurities

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Наличие вакуума

Presence of vacuum

Свечение в поле высокочастотного разряда должно быть голубым или розово-голубым

Blue or pink-blue glow in the high-frequency discharge

Розово-голубое свечение

Pink and blue glow

Розово-голубое свечение

Pink and blue glow

Розово-голубое свечение

Pink and blue glow

Время растворения

Reconstitution time

Время растворения в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида не должно превышать 1 мин

Reconstitution time in 1 mL sterile 0.9% sodium chloride less than 1 min

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Стерильность

Sterility

Посторонние бактерии и грибы должны отсутствовать

No extraneous bacteria or fungi present

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Соответствует

Complies

Средняя масса (г) и отклонение от средней массы (RSD, %)

Аverage mass (g) and deviation (RSD, %)

Не более 5%

Not more than 5%

0,05272±0,00079

RSD=1,5%

0,0505±0,00111

RSD=2,1%

0,0489±0,0019

RSD=3,8%

Потеря в массе при высушивании, %

Loss on drying, %

Не более 5%

Not more than 5%

2,91

1,9

2,9

Титр, КОЕ/мл

Titre, CFU/mL

Не ниже 1×10⁷

Not less than 1×10⁷

21×10⁸

19×10⁸

10×10⁸

Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data

Примечание. КОЕ — колониеобразующая единица; RSD — относительное стандартное отклонение.

Note. CFU, colony-forming unit; RSD, relative standard deviation.

Оценка значения титра до и после лиофилизации подтвердила незначительное влияние процедуры на устойчивость культуры A. laidlawii PG8 (табл. 4).

Таблица 4. Стабильность титра тест-штамма A. laidlawii PG8 после хранения при температуре минус 20–30 °С

Table 4. Assessment of the culture titre stability of strain A. laidlawii PG8 stored at -20 to -30 °C

Серия *Batch*	*Титр штамма A. laidlawii* PG8, КОЕ/мл The strain titer A. laidlawii PG8, CFU/mL**
Серия *Batch*	Микробная суспензия до лиофилизации *Microbial suspension prior to lyophilisation*	Образцы после лиофилизации *Samples, post-lyophilisation*	Образцы после 6 мес. хранения *6 months of storage*	Образцы после 12 мес. хранения *12 months of storage*	Образцы после 18 мес. хранения *18 months of storage*	Образцы после 24 мес. хранения *24 months of storage*
Основной банк Master bank	12×10⁸	7,2×10⁸	15×10⁸	10×10⁸	2,9×10⁸	2,9×10⁸
Рабочая серия 1 Working bank batch 1	25×10⁸	21×10⁸	23×10⁸	23×10⁸	21×10⁸	73×10⁸
Рабочая серия 2 Working bank batch 2	45×10⁸	19×10⁸	18×10⁸	73×10⁸	67×10⁸	44×10⁸
Рабочая серия 3 Working bank batch 3	25×10⁸	10×10⁸	13×10⁸	10×10⁸	25×10⁸	11×10⁸

Таблица составлена авторами по собственным данным / The table was prepared by the authors using their own data

Для проверки пригодности полученных образцов согласно процедуре, принятой в Европейской фармакопее [8], образцы были переданы на экспертизу в независимую лабораторию (Департамент контроля качества ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России). Результаты экспертизы подтвердили полное соответствие качества образцов рабочей серии 1 заявленным требованиям спецификации: выявление характерного роста тест-штамма после инкубации рабочих разведений на полужидкой среде Каган в течение 7 сут при температуре 37±1°С.

В связи с отсутствием отклонений от установленных нормативных требований, серии были признаны пригодными в качестве ФСО для исследования стабильности.

Изучение стабильности свойств образцов основного банка и рабочих серий тест-штамма A. laidlawii PG8

Стабильность лиофилизированных образцов основного банка и трех рабочих серий A. laidlawii PG8 оценивали после 6, 12, 18 и 24 мес. хранения при температуре минус 20–30°С на пяти случайно отобранных образцах каждой серии (табл. 4). Условия хранения не оказали значимого влияния на культуральные свойства. Характер и скорость микробного роста во всех образцах в течение срока хранения оставались неизменными и соответствовали паспортным данным штамма. Титр штамма без учета числовых значений коэффициента стабильно сохранялся в пределах одного порядка (10⁸ КОЕ/мл). Количественные показатели также демонстрировали сравнимые значения в пределах неопределенности измерений.

Таким образом, в течение двух лет хранения характеристики всех серий образцов штамма A. laidlawii PG8 оставались стабильными и соответствовали спецификации.

На основании результатов аттестации разработаны Паспорт и Инструкция по применению ФСО A. laidlawii PG8. Данный ФСО, предназначенный для контроля БЛП на присутствие микоплазм в соответствии с требованиями ОФС.1.7.2.0031.15³⁵, утвержден Приказом № 297 от 25.12.2024 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России и внесен в Реестр ФСО ГФ РФ под реестровым номером ФСО.3.2.00473³⁶.

Разработанный ФСО A. laidlawii PG8 предназначен для использования в испытаниях БЛП на присутствие микоплазм микробиологическим методом согласно требованиям ОФС.1.2.4.003.15. С помощью ФСО возможна оценка пригодности партии питательной среды с уровнем чувствительности не более 100 КОЕ. В испытаниях могут применяться любые ПС, обладающие рост-стимулирующими свойствами в отношении A. laidlawii PG8, включая рекомендованную ГФ РФ полужидкую среду Каган. Данная среда обеспечивает минимальные анаэробные условия, благоприятные для выделения и культивирования как аргининзависимых (M. arginini G230), так и глюкозоферментирующих (A. laidlawii PG8) микоплазм, а также среда позволяет использовать лиофилизированные образцы ФСО A. laidlawii PG8 без предварительного накопления на других средах, что упрощает методику тестирования образцов.

Введение ФСО A. laidlawii PG8 в процедуру микробиологических испытаний БЛП расширяет спектр обнаруживаемой контаминации. ФСО может применяться для оценки качества лекарственных средств и ветеринарных препаратов, в производстве которых использовались антибиотики, а также для оценки иных материалов животного и растительного происхождения, включая сухие питательные среды, потенциально контаминированные микоплазмами. В качестве альтернативы не исключается возможность использования ФСО тест-штамма A. laidlawii PG8 при разработке метода ПЦР диагностики микоплазменной контаминации в различных материалах биологического происхождения.

ВЫВОДЫ

Приготовлены лиофилизированные образцы основного и рабочего банков культуры штамма A. laidlawii PG8.
Показана стабильность аттестованных значений титра штамма (10⁸ КОЕ/мл), культуральных и физико-химических свойств образцов по критически важным для обеспечения качества и надежности показателям в течение двух лет хранения при температуре минус 20–30°С.
Разработан и аттестован новый ФСО A. laidlawii PG8 для оценки ростовых свойств питательных сред, определения ингибирующего действия препаратов и использования в качестве положительного контроля при испытаниях на присутствие микоплазм согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации. По характеристикам ФСО A. laidlawii PG8 сопоставим со стандартным образцом Европейской фармакопеи BRP A. laidlawii, серия 1.
На основании результатов аттестации ФСО A. laidlawii PG8 включен в Реестр ФСО Государственной фармакопеи Российской Федерации.
Внедрение в практику ФСО, предназначенного для стандартизации микробиологического метода выявления контаминации в БЛП, будет способствовать повышению качества контроля БЛП и позволит гармонизировать российские и международные подходы в отношении лекарственных средств, контаминированных различными видами микоплазм.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены таблицы S1 и S2.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s2

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJЕ. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.М. Суханова — сбор и анализ источников литературы, систематизация и интерпретация результатов, формулировка выводов, научное редактирование и критическая переработка текста рукописи; З.Е. Бердникова — идея исследования, выполнение экспериментальных работ, написание текста рукописи; О.В. Фадейкина — концепция и дизайн исследования, статистическая обработка результатов.

Благодарности. Коллектив авторов выражает искреннюю благодарность и признательность сотрудникам и руководству иммунобиологического сектора Департамента контроля качества ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, принявших участие в апробации стандартного образца.

Additional information. Tables S1 и S2 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s2

Authors’contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. S.M. Sukhanova analysed, systematised and interpreted the results, formulated the conclusions, collected and analysed literature data, edited and critically revised the manuscript; Z.E. Berdnikova conceived the study idea, conducted the experiments, and drafted the manuscript; O.V. Fadeikina elaborated study concept and design, statistically processed the results, and drafted the manuscript.

Acknowledgments. The authors express their sincere gratitude and appreciation to the Immunobiological Sector of Quality Control Department, Saint Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Sera and Enterprise for the Production of Bacterial Preparations of the Federal Medical and Biologic Agency of Russia, who participated in the standard approbation.

1. ГОСТ Р 70610-2022. Национальный стандарт Российской Федерации. Яйца куриные инкубационные для иммунобиологических производств. Технические условия.

2. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.

3. 2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5; 2024.

4. <63> USP 46–NF41 Mycoplasma tests. United State Pharmacopeia; 2025.

5. Test for absence of mycoplasmas. British Pharmacopoeia. Vol. 1; 2024.

6. 2.7.4. Test for absence of mycoplasmas. Indian Pharmacopoeia. Vol. 1; 2022.

7. 3301 Test for mycoplasma. Pharmacopoeia of the Peoples’ Republic of China. Vol. III; 2020.

8. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards, Аnnex 2, TRS No 932. WHO; 2004.

9. VICH GL34: Biologicals: testing for the detection of Mycoplasma contamination (EMA/CVMP/VICH/463/2002). EMA; 2013.

10. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество: практическое руководство. СПб: ЦОП «Профессия»; 2017.

11. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.

2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5; 2024.

<63> USP46-NF41 Mycoplasmas. United State Pharmacopeia; 2025.

12. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf

13. ГОСТ ISO Guide 35-2015. Стандартные образцы. Общие и статистические принципы сертификации (аттестации).

14. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.

15. Там же.

16. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf

17. ОФС.1.8.1.0002 Иммунобиологические лекарственные препараты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.

18. ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1; 2018.

19. ОФС.1.2.1.0010.15 Потеря в массе при высушивании. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.

20. ОФС.1.4.2.0009 Однородность массы дозированных лекарственных форм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.

21. ГОСТ 54653-2011. Удобрения органические. Методы микробиологического анализа.

22. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.

23. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf

24. 2.6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia. 11th ed. Suppl. 11.5; 2024.

25. Паспорт штамма Acholeplasma laidlawii ГКПМ 930002. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.

26. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.

27. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s1

28. ОФС. 1.2.1.0010.15 Потеря в массе при высушивании. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.

29. ОФС.1.4.2.0009 Однородность массы дозированных лекарственных форм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.

30. ОФС.1.4.1.0031 Лиофилизаты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.

31. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s2

32. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf

33. Recommendations for the preparation, characterization and establishment of international and other biological reference standards. Аnnex 2. TRS No 932. WHO; 2004.

ГОСТ ISO Guide 35-2015. Стандартные образцы. Общие и статистические принципы сертификации (аттестации).

ОФС.1.4.1.0031 Лиофилизаты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд.; 2023.

34. Ph. Eur. Reference Standard — LEAFLET. Acholeplasma laidlawii BRP batch 1. https://crs.edqm.eu/db/4DCGI/leaflet?leaflet=Y0000693_1.pdf

35. ОФС.1.7.2.0031.15 Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд.; 2018.

36. Реестр Фармакопейных стандартных образцов Государственной фармакопеи Российской Федерации. https://www.regmed.ru/produkt-n-service/fso/fso-registry/fso-of-biological-origin/

Список литературы

1. David SA, Volokhov DV, Ye Z, Chizhikov V. Evaluation of Mycoplasma inactivation during production of biologics: egg-based viral vaccines as a model. Appl Environ Microbiol. 2010;76(9):2718–28. https://doi.org/10.1128/AEM.02776-09

2. Гладин ДП, Козлова НС, Эйдельштейн ИА и др. Микоплазмы. Биологические свойства (лекция). Российские биомедицинские исследования. 2023;8(4):103–15. https://doi.org/10.56871/RBR.2023.58.16.012

3. Леонович ОА. Микоплазма: свойства, методы обнаружения и дезактивации клеточных культур и штаммов вирусов (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2024;60(5):435–44. https://doi.org/10.1134/S0003683824604943

4. Kalaivani M, Chaudhary P, Goyal M, et al. Current regulatory and pharmacopoeial status of mycoplasma testing in concern with vaccines safety for human use. J Basic Clin Pharma. 2021;12(S4):001.

5. Medvedeva ES, Mouzykantov AA, Kostenko VV, et al. Adaptation to antimicrobials and pathogenicity in mycoplasmas: Development of ciprofloxacin-resistance and evolution of virulence in Acholeplasma laidlawii. Dokl Biochem Biophys. 2021;501(1):444–8. https://doi.org/10.1134/S1607672921060028

6. Думченко НБ, Семенцова АО, Нечаева ЕА. Изучение контаминации микоплазменными инфекциями культур клеток насекомых из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Вестник ПНИПУ. Химическая технология и биотехнология. 2023;(3):19–29. EDN: JUIIMN

7. Rottem S, Kosower NS, Kornspan JD. Contamination of tissue cultures by mycoplasmas. In: Ceccherini-Nelli L, Matteoli B, eds. Biomedical Tissue Culture. 2012. https://doi.org/10.5772/51518

8. Milne C, Daas A. Establishment of European Pharmacopoeia mycoplasma reference strains. Pharmeuropa Bio. 2006;(1):57– 72. PMID: 17270132

9. Суханова СМ, Бердникова ЗЕ, Тихонова АС. Совершенствование методики оценки качества питательной среды для выявления микоплазм. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(3):161–8. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-3-161-168

10. Glantz SA. Primer of Biostatistics. 4th ed. New York: McGraw–Hill; 1994.

11. Фадейкина ОВ, Волкова РА. Разработка порядка аттестации стандартных образцов биологических лекарственных средств. Химико-фармацевтический журнал. 2017;51(8):44–50. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2017-51-8-44-50

12. Гегечкори ВИ, Шатилина АА, Шульга НА. Биологические стандартные образцы: актуальные вопросы разработки и порядка аттестации. Эталоны. Стандартные образцы. 2023;19(3):21–9. EDN: RKQAVM

13. Суханова СМ, Бердникова ЗЕ, Фадейкина ОВ и др. Анализ стабильности стандартного образца тест-штамма Мycoplasma аrginini G230, используемого при испытании на присутствие микоплазм биологических лекарственных препаратов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(3):331–46. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-331-346

Об авторах

С. М. Суханова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Суханова Светлана Михайловна, канд. биол. наук

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

З. Е. Бердникова

Бердникова Зинаида Евтропиевна, канд. биол. наук

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

О. В. Фадейкина

Фадейкина Ольга Васильевна, канд. биол. наук

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Дополнительные файлы

	1. Таблица S1. Определение титра штамма A. laidlawii PG8 серии «0» (образцы А1–А10) по таблице Мак-Креди (после лиофилизации)
	Тема
	Тип	Исследовательские инструменты
	Скачать (121KB)	Метаданные ▾

	2. Таблица S2. Определение титра штамма A. laidlawii PG8 серии «0» (образцы А1–А5) после 6 мес. хранения при температуре минус 20–30 °С по таблице Мак-Креди
	Тема
	Тип	Исследовательские инструменты
	Скачать (119KB)	Метаданные ▾

Рецензия

Для цитирования:

For citation:

JATS XML

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

ISSN 2221-996X (Print)
ISSN 2619-1156 (Online)

Логин
Пароль
	Запомнить меня
Регистрация нового пользователя Забыли Ваш пароль?

	Заголовок	Таблица S1. Определение титра штамма A. laidlawii PG8 серии «0» (образцы А1–А10) по таблице Мак-Креди (после лиофилизации)
	Тип	Исследовательские инструменты
	Дата	2026-04-03
Digital Object Identifier	https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s1

	Заголовок	Таблица S2. Определение титра штамма A. laidlawii PG8 серии «0» (образцы А1–А5) после 6 мес. хранения при температуре минус 20–30 °С по таблице Мак-Креди
	Тип	Исследовательские инструменты
	Дата	2026-04-03
Digital Object Identifier	https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-1-97-107-table-s2

Войти

БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение

Полный текст:

Резюме

Ключевые слова

Для цитирования:

For citation:

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Оборудование

Методы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ стандартного образца Европейской фармакопеи A. laidlawii

Приготовление и изучение свойств образцов штамма A. laidlawii PG8 серии «0» — кандидата в ФСО

Разработка спецификации ФСО A. laidlawii PG8

Приготовление рабочих серий штамма A. laidlawi PG8 и аттестация кандидатов в ФСО

Изучение стабильности свойств образцов основного банка и рабочих серий тест-штамма A. laidlawii PG8

ВЫВОДЫ

Список литературы

Об авторах

Дополнительные файлы

Рецензия

Для цитирования:

For citation:

Использование куки-файлов