scFv-фрагменты рекомбинантных антител к вирусу гриппа: получение и характеристика функциональной активности

ВВЕДЕНИЕ. Пассивная иммунотерапия с использованием антител широкого спектра действия является перспективным направлением разработки новых лекарственных средств для борьбы с гриппом. Однако технологии получения, очистки и хранения рекомбинантных антител, пригодных для клинического применения, по-прежнему сопряжены со значительными трудностями. scFv-фрагменты антител (одноцепочечные вариабельные фрагменты) являются более простой, надежной и гибкой альтернативой полноразмерным аналогам антител.

ЦЕЛЬ. Разработка экспрессионных конструкций для синтеза scFv-фрагментов рекомбинантных антител к вирусу гриппа А и В, получение белковых препаратов scFv и оценка их функциональной активности in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Экспрессионные конструкции, кодирующие scFv-фрагменты антител, получали методом ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров и методами генной инженерии. Построение 3D-моделей разработанных scFv-фрагментов проводили по первичной аминокислотной последовательности на сервере AlfaFold. Наработку антител проводили в клеточной линии HEK293 в ходе транзиентной экспрессии. Препараты антител очищали из культуральной жидкости методом металл-аффинной хроматографии. Иммуноферментный анализ (ИФА) использовали для изучения вирус-специфической активности антител. Вируснейтрализующую активность антител изучали на монослойной культуре клеток MDCK по цитопатическому действию и регистрировали в реакции гемаг-глютинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ. На основе рекомбинантных антител, специфичных к вирусу гриппа А и В, был осуществлен дизайн и предсказана пространственная структура scFv-фрагментов, получены три генетические конструкции для экспрессии белков scFv в культуре эукариотических клеток. scFv-фрагменты были наработаны и очищены методом аффинной хроматографии с никелевым сорбентом в количестве не менее 0,5 мг и концентрации около 1 мг/мл каждого. Методом электрофореза белков в полиакриламидном геле было подтверждено соответствие выделенных scFv-фрагментов ожидаемому значению молекулярной массы — около 28 кДа. Методом ИФА было показано специфическое связывание scFv-фрагментов с различными штаммами вируса гриппа А и B. Установлено, что 50% вируснейтрализующая доза scFv-фрагмента антитела к поверхностному гемагглютинину вируса гриппа (170 нг/мл) сопоставима с нейтрализующей дозой для исходного полноразмерного антитела (179 нг/мл).

ВЫВОДЫ. Разработан дизайн и получены scFv-фрагменты двух антител, одного — обладающего широкой нейтрализующей активностью против вируса гриппа A, другого — специфичностью в отношении вируса гриппа В. Благодаря малым размерам scFv-фрагменты могут эффективно проникать через слизистые оболочки при интраназальном введении. Указанное свойство определяет потенциал использования scFv-фрагментов в экстренной профилактике и ранней терапии ОРВИ. Перспективным направлением для усиления нейтрализующей активности является создание биспецифических scFv-фрагментов, способных одновременно нацеливаться на два вирусных эпитопа.

1. Batool S, Chokkakula S, Song MS, et al. Influenza treatment: Limitations of antiviral therapy and advantages of drug combination therapy. Microorganisms. 2023;11(1):183. https://doi.org/10.3390/microorganisms11010183

2. Baumgarth N, Carroll MC, Gonzalez S. Antibody-mediated immunity. In: Webster RG, Monto AS, Braciale TJ, eds. Textbook of influenza. 2nd ed. J. Wiley & Sons; 2013. P. 283–97. https://doi.org/10.1002/9781118636817.ch18

3. Biswas M, Yamazaki T, Chiba J, et al. Broadly neutralizing antibodies for influenza: passive immunotherapy and intranasal vaccination. Vaccines. 2020;8(3):424. https://doi.org/10.3390/vaccines8030424

4. Bates A, Power CA. David vs. Goliath: The structure, function, and clinical prospects of antibody fragments. Antibodies. 2019;8(2):28. https://doi.org/10.3390/antib8020028

5. Ahmad ZA, Yeap SK, Ali AM, et al. scFv antibody: principles and clinical application. Clin Dev Immunol. 2012;2012:980250. https://doi.org/10.1155/2012/980250

6. Glockshuber R, Malia M, Pfitzinger I, Plueckthun A. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments. Biochemistry. 1990;29(6):1362–7. https://doi.org/10.1021/bi00458a002

7. Tiller KE, Tessier PM. Advances in antibody design. Annu Rev Biomed Eng. 2015;17:191–216. https://doi.org/10.1146/annurev-bioeng-071114-040733

8. Potter KN, Li Y, Pascual V, et al. Staphylococcal protein: A binding to VH3 encoded immunoglobulins. Int Rev Immunol. 1997;14(4):291–308. https://doi.org/10.3109/08830189709116521

9. Helfrich W, Haisma H, Magdolen V, et al. A rapid and versatile method for harnessing scFv antibody fragments with various biological effector functions. J Immunol Methods. 2000;237(1–2):131–45. https://doi.org/10.1016/S0022-1759(99)00220-3

10. Urushibata Y, Itoh K, Ohshima M, Seto Y. Generation of Fab fragment-like molecular recognition proteins against staphylococcal enterotoxin B by phage display technology. Clin Vaccine Immunol. 2010;17(11):1708–17. https://doi.org/10.1128/CVI.00229-10

11. Corti D, Voss J, Gamblin SJ, et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science. 2011;333(6044):850–6. https://doi.org/10.1126/science.1205669

12. Aliev TK, Dement`yeva IG, Toropova VA, et al. Development and properties of recombinant proteins based on the broadly neutralizing antibody to influenza A virus. Moscow Univ Biol Sci Bull. 2016;71(2):87–92. https://doi.org/10.3103/S0096392516020012

13. Argentova VV, Aliev TK, Toropova VA, et al. Studies on the influence of different designs of eukaryotic vectors on the expression of recombinant IgA. Moscow Univ Biol Sci Bull. 2017;72(2):63–8. https://doi.org/10.3103/S0096392517020018

14. Zhang P, Vemula SV, Zhao J, et al. A highly sensitive europium nanoparticle-based immunoassay for detection of influenza A/B virus antigen in clinical specimens. J Clin Microbiol. 2014;52(12):4385–7. https://doi.org/10.1128/JCM.02635-14

15. Hilgarth RS, Lanigan TM. Optimization of overlap extension PCR for efficient transgene construction. MethodsX. 2020;7:100759. https://doi.org/10.1016/j.mex.2019.12.001

16. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990;96(1):23–8. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90336-P

17. Abramson J, Adler J, Dunger J, et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 2024;630(8016):493–500. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w

18. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0

19. Candiano G, Bruschi M, Musante L, et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 2004;25(9):1327–33. https://doi.org/10.1002/elps.200305844

20. Killian ML. Hemagglutination assay for influenza virus. In: Spackman E, ed. Animal influenza virus. NY: Springer; 2014. P. 3–9. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0758-8_1

21. Haryadi R, Ho S, Kok YJ, et al. Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells. PLoS One. 2015;10(2):e0116878. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116878

22. Myhrinder G. Optimizing signal peptides for expression of recombinant antibodies in HEK293 cells. Linköpings universitet; 2020.

23. Bryksin A, Matsumura I. Overlap extension PCR cloning. In: Polizzi K, Kontoravdi C, eds. Synthetic biology. Totowa, NJ: Humana Press; 2013. P. 31–42. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-625-2_4

24. Burmester J, Plückthun A. Construction of scFv fragments from hybridoma or spleen cells by PCR assembly. In: Kontermann R, Dübel S, eds. Antibody engineering. Berlin, Heidelberg: Springer; 2001. P. 19–40. https://doi.org/10.1007/978-3-662-04605-0_2

25. Jumper J, Evans R, Pritzel A, et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 2021;596(7873):583–9. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2

26. de Sousa-Pereira P, Woof JM. IgA: structure, function, and developability. Antibodies (Basel). 2019;8(4):57. https://doi.org/10.3390/antib8040057

27. Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and function analysis of an antibody recognizing all influenza A subtypes. Cell. 2016;166(3):596–608. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.073

28. Morgan SB, Holzer B, Hemmink JD, et al. Therapeutic administration of broadly neutralizing FI6 antibody reveals lack of interaction between human IgG1 and pig Fc receptors. Front Immunol. 2018;9:865. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.00865

29. Argentova VV, Aliev TK, Zarubaev VV, et al. In vitro antiviral activity of recombinant antibodies of IgG and IgA isotypes to hemagglutinin of the influenza A virus. Mol Biol. 2017;51(6):804–12. https://doi.org/10.1134/S0026893317060024

30. Bairoch A, Apweiler R, Wu CH, et al. The universal protein resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 2005;33(Suppl_1):D154–9. https://doi.org/10.1093/nar/gki070

31. Li Y, Huo S, Yin Z, et al. Retracted and republished from: “The current state of research on influenza antiviral drug development: drugs in clinical trial and licensed drugs”. mBio. 2024;15(5):e0017524. https://doi.org/10.1128/mbio.00175-24

32. Tsumoto K, Isozaki Y, Yagami H, Tomita M. Future perspectives of therapeutic monoclonal antibodies. Immunotherapy. 2019;11(2):119–27. https://doi.org/10.2217/imt-2018-0130

33. Harkins K. Antibody purification methods. In: Howard GC, Bethell DR, eds. Basic methods in antibody production and characterization. Boca Raton: CRC Press; 2000. P. 141–68. https://doi.org/10.1201/9781420036534.ch11

34. Lu RM, Hwang YC, Liu IJ, et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci. 2020;27(1):1. https://doi.org/10.1186/s12929-019-0592-z

35. Sandomenico A, Sivaccumar JP, Ruvo M. Evolution of Escherichia coli expression system in producing antibody recombinant fragments. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6324. https://doi.org/10.3390/ijms21176324

36. van Rosmalen M, Krom M, Merkx M. Tuning the flexibility of glycine-serine linkers to allow rational design of multidomain proteins. Biochemistry. 2017;56(50):6565–74. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.7b00902

37. Ewert S, Honegger A, Plückthun A. Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. Methods. 2004;34(2):184–99. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2004.04.007

38. Wörn A, Plückthun A. Stability engineering of antibody singlechain Fv fragments. J Mol Biol. 2001;305(5):989–1010. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4265