Комплекс антигенов условно-патогенных бактерий: оценка защитных свойств и токсичности на мышах

ВВЕДЕНИЕ

Проблема антибиотикорезистентности обусловливает поиск альтернативных подходов к профилактике и лечению инфекций [1]. Перспективным направлением является использование препаратов на основе бактериальных антигенов, способных стимулировать как врожденный, так и адаптивный иммунитет. Препараты на основе бактериальных антигенов показали эффективность в лечении и профилактике инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, коррекции иммунодефицитных состояний, а также комбинированном лечении неинфекционных заболеваний [2–8]. Однако для промышленного внедрения таких препаратов требуется оптимизация состава и технологии получения, а также всесторонняя оценка их иммунобиологических свойств.

В качестве основы для создания поликомпонентного препарата в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) были селекционированы штаммы Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Proteus vulgaris и Staphylococcus aureus, характеризующиеся иммуногенностью и низкой вирулентностью [9]. Нами была оптимизирована технология получения антигенов этих штаммов для промышленного применения, включающая процессы управляемого культивирования на жидких питательных средах и мембранной очистки целевых антигенов. Важнейшим этапом фармацевтической разработки является оценка иммунобиологических и токсических свойств получаемых продуктов.

Цель работы — изучение защитных свойств и токсичности антигенов K. pneumoniae, E. coli, P. vulgaris и S. aureus, а также комплекса антигенов в эксперименте на мышах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• изучение токсичности антигенов K. pneumoniae, E. coli, P. vulgaris и S. aureus (в дозах 50, 100 и 200 мкг на мышь) и комплекса антигенов (в дозах от 0,1–0,6 мл на мышь);
• изучение защитных свойств комплекса антигенов при заражении мышей штаммами K. pneumoniae, E. coli, P. vulgaris, S. aureus и P. aeruginosa.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы Klebsiella pneumoniae 204, Escherichia coli F147, Proteus vulgaris 177, Staphylococcus aureus 1986 и Pseudomonas aeruginosa PA103 из УНУ «Коллекция микроорганизмов III и IV групп патогенности ФГБНУ НИИВС им И.И. Мечникова» (Россия).

Антигены. Антигены штаммов K. pneumoniae 204, E. coli F147, P. vulgaris 177, S. aureus 1986 и S. aureus 1991, а также комплекс антигенов получали по технологии, разработанной в лаборатории протективных антигенов ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова. Метод включал реакторное культивирование, микро- и ультрафильтрацию [10]. Полученные антигены лиофильно высушивали, смешивали и добавляли лактозу в качестве стабилизатора. Концентрация каждого антигена (K. pneumoniae, E. coli, P. vulgaris и S. aureus) в 1 мл препарата составляла 500 мкг.

Экспериментальные животные. Исследование токсичности антигенов и их комплекса проводили на белых мышах линии SHK обоего пола, защитные свойства — на самках мышей линии SHK. В экспериментах использовали 485 животных, полученных из филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (Россия). Протокол исследований был одобрен биоэтической комиссией ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (протокол № 12 от 05.11.2024). Все манипуляции с животными соответствовали установленным нормам и правилам проведения научных исследований на лабораторных животных¹. Содержание животных осуществлялось в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.

Методы

Оценка токсичности. Токсичность антигенов K. pneumoniae 204, E. coli F147, P. vulgaris 177, суммарного антигена S. aureus штаммов 1991 и 1986 оценивали на мышах SHK обоего пола весом 18–20 г. Для этого формировали группы по 5 животных, которым вводили внутрибрюшинно по 50, 100 или 200 мкг антигенов в 0,5 мл физиологического раствора и наблюдали за их выживаемостью, изменением массы тела и общим состоянием в течение 7 сут. Токсичность комплекса антигенов изучали при однократном внутрибрюшинном введении в дозах 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мл с последующим наблюдением за состоянием животных в течение 7 сут. Контролем служили животные (n=5), получавшие физиологический раствор.

Антигены и комплекс антигенов считали нетоксичными при условии обратимого снижения массы тела от исходного значения не более чем на 20%, восстановления массы к 7 сут при отсутствии гибели животных².

Оценка защитных свойств. Защитную активность комплекса антигенов изучали на самках мышей линии SHK массой 14–16 г. Животных иммунизировали двукратно с двухнедельным интервалом внутрибрюшинной инъекцией 0,1 мл комплекса антигенов, разведенного в 0,4 мл физиологического раствора (общий объем введения 0,5 мл). В качестве контроля использовали интактных животных.

Через 2 нед. после последней иммунизации мышей заражали внутрибрюшинно живыми вирулентными культурами одного из следующих штаммов: K. pneumoniae 204, E. coli F147, P. vulgaris 177, S. aureus 1986 или P. aeruginosa PA103. Общую концентрацию клеток микроорганизмов определяли в соответствии с ОФС.1.7.2.0008.15³ визуальным методом с использованием стандартного образца мутности (ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России). Штаммы вводили в 5 заражающих дозах (10 животных на дозу). Выживаемость регистрировали в течение 7 сут.

Диапазон заражающих доз для иммунизированных животных в опытной группе составлял: для грамотрицательных микроорганизмов — от 50 до 800 млн микробных клеток (м.к.), для S. aureus 1986 — от 250 млн до 4 млрд м.к. на животное. Диапазон заражающих доз для ин-тактных животных (контроль) составлял: для грамотрицательных микроорганизмов — от 6,25 до 100 млн м.к., для S. aureus 1986 — от 62,5 млн до 1 млрд.

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Office 2016. Статистическую значимость различий между группами оценивали, применяя критерий Манна — Уитни; статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Значение ЛД₅₀ определяли по формуле Кербера (1) в модификации Ашмарина [11]:

(1)

где А — максимальная заражающая доза; B — количество павших животных в группе; С — общее количество животных в группе; цифра в нижнем индексе обозначает номер заражающей дозы (группы).

Доверительный интервал для ЛД₅₀ определяли по формулам (2, 3):

Нижняя граница ЛД₅₀ = 10^{(lgЛД50 + δ×G+)}, (2)

Верхняя граница ЛД₅₀ = 10^{(lgЛД50 + δ×G–)}, (3)

где δ — логарифм кратности разведений; G₊ и G_– — табличные коэффициенты [11].

Индекс эффективности (ИЭ) определяли как отношение значения ЛД₅₀ в группе иммунизированных мышей к значению ЛД₅₀ в группе контроля. Вакцинацию считали эффективной при значении ИЭ выше 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование токсичности антигенов

Инъекция антигенов E. coli и P. vulgaris в дозах 50, 100 и 200 мкг на мышь вызывала обратимое снижение веса в первые дни наблюдения, которое имело дозозависимый характер (табл. 1).

При введении антигена S. aureus во всех исследуемых дозах животные на протяжении эксперимента оставались живы. Динамика набора веса у животных не отличалась от контрольной группы, получавшей физиологический раствор, что свидетельствовало об отсутствии токсичности исследуемых доз антигенов. При введении антигена E. coli в дозах 200 и 100 мкг восстановление массы тела животных наблюдали на 4 сут, при введении 50 мкг — на 2 сут. Иммунизация антигеном P. vulgaris во всех исследуемых дозах вызывала снижение массы тела в течение первых двух суток, после чего значение массы восстанавливалось.

Введение антигена K. pneumoniae в дозе в 200 мкг вызывало потерю массы тела в течение первых 5 сут с максимальным снижением (22%) на 2 сут и привело к гибели одного животного, что указывает на токсичность данной дозы. Иммунизация антигенами K. pneumoniae в дозах 50 и 100 мкг вызывала снижение массы тела на протяжении первых 4 сут, после чего масса тела достигала исходных значений и возрастала на протяжении эксперимента (табл. 1).

Внутрибрюшинное введение комплекса антигенов в дозах 0,1, 0,2, 0,4 мл не вызывало гибели животных. Наблюдали незначительное снижение массы тела на 1–3 сут, после чего прирост массы тела возобновлялся (табл. 2). Максимальное снижение массы тела от исходной (14,7%) у животных, получавших дозу 0,1 мл комплекса антигенов, наблюдали на 1 сут; на 2 и 3 сут потеря массы составляла 10,5 и 3,5% соответственно. При введении 0,4 мл комплекса снижение массы на 1, 2 и 3 сут составляло 16,3, 14,5 и 2,3%. Начиная с 4 сут животные прибавляли в массе тела и к 7 сут масса увеличивалась по сравнению с исходной на 23,3–24,3%.

Введение комплекса в дозе 0,6 мл сопровождалось признаками токсичности: снижение двигательной активности и взъерошенность шерсти (на 1–3 сут после введения), гибель одного животного и снижение массы тела ниже исходного уровня у двух мышей к 7 сут. Максимальная потеря массы (21,5%) зарегистрирована на 2 сут, с положительной динамикой массы тела начиная с 6 сут (табл. 2).

Исследование защитных свойств антигенов

Для оценки защитной активности была выбрана минимальная доза комплекса антигенов (0,1 мл), что снижало риск реактогенности, связанной с двукратным введением липополисахарида грамотрицательных бактерий.

Выявлено, что комплекс антигенов обладал защитными свойствами против заражения штаммами, антигены которых входили в состав комплекса. Значения ИЭ составили: 7,99 при заражении K. pneumoniae 204; 11,56 — E. coli F147; 25,90 — P. vulgaris 177; 7,45 — S. aureus 1986 (р<0,05) (табл. 3).

Важным результатом была демонстрация перекрестной защиты против гетерологичного штамма P. aeruginosa PA103, не входившего в состав комплекса (ИЭ=4,0) (табл. 4).

Таким образом, комплекс антигенов обеспечивал защиту против штаммов патогенов, антигены которых входили в его состав (K. pneumoniae, E. coli, P. vulgaris и S. aureus), а также против штамма P. aeruginosa, антигены которого отсутствовали в комплексе, что может свидетельствовать о широком спектре защитного действия комплекса.

Поливалентные препараты на основе бактериальных антигенов (Бронхо-Ваксом®, Исмиген®, Имудон®, Уро-Ваксом® и др.) [12][13] широко применяются в клинической практике. Их эффективность связана со способностью обеспечивать защиту не только от входящих в их состав условно-патогенных бактерий, но и с активностью в отношении других патогенов, включая неродственные виды бактерий, вирусы и грибы, что подтверждается рядом исследований [14][15].

В настоящем исследовании выявлена защита против заражения P. aeruginosa, которая может быть как следствием активации неспецифического иммунитета в ответ на введение в организм животного чужеродных агентов, так и свидетельствовать о перекрестной активности компонентов комплекса. Для уточнения механизмов защиты и выявления спектра защитного действия комплекса необходимы дальнейшие исследования и оценка его эффективности на других моделях.

ВЫВОДЫ

1. Установлен приемлемый токсикологический профиль исследованных антигенов K. pneumoniae 204, E. coli F147, P. vulgaris 177, суммарного антигена S. aureus 1986 и S. aureus 1991, а также комплекса антигенов. Комплекс антигенов в диапазоне доз 0,1–0,4 мл вызывал обратимое снижение массы тела мышей, которое не превышало 20%.
2. Продемонстрированы защитные свойства комплекса антигенов K. pneumoniae, E. coli, P. vulgaris и S. aureus в отношении живых культур, из которых выделены антигены, а также гетерологичного штамма P. aeruginosa.
3. Исследованные антигены и их комплекс могут рассматриваться как основа для создания лекарственного средства для профилактики широкого круга инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.В. Солдатенкова — разработка дизайна и концепции экспериментального исследования, получение антигенов условно-патогенных бактерий и комплексного антигена, иммунизации животных, сбор и анализ результатов, обобщение данных литературы, применение статистических методов для обработки данных, написание, редактирование, оформление текста рукописи; Н.Г. Сидоров — получение антигенов условно-патогенных бактерий и комплексного антигена, сбор и анализ результатов, обобщение данных литературы, применение статистических методов для обработки данных, редактирование, оформление текста рукописи; С.А. Лазарев — получение антигенов условно-патогенных бактерий и комплексного антигена, анализ данных; А.П. Жеребцов — получение антигенов условно-патогенных бактерий и комплексного антигена, иммунизация животных; Н.А. Михайлова — разработка дизайна и концепции экспериментального исследования (формулирование идеи, исследовательских целей и задач), критический пересмотр содержания текста рукописи; утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования одобрен биоэтической комиссией ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (протокол № 02 от 02.04.2025).

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. A.V. Soldatenkova developed design and concept of the experimental study, obtained antigens of opportunistic bacteria and the complex antigen, immunised the animals, collected and analysed the results, analysed and integrated literature data, applied statistical methods for data analysis, drafted, edited, and formatted the manuscript. N.G. Sidorov obtained antigens of opportunistic bacteria and the complex antigen, collected and analysed the results, analysed and integrated literature data, applied statistical methods for data analysis, edited and formatted the manuscript. S.A. Lazarev obtained antigens of opportunistic bacteria and the complex antigen and analysed the data; A.P. Zherebtsov obtained antigens of opportunistic bacteria and the complex antigen, and immunised the animals. N.A. Mikhailova developed the design and concept of the experimental study (idea, research goals, and objectives), revised the manuscript content, and finally approved the article for publication.

Ethics approval. The study was approved by the Bioethics Commission of I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Meeting Minutes No. 02 of 02.04.2025).