Экзосомы, продуцируемые мезенхимальными стромальными клетками, для терапии острого респираторного дистресс-синдрома: обзор доклинических и клинических исследований

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время приобретает актуальность исследование стратегий лечения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), который развивается вследствие различных причин (бактериальные или вирусные пневмонии, сепсис, травмы грудной клетки, отравление газами и др.) [1]. ОРДС — воспалительное альвеолярное поражение легких, характеризующееся повышением проницаемости альвеолокапиллярной мембраны. При этом формируется некардиогенный отек легких, снижается количество вентилируемых альвеол как следствие отсутствия сурфактанта [2][3]. По мере развития воспалительного процесса возникает реакция иммунной системы по типу «цитокинового шторма», выделение провоспалительных цитокинов, биологически активных веществ в отношении сосудистой стенки, клеток — эффекторов субстанций, приводящих к повреждению альвеолоцитов и эндотелиоцитов, появлению аутореактивных клонов плазматических клеток, разрушающих клетки эпителия, и экссудативному воспалению, вследствие чего повышается летальность [4]. При развитии цитокинового шторма патогенез ОРДС быстро достигает наибольшей выраженности, что ведет к нарушению функционирования механизмов цитотоксичности клеток. ОРДС плохо поддается неспецифическому лечению. В клиниках часто ограничиваются предотвращением некардиогенного отека, используют различные методы вентиляции легких, оксигенации для уменьшения гипоксии и другие методы купирования полифункциональной недостаточности.

H. Xu с соавт. обратили внимание на то, что изменчивость результатов применения терапии в клинике обусловлена существованием двух типов ОРДС: первичного — «легочного» и вторичного — «внелегочного», который, в свою очередь, разделен на два подтипа. Деление ОРДС на группы и подгруппы основано на клинических, биологических, рентгенологических и генетических критериях и необходимо для определения фенотипа ОРДС и выбора стратегии эффективного лечения пациентов [5]. До сих пор не хватает специфических лекарственных препаратов (гормоны, антибиотики, сурфактанты), которые при этом недостаточно эффективны и не приводят к полноценному восстановлению легких.

По данным Росстата¹, с 2010 по 2019 гг. в России отмечался рост первичной заболеваемости бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). С конца 2019 г. ОРДС констатировали у 15–33% пациентов, госпитализированных с диагнозом COVID-19, что увеличило социальную и экономическую нагрузку на отделения интенсивной терапии. Разрушительное воздействие ОРДС на организм можно сравнить с последствиями злокачественных опухолей, СПИДа, обширного инфаркта [6][7]. Были предприняты попытки использовать в лечебных целях сыворотку переболевших пациентов (реконвалесценты) и специфических антител [8]. Определенные успехи были достигнуты при применении КОВИД-глобулина. Результаты проведенных исследований показали, что «эффективность КОВИД-глобулина в дозе 1 мл/кг на фоне применения стандартной терапии превосходит эффективность плацебо при лечении пациентов со среднетяжелым течением COVID-19» [9]; «назначение КОВИД-глобулина рекомендовано в дозе 1 мл/кг по принципу «чем раньше, тем лучше», но не позже 7 сут заболевания, однако противопоказано при развившемся цитокиновом шторме ранее 7 сут заболевания» [9].

Новым этапом лечения заболеваний, плохо поддающихся воздействию стандартными лекарственными препаратами, стало применение клеточной терапии. Открытие стволовых мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в костном мозге (КМ) [10], жировой и других тканях [11], разработка метода получения диплоидных штаммов этих полипотентных клеток [12], изучение их дифференцировочной потентности [13] создали возможность использования МСК для восстановления поврежденных тканей [14]. Положительные результаты доклинических экспериментов обусловили трансляцию клеточной терапии в клиническую практику. На основе МСК были разработаны несколько методов для лечения заболеваний костно-мышечной системы (остеопороз) [15], аллергических [16], неврологических (болезнь Паркинсона) [17], онкологических (инвазивный рак мочевого пузыря) [18] и других заболеваний [19]. Был создан препарат NestCell® для лечения пациентов с тяжелой формой пневмонии, вызванной COVID-19² [20].

В предыдущие годы результаты экспериментов на животных [21][22] и результаты клинических исследований [23–25] продемонстрировали, что МСК и секретом культур МСК³ могут значительно снизить воспалительный процесс и связанные с ним патологические нарушения, вызванные COVID-19 и другими инфекционными заболеваниями легких. Регенерация поврежденной ткани легких при введении МСК происходит за счет трансдифференцировки стволовых клеток и за счет паракринного/гормонального влияния, направленного на активацию выработки противовоспалительных цитокинов. Последний механизм считается доминирующим [20][26].

Терапия на основе МСК имеет некоторые существенные недостатки: низкую стабильность препаратов, риск тромбоэмболии легочной артерии и опухолеобразования и др. [27][28]. Установлено, что экзосомы, выделенные из МСК, обладают такими же противовоспалительными и регенеративными свойствами, как и сами клетки [29]. Преимущества экзосом заключаются в гистосовместимости, низкой иммуногенности и онкогенности, простоте хранения и высокой стабильности. Экзосомы обеспечивают направленную доставку лекарств в клетки реципиентов. Открытие экзосом, выделенных из секретома культивируемых МСК, стало многообещающей перспективой в лечении многих тяжелых заболеваний, в том числе и ОРДС, а также позволило применять экзосомы вместо МСК [30][31].

Экзосомы, присутствующие во всех клетках, тканях и жидкостях организма, представляют собой наночастицы размером 50–100 нм, покрытые мембраной из липидного бислоя со связанными с ней молекулами клеточной адгезии. Экзосомы имеют ряд преимуществ перед МСК, повышающих эффективность и безопасность их применения: малые размеры; низкую иммуногенность; выраженные регенеративные свойства; отсутствие туморогенности; способность проникать через гематоэнцефалический барьер; низкий риск тромбообразования в легочных капиллярах. Экзосомы обеспечивают обмен эпигеномной информацией при межклеточных взаимодействиях. Терапевтическое действие экзосом опосредовано переносом мРНК, белков и рецепторов экзосом в поврежденные ткани [32]. К другим важным преимуществам экзосом можно отнести более простые по сравнению с МСК способы их получения и хранения при лиофилизации или глубокой заморозке, что обеспечивает качественную транспортировку без потери терапевтических свойств [33][34].

Полученные из МСК экзосомы продемонстрировали лучший терапевтический эффект на доклинических моделях ОРДС. Введение экзосом в организм подавляло агрегацию макрофагов в легочной ткани, снижало секрецию IL-27 и уровни провоспалительных факторов и повышало выживаемость животных. Применение экзосом, полученных из МСК пуповинной крови человека, приводило к снижению уровней воспалительных факторов и окислительного стресса путем индукции аутофагии in vivo при остром повреждении легких, индуцированном липополисахаридами (ЛПС) [35]. Экзосомы МСК, полученные из ткани КМ, регулируя метаболическое состояние макрофагов посредством ингибирования гликолиза, подавляли поляризацию макрофагов М1, что способствовало поляризации макрофагов М2 в легочной ткани и улучшало состояние легких при ОРДС [36][37].

Таким образом, к настоящему времени накоплен большой массив данных по применению препаратов на основе экзосом для лечения ОРДС, и систематизация этих данных позволит более предметно оценить проблемные вопросы и перспективы их применения.

Цель работы — анализ результатов доклинических и клинических исследований безопасности и эффективности препаратов на основе экзосом, продуцируемых МСК и предназначенных для бесклеточной терапии ОРДС и других заболеваний легких в качестве альтернативы медикаментозному лечению.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Доклинические исследования терапевтического действия экзосом

Анализ результатов экспериментов на животных указал на возможности терапевтического действия экзосом при воспалительных процессах различной этиологии. H. Deng с соавт. [36] продемонстрировали, что МСК костного мозга (КМ), обладая мощными иммуномодулирующими и иммуносупрессивными свойствами вследствие секреции экзосом, улучшали состояние поврежденных сепсисом легких. Экзосомы снижали экспрессию генов, вовлеченных в гликолиз, путем ингибирования фактора транскрипции НIF-1α. Интратрахеальное введение экзосом может быть эффективным способом лечения ЛПС-опосредованного ОРДС [36].

T.J. Morrison с соавт. [37] на модели ЛПС-опосредованного ОРДС у мышей установили, что внеклеточные везикулы из МСК КМ человека способствовали формированию противовоспалительного и высокофагоцитарного фенотипа макрофагов посредством передачи митохондрий. Модуляция функции макрофагов была связана с усилением окислительного фосфорилирования. Альвеолярные макрофаги после взаимодействия с внеклеточными везикулами МСК КМ человека снижали продукцию TNF-α и IL-8 на 58±8% и 30±15% соответственно, что уменьшало повреждение легких in vivo [37].

W. Xu с соавт. [38] установили, что введение экзосом, выделяемых эндотелиальными прогениторными клетками (еndothelial progenitor cell, EPC), оказывало защитное действие на эндотелий капилляров легких и восстанавливало их целостность. Это приводило к уменьшению интерстициального отека и повреждений в легких крыс при ОРДС (гистологические данные). Культуру EPC получали следующим способом: выделенные из КМ мононуклеарные клетки центрифугировали в градиенте плотности. После культивирования в течение 7 сут клетки проявляли фенотип эндотелиальных, что следовало из поглощения ацетилированного липопротеина низкой плотности, связывания эндотелиально-специфического лектина и высокой экспрессии гликопротеина CD31. Эти свойства клеток подтверждали их эндотелиальную природу [38].

A. Monsel с соавт. [39] представили результаты исследования влияния везикул МСК, полученных из КМ человека, на пневмонию у мышей, индуцированную ЛПС Escherichia coli. Внутривенное введение 90 мкл микровезикул МСК через 4 ч после воздействия на мышей ЛПС увеличивало 72-часовую выживаемость животных на 88% благодаря секреции фактора роста кератиноцитов. Терапия приводила также к снижению инфильтрации лейкоцитов на 40%, нейтрофилов — на 53%; снижению общей концентрации белка в бронхоальвеолярном лаваже — на 22% через 24 ч по сравнению с контрольной группой мышей, получавшей фосфатно-солевой буфер (PBS); уменьшению количества клеток воспалительного инфильтрата, цитокинов, белка и бактерий вследствие усиления фагоцитоза [39].

В доклиническом исследовании H. Kaspi с соавт. [40] использовали препарат Exo MSC-NTF (NurOwn®, Израиль). Для получения Exo MSC-NTF клетки МСК КМ инкубировали в среде, содержавшей 1 мМ дб-цАМФ, 20 нг/мл FGF2 человека, 5 нг/мл PDGF человека и 50 нг/мл герегулина β1. На модели ЛПС-индуцированного воспаления легких у мышей терапевтический эффект при внутритрахеальном введении Exo MSC-NTF превосходил действие Exo MSC в снижении проявлений ОРДС. Уровень оксигенации легких повышался на 10%, утолщение альвеолярных стенок — на 43%; количество IL-6 уменьшалось в 7 раз и TNF-α — в 2,3 раза; предотвращалось повреждение легочной ткани. Количество нейтрофилов в легочной ткани снижалось на 26%, накопление фибрина возвращалось к норме [38].

Компанией BrainStorm Cell Therapeutics получен патент⁴ на способ получения экзосом из МСК КМ взрослого человека.

В работе В.А. Ткачука с соавт. [41] отмечено, что на моделях блеомицин-индуцированного фиброза легких у мышей интратрахеальное введение обогащенной внеклеточными везикулами (ВВ) кондиционированной среды МСК (КС-МСК) способствовало разрешению фиброза. Мыши, которым вводили лекарственное средство, демонстрировали улучшение состояния по сравнению с контролем. Для оценки состояния животных использовали балльную систему. Медиана максимального накопленного балла у контрольных животных составляла 7, а у экспериментальных (введение КС-МСК, обогащенной ВВ) — 1, что говорило о более благополучном состоянии мышей, получивших КС-МСК, обогащенную ВВ. В группе профилактики фиброза медиана максимального накопленного балла у контрольных животных составляла 9, а у экспериментальных — 5. Получены данные по эффективности компонентов секретома МСК не только для лечения фиброза легочной ткани, но и его предотвращения, а также для профилактики развития фибротических осложнений интерстициальных пневмоний, в том числе вирусных, включая коронавирусные инфекции [41].

В исследовании S. Shapira с соавт. [42] оценивалась эффективность и безопасность EXO-mCD24 (мышиный гомолог EXO-CD24 человека) при средней и тяжелой степени ОРДС. Эффективность EXO-mCD24 изучалась на моделях воспалительных заболеваний у мышей. В состав препарата входят экзосомы, обогащенные гликопротеином mCD24 (сluster of differentiation 24), который является ключевой молекулой врожденного иммунитета. Получение препарата при трансфекции ExpiFectamine™ 293 / плазмидная ДНК в культуре клеток HEK включало следующие стадии: 1) отбор культуральной жидкости, ее последующее центрифугирование и фильтрацию (размер пор фильтра 0,22 мкм); 2) преципитацию в присутствии 30% полиэтиленгликоля (ПЭГ) и 1,5 М натрия хлорида в течение 15–16 ч и центрифугирование при 4000 об/мин; 3) растворение осадка в физиологическом растворе, диализ в PBS; концентрирование раствора экзосом в PBS на фильтре с размером пор 100 кДа [42].

В работе S. Shapira с соавт. [43] исследовали токсичность, безопасность и терапевтическое действие EXO-mCD24 при ингаляционном пути введения препарата на модели ЛПС-индуцированной сливной пневмонии у мышей. 1×10⁸ и 1×10⁹ экзосом в физиологическом растворе вводили животным 1 раз/сут в течение 5 сут. У животных в контрольной и экспериментальной группах отсутствовали побочные эффекты или различия в поведении. При введении 1×10⁸ экзосом EXO-mCD24 сохранялось повреждение легких средней и тяжелой степени, тогда как введение 1×10⁹ экзосом приводило к выраженному улучшению состояния легких, заметному снижению уровней IL-6 (c 149 до 58 пг/мл), IL-12 (c 17 до 13 пг/мл), TNF-α (c 14 до 7 пг/мл), IFN-γ (c 42 до 11 пг/мл) в образцах сыворотки крови. В бронхоальвеолярном лаваже также наблюдалось снижение маркеров воспаления. Применение EXO-mCD24 продемонстрировало его эффективность и увеличение выживаемости животных по сравнению с контрольной группой: для групп животных, получивших 1×10¹⁰ и 1×10¹¹ экзосом, отношение рисков составило 0,069 (95% ДИ 0,016–0,292) и 0,155 (95% ДИ 0,043–0,555) соответственно [43].

Основные данные по доклиническим испытаниям препаратов экзосом приведены в таблице 1.

Клинические исследования препаратов на основе экзосом

O. Greenс соавт. [44]отмечали, что EXO-CD24 — многообещающее лекарственное средство не только для лечения ОРДС, но и тех многих заболеваний, в отношении которых не эффективны стандартные лекарственные препараты. На нескольких моделях заболеваний у животных (абдоминальный и легочный сепсис, легочный фиброз, астма, ХОБЛ и грипп) была доказана терапевтическая эффективность EXO-CD24 [44][45].

На основании полученных результатов доклинических исследований EXO-CD24 S. Shapira с соавт. [42][43] и O. Green с соавт. [44] предположили, что применение экзосомом, гиперэкспрессирующих CD24, можно экстраполировать на лечение заболеваний у людей. Это обусловило переход к клиническим исследованиям (КИ) безопасности и эффективности препаратов на основе экзосом для лечения ОРДС и других заболеваний. В рандомизированных КИ использовались препараты аллогенных экзосом, полученных из МСК разных тканей человека, которые вводили пациентам со средним или тяжелым течением ОРДС ингаляционно или внутривенно. В качестве плацебо в большинстве КИ использовался физиологический раствор.

S. Shapira с соавт. [42], получив мышиный гомолог CD24 (mCD24), разработали противовоспалительный препарат EXO-CD24 на основе экзосом, обогащенных гликопротеином CD24 — молекул, участвующих в формировании врожденного иммунитета. EXO-CD24 воздействует на гиперактивные клетки иммунной системы при COVID-19, ассоциированном с ОРДС. Показано, что CD24 связан с различными DAMP (молекулярный фрагмент, ассоциированный с повреждением), такими как белок 1 группы высокой подвижности (HMGB1), белки теплового шока и нуклеолины. Вследствие взаимодействия CD24 с SiglecG мыши или Siglec10 человека (sialic acid binding Ig-like lectin) избирательно подавляется реакция организма на повреждение тканей [46][47].

Препараты на основе экзосом для ингаляционного введения

Препарат EXO-CD24

S. Shapira с соавт. [42] провели КИ (фаза Ib/IIa) препарата Exo-CD24 на 35 пациентах со средней и тяжелой формой COVID-19. Возрастающие дозы Exo-CD24 (1×10⁸–1×10⁹ экзосом) вводили ингаляционно в течение 5 сут. Побочных эффектов, связанных с приемом препарата, не наблюдалось в течение 443–575 сут. Препарат эффективно снижал уровни провоспалительных маркеров и цитокинов. Так, уровни MIF3A, IL-17A, IL-1β, IL-6, TGF-α, TNF-α и IL-1α снижались на 4, 7 и 35-е сут наблюдения по сравнению с исходными уровнями (день 0); среднее значение уровня С-реактивного белка в крови составило 127,1±14,7 мг/л (±SEM⁵) в день 0 с дальнейшим его снижением до 66,6±10,4 и 19,3±7,7 мг/л на 3-е и 7-е сут соответственно [42].

I. Grigoropoulos с соавт. (Греция) [48] проведено КИ (фаза IIb) с целью подбора дозы препарата для лечения пациентов с ОРДС средней и тяжелой степени, вызванного COVID-19. Пациенты (n=91) получали 1×10⁹–1×10¹⁰ экзосом EXO-CD24 в течение 5 сут. На 7-е сут оценивались эффективность и безопасность препарата; пациенты оставались под наблюдением в течение 28 сут⁶ [48].

A. Nimrod с соавт. (Израиль) исследовали препарат EXO-CD24 в группе 60 пациентов с ОРДС легкой и средней степени. Препарат экзосом (1×10¹⁰) разводили в 1,5 мл физиологического раствора для ингаляции и вводили с помощью стандартного струйного небулайзера 2 раза/сут в течение 5 сут⁷.

Проведенные КИ (фазы I и II) продемонстрировали отсутствие неблагоприятного воздействия на пациентов. Несмотря на уникальное сочетание экзосом (носитель) и CD24 (иммуномодулятор) в лекарственном препарате для ингаляционного введения, требуются дальнейшие его исследования на более многочисленной когорте пациентов.

Препарат haMSC-Exos (Mexcovid)

Препарат экзосом получали из МСК жировой ткани человека [49]. Клетки 4-го пассажа переносили в другой культуральный сосуд (клеточная фабрика) с плотностью (1–1,5)×10⁴/клеток/см² для получения нужной клеточной массы. По достижении 90% конфлюентности культур полную питательную среду (α-MEM, содержащая лизат тромбоцитов человека) заменяли на питательную среду без экзосом. Полную среду центрифугировали при 120000 g в течение 6 ч. Супернатант использовали в качестве среды, не содержащей экзосомы, для дальнейшего культивирования клеток и выделения экзосом. Супернатант после инкубации в течение 48 ч очищали от клеточного дебриса с помощью дифференциального центрифугирования, инкубировали с 12% ПЭГ в течение 24 ч и далее центрифугировали при 3000 g в течение 60 мин. Осадок суспендировали в PBS и центрифугировали при 120000 g в течение 70 мин [49].

Эффективность и безопасность ингаляционного введения препарата haMSCs-Exos (Mexcovid) в аэрозольной форме изучались в пилотном плацебо-контролируемом одногрупповом КИ (фаза IIa), которое проводили в госпитале Ruijin Hospital (Китай), при лечении пациентов с тяжелым течением COVID-19. Семь пациентов ежедневно получали haMSCs-Exos в дозе 2×10⁸ экзосом в течение 5 сут при ингаляционном введении препарата с помощью небулайзера. Все пациенты переносили лечение без проявления побочных эффектов при сохранении клинической стабильности. Отмечалась различная степень разрешения легочных поражений⁸ [50].

Препарат hMSC-Exos

hMSC-Exos — препарат на основе экзосом, полученных из МСК КМ человека по методике, изложенной Shi M-M. c соавт. [49]. В рандомизированном плацебо-контролируемом КИ (Ruijin Hospital, Китай) изучали терапевтическое действие препарата hMSC-Exos при ингаляционном введении для лечения ОРДС (n=18). Дизайн КИ (фаза I) был следующий: группа низких доз — ингаляции аэрозолем hMSC-Exos по 2×10⁸ экзосом/сут в течение 7 сут, группа средних доз — 8×10⁸ экзосом/сут, группа высоких доз — 16×10⁸ экзосом/сут; фаза II: дозировка 1 — базовое лечение плюс 1/4 от МПД⁹/сут, дозировка 2 — базовое лечение плюс МПД/сут, контроль — базовое лечение плюс введение физиологического раствора¹⁰.

В ГБУЗ «Самарский областной медицинский центр Династия» (г. Самара) провели рандомизированное двойное слепое КИ по изучению безопасности и эффективности аэрозольной ингаляции при двукратном введении в течение 10 сут в дозе (0,5–2)×10¹⁰ экзосом из МСК КМ при лечении пациентов с тяжелым течением пневмонии, ассоциированной с COVID-19¹¹. Ингаляционное введение экзосом призвано ускорить реабилитацию пациентов, уменьшить объем поражений легочной ткани и сократить время пребывания пациентов в стационаре.

Препараты на основе экзосом для внутривенного введения

Препарат Zofin™

Zofin™ (DrugBank ID 16519) — бесклеточный, минимально обработанный препарат, полученный из амниотической жидкости человека; содержит внеклеточные везикулы / наночастицы амниотических стволовых и эпителиальных клеток и более 300 факторов роста, цитокинов и хемокинов. Экзосомы обогащены такими молекулами, как CD63, CD81 и CD9, в дополнение к высокой экспрессии гликопротеина CD133. Цель КИ (фазы I и II) — оценить безопасность и потенциальную эффективность внутривенного введения препарата для лечения средней и тяжелой форм COVID-19 в сравнении с плацебо. Пациенты в экспериментальной группе получали препарат внутривенно по 1 мл в день 0, на 4-е и 8-е сут. Средняя концентрация везикул при их среднем размере 125,2 нм составила 5,24×10¹¹ экзосом/мл. Препарат действует как супрессор активации цитокинов для снижения тяжести COVID-19¹².

В 2021 г. компания Organicell Regenerative Medicine (США) сообщила о положительных результатах первого применения препарата в Индии: у 10 получавших препарат пациентов с COVID-19 достигнута ремиссия (исследование проходило в 4 клиниках). Далее в КИ были включены 65 пациентов со средним и тяжелым течением COVID-19 (лечение было завершено к концу июня 2021 г.). Все пациенты, получившие терапию препаратом, достигли полного выздоровления¹³. В Индийский совет медицинских исследований (Council for Medical Research, ICMR) было подано заявление для получения разрешения на экстренное применение Zofin™ в качестве лекарственного средства для лечения COVID-19.

Препарат ExoFlo™

Препарат ExoFlo™, содержащий экзосомы, полученные из МСК костного мозга, продемонстрировал высокий уровень переносимости при лечении пациентов с ОРДС, ассоциированным с COVID-19. В КИ приняли участие 102 пациента, которые получали инфузии в объеме 100 мл (15 мл препарата и 85 мл физиологического раствора) в течение 60 мин на 1-е и 4-е сут лечения. Пациенты с тяжелой или критической формой COVID-19 получали одновременно стандартное лечение. Установлено, что используемая доза ExoFlo™ была безопасна для пациентов¹⁴ [51].

Компания Direct Biologics (США) сообщила о положительных результатах, полученных в КИ с применением ExoFlo™. V. Sengupta с соавт. [52] изучали безопасность и эффективность экзосом (ExoFlo™), полученных из аллогенных МСК КМ, в нерандомизированном КИ при лечении пациентов с тяжелой формой COVID-19, а также с ОРДС тяжелой и средней степени тяжести. Пациенты получали однократную дозу ExoFlo™ (15 мл) внутривенно с последующим мониторингом их состояния в течение 2 нед. после лечения. После введения ExoFlo™ не было зафиксировано побочных эффектов в течение 72 ч. Выживаемость пациентов составила 83%. Среднее соотношение парциального давления кислорода в артериальной крови к фракции вдыхаемого кислорода (PaO₂/FiO₂) увеличилось на 192% (p<0,001). Среднее снижение количества нейтрофилов крови составило 32% (p<0,001), тогда как количество CD3⁺, CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов увеличилось на 46% (p<0,05), 45% (p<0,05) и 46% (p<0,001) соответственно. Средний уровень С-реактивного белка, ферритина и D-димера снизился на 77% (p<0,001), 43% (p<0,001) и 42% (p<0,05) соответственно [52]. Таким образом, исследуемый препарат благодаря благоприятному профилю безопасности, способности восстанавливать оксигенацию, подавлять цитокиновый шторм и укреплять иммунитет представляет собой перспективное лекарственное средство для лечения тяжелой формы COVID-19.

Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (FDA, США) присвоило препарату статус перспективного лекарственного средства в области регенеративной медицины, а также разрешило проведение КИ фазы III (2023 г.). Учитывая ограниченное количество одобренных лекарственных средств с доказанной эффективностью в снижении смертности, своевременные результаты КИ фазы III будут иметь важное значение для лечения пациентов с ОРДС и в борьбе с заболеваемостью и смертностью, вызванными SARS-CoV-2¹⁵.

Препараты Zofin™ и ExoFlo™ рекомендованы FDA к применению в КИ (табл. 2).

Препарат ARDOXSO

В США проведено КИ безопасности и эффективности препарата для внутривенного введения на основе экзосом, полученных из МСК КМ, для лечения пациентов с ОРДС тяжелой степени. Дизайн КИ был следующий: 4 группы по 5 пациентов: 1 группа — введение возрастающей дозы препарата (2×10⁹, 4×10⁹, 8×10⁹ экзосом) через 1 сут в течение 5 сут; 2 группа — по той же схеме введение 8×10⁹, 4×10⁹, 8×10⁹ экзосом; 3 группа — введение лечебной дозы 8×10⁹, 8×10⁹, 8×10⁹ экзосом; 4 группа — введение плацебо¹⁶. Полученные данные этого пилотного КИ демонстрируют потенциальную клиническую применимость препарата.

Комбинированное лечение

Применение EV-Pure™ и WJ-Pure™

Компанией Vitti Labs получен препарат на основе МСК клеток пуповины VL-P22 (EVPure) и экзосом плацентарного происхождения VL-PX10 (WJPure). Цель КИ (фаза I) — изучение безопасности и преимуществ внутривенного введения WJPure и EVPure при лечении пациентов с COVID-19 и ОРДС средней и тяжелой степени¹⁷. Другое исследование (фаза II) было направлено на оценку преимуществ комбинации EVPure и WJPure у пациентов с COVID-19 с фиброзом легких¹⁸: экспериментальная/лечебная группа (n=10) — введение EVPure и WJPure на фоне стандартного лечения; группа плацебо (n=10) — введение криоконсервирующей среды / физиологического раствора на фоне стандартного лечения. Продолжительность исследования может составить 5 сут (лечение) с последующим периодом наблюдения в течение 12 нед.¹⁹

Совместное применение препаратов экзосом и МСК

Для повышения эффективности лечения ОРДС разрабатываются новые схемы и режимы совместного применения препаратов экзосом и МСК. M. Zarrabi с соавт. [53] представли данные рандомизированного многоцентрового КИ (фаза II) с участием 43 пациентов с COVID-19, ассоциированным с ОРДС: 11 пациентов получили внутривенно две последовательные дозы аллогенных МСК по 100×10⁶; 8 пациентов — МСК по 100×10⁶ плюс экзосомы (выделены из 200×10⁶±10% клеток МСК и вводились ингаляционно); 24 пациента — контрольная группа. Интервал между введением препаратов составлял 48 ч. Показано, что системное введение МСК и ингаляции экзосом при использовании небулайзера были безопасными и значительно снижали уровни маркеров воспаления (IL-6, TNF-α, IFN-γ, CRP) в сыворотке крови пациентов. Смертельные исходы среди пациентов, получивших препараты экзосом и МСК, не наблюдались [53][54].

Основные данные по КИ препаратов на основе экзосом приведены в таблице 2.

В 2022 г. A. Lotfy с соавт. представили данные об использовании экзосом, полученных из разных клеток (костный мозг, жировая ткань, эндометрий и др.) для лечения неврологических (эпилепсия, болезнь Паркинсона, инсульт), аутоиммунных (рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет 1 типа), кардиологических и нефрологических заболеваний [55]. Приведенные ниже примеры применения препаратов на основе экзосом подтверждают, что их функциональное воздействие определяется источником МСК [56]. В экзосомах обнаружено 304 разных белковых молекул, 150 микроРНК и других биоактивных молекул [55], что в совокупности, вероятно, и определяет терапевтический эффект — восстановление различных типов тканей при патологических состояниях сердечно-сосудистой системы, заболеваниях печени, почек, легких и при неврологических расстройствах [57][58]. Препараты экзосом изучались в следующих КИ.

Для лечения сахарного диабета I типа использовались экзосомы, полученные из МСК пуповинной крови. Экзосомы в дозах (1,22–1,51)×10⁶ частиц/кг вводились дважды с интервалом в 1 нед.²⁰

В Исфаханском университете (Иран) проводилось исследование, направленное на выяснение возможностей функционального восстановления после инсульта. В экспериментах на животных было показано, что введение экзосом увеличивает количество нейробластов и эндотелиальных клеток. Экзосомы из МСК КМ вводились стереотаксически интрапаренхимально пациентам с ишемическим инсультом²¹.

В госпитале Ruijin Hospital (Китай) в нерандомизированном КИ применяли MSCs-Exos, выделенные из аллогенных МСК жировой ткани для терапии болезни Альцгеймера легкой и средней степени тяжести. Пациентам в трех группах назначали назальное введение MSCs-Exos в дозах 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг (1 мл) 2 раза/нед. в течение 12 нед.²² [59].

В Египте инициировано исследование препарата на основе экзосом, полученных из МСК жировой ткани, аутогенно выделенной у пациентов; экзосомы предназначены для введения в пародонтальные карманы для оценки их регенеративного эффекта при лечении пародонтита²³.

Проблемные аспекты и перспективы

Препараты на основе экзосом становятся многообещающими бесклеточными терапевтическими средствами, поскольку доказана их высокая эффективность в лечении ОРДС и других заболеваний [60]. Однако не решены проблемы гетерогенности препаратов экзосом и их быстрой элиминации из организма человека [34]. Остается много нерешенных технических вопросов, таких как разработка универсальных легко воспроизводимых протоколов выделения экзосом и очистки их от примесей [61], определение оптимального способа хранения и уточнение эффективных лечебных доз.

Открытие А.Я. Фриденштейном стволовых стромальных клеток и разработка Р.К. Чайлахяном метода их культивирования позволили получать значимое количество этих клеток без изменений их диплоидности и дали возможность применять как сами клетки, так и их секретом в терапевтических целях. Результаты исследований Р.К. Чайлахяна с соавт. [12] указали на неоднородность первичных клеточных клонов, выращенных in vitro из костного мозга; позже это было подтверждено в работах S.A. Kuznetsov с соавт. [62], а также P. Bianco с соавт. [63].

Секретом культур МСК КМ содержит экзосомы, наследующие свойства материнских клеток. Следовательно, пул получаемых экзосом так же неоднороден, как и клеточная культура МСК. Авторы многих научных работ оперируют понятием «экзосомы», получаемые из МСК различных тканей, не приводя характеристик применяемых МСК. Большинство исследований с применением стволовых МСК для лечения ОРДС и осложнений после перенесенного COVID-19 имеет следующие недостатки: а) существующие методы не всегда позволяют получить достаточное количество экзосом для проведения серийных исследований; б) отсутствуют протоколы получения однородного материала (каждая последующая партия экзосом, полученных из МСК, может иметь уже несколько иные характеристики).

Таким образом, необходимо масштабировать выращивание клеток для получения экзосом в лечебных целях и проводить стандартизацию схемы лечения, дозировок, путей и режима введения. Основной целью будущих КИ является изучение долгосрочной безопасности, иммуногенности и эффективности препаратов на основе экзосом для проведения бесклеточной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проанализированы данные о препаратах на основе экзосом, выделенных из культур МСК тканей костного мозга, жировой ткани, пуповины, пуповинной крови, плаценты, и оказывающих терапевтическое действие на регенерацию легочной ткани при ОРДС. В доклинических и клинических исследованиях препараты на основе экзосом вводились как в составе комбинированной терапии, так и монотерапии. Эффективны ингаляционные, внутривенные и сочетанные способы введения препаратов. Требуется стандартизация критериев получения препаратов на основе экзосом, оптимизация эффективности схем их применения и условий долгосрочного хранения.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Все авторы разрабатывали концепцию рукописи, участвовали в написании текста и формулировке выводов.

Благодарности. Выражаем признательность коллегам, высказавшим критические замечания в адрес нашей статьи.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. All the authors conceptualised, drafted the manuscript, and formulated the conclusions.

Acknowlegements. We would like to thank our colleagues for their critical comments on our article.