Проблемы генотипирования микроорганизмов

Успешность генотипирования микроорганизмов зависит от разрешающей способности метода, которая в свою очередь зависит от выбора наиболее информативного участка генома, используемых ферментов и праймеров, а также условий рестрикции генома и ПЦР амплификации. Методы анализа быстро эволюционирующих маркеров, для методов MST, MLVA, DGE, HRM, обычно, обладают большей дифференцирующей способностью, чем те, которые опираются на слабо эволюционирующие маркеры (метод MLST). Степень разрешения выше у методов типирования, зависящих от предварительной информации о ДНК матрице (PFGE, AFLP, RFLP, ДНК микрочипы), по сравнению с методами, в которых аналитические мишени ограничиваются определенными локусами (риботипирование, RFLP-PCR). Мониторинг локальных вспышек эпидемий может осуществляться при использовании быстро эволюционирующих маркеров такими методами, как RAPD-PCR, MST, или MLVA, DGE, HRM. Для длительных эпидемиологических наблюдений или популяционных исследований более пригодны маркеры консервативных участков и стабильно воспроизводимые методы (MLST, PFGE, риботипирование), а также секвенированиие полноразмерного генома. Для генотипирования микроорганизмов из полимикробных образцов целесообразно использование методов, специфичных к искомой матрице (PCR-RFLP, MLVA, DGE, HRM, MLST, MST, ДНК микрочипы). При установлении вида для полимикробных образцов оптимальным решением является изучение метагенома: совокупности генома определенного экологического сообщества бактерий. В этом случае предпочтительным является анализ высоко консервативных последовательностей ДНК, подобно гену 16S рРНК. Успехи генотипирования бактериальных штаммов позволяют исследовать взаимосвязь между генотипом и фенотипом путем филогенетического анализа генетических дистанций между штаммами в нескольких поколениях, что важно для характеристик, значимых с точки зрения эпидемиологии (вирулентностью, устойчивостью к антибиотикам и другими). Разработаны компьютизированные методы соотнесения фенотипических профилей с отсеквенированными последовательностями генома. Полногеномное секвенирование является оптимальной методикой типирования штаммов, однако высокая стоимость и необходимость использования достаточно большого количества очищенной ДНК матрицы пока ограничивает его применение.

генотипирование, микроорганизмы, молекулярно-генетические методы, genotyping, microorganisms, molecular-genetic methods

1. Yang Y, Wang J, Wen H, Liu H. Comparison of two suspension arrays for simultaneous detection of five biothreat bacterial in powder samples. J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 831052. doi: 10.1155/2012/831052.

2. Бондарева ОС, Савченко СС, Ткаченко ГА, Абуева АИ, Муратова ЮО, Антонов ВА. Современные подходы к генотипированию возбудителей особо опасных инфекций. Эпидемиология и инфекционные болезни 2014; (1): 34-44.

3. Сколотнева ЕС, Волкова РА, Эльберт ЕВ, Миронов АН, Меркулов ВА, Бондарев ВП, Борисевич ИВ. Методы генотипирования бактерий: фрагментный анализ. Биопрепараты 2014; (2): 13-21.

4. Волкова РА, Сколотнева ЕС, Эльберт ЕВ, Мыца ЕД, Миронов АН, Меркулов ВА, Бондарев ВП, Борисевич ИВ. Прямые и косвенные методы определения нуклеотидного состава ДНК последовательностей микроорганизмов. Биопрепараты 2015; (2): 9-16.

5. Power EG. RAPD typing in microbiology - a technical review. J Hosp Infect. 1996; 34: 247-65.

6. Rezk NA, Mansour H, Ghoneim NH, Rifaat MM. Typing of Salmonella typhi strains isolated from Egypt by RAPD PCR. Biothech. 2012; 2(1): 17-25.

7. Fournier PE, Zhu Y, Ogata H, Raoult D. Use of highly variable intergenetic spacer sequences for multispacer typing of Rickettsia conorii strains. J Clin Microbiol. 2004; 42: 5757-66.

8. Li W, Chomel BB, Maruyama S, Guptil L, Sander A, Raoult D, et al. Multispacer typing to study the genotypic distribution of Bartonella henselae populations. J Clin Microbiol. 2006; 44: 2499-506.

9. van Belkum A, Scherer S, Verbrugh H. Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes. Microbiol Mol Biol R. 1998; 62: 275-93.

10. Li W, Raoult D, Fournier P. Bacterial strain typing in the genomic era. FEMS Microbiology Rev. 2009; 33(5): 892-916.

11. Cooper JE, Feil EJ. Multilocus sequence typing - what is resolved? Trends Microbiol. 2004; 12: 373-7.

12. Сухих ГТ, Павлова ГВ, Рысков АП, Бутовская ПР, Мартиросян ИА. Способ контроля за генетической изменчивостью в культуре животных клеток различной длительности пассирования. Патент Российской Федерации, № 2392330 С2; 2006.

13. Kellenberger E. Exploring the unknown. The silent revolution of microbiology. EMBO Rep. 2001; (2): 5-7.

14. Rappe MS, Giovannoni SJ. The uncultured microbial majority. Annu Rev Microbiol. 2003; 57: 369-94.

15. Sabat AJ, Budimir A, Nashev D, Sá-Leão R, van Dijl JM, Laurent F, et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance. Euro Surveill. 2013; 18(4): 20380.

16. Aguiar-Alves F, Medeiros F, Fernandes O, Pereira RM, Perdreau-Remington F, Riley L. New Staphylococcus aureus genotyping method based on exotoxin (set) genes. J Clin Microbiol. 2006; 44: 2728-32.

17. Miya S, Kimura B, Sato M, Takahashi H, Ishikawa T, Suda T, et al. Development of a multilocus variable-number of tandem repeat typing method for Listeria monocytogenes serotype 4b strains. Int J Food Microbiol. 2008; 124(3): 239-49.

18. Chuang Y, Wang J, Chen M, Chen YC. Comparison of an automated repetitive-sequence-based PCR microbial typing system with pulsed-field gel electrophoresis for molecular typing of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J Clin Microbiol. 2010; 48: 2897-901.

19. Souza RA, Falcão JP. A novel high-resolution melting analysis-based method for Yersinia pseudotuberculosis genotyping. J Microbiol Meth. 2012; 91(3): 329-35.

20. Knight R, Jansson J, Field D, Fierer N, Desai N, Fuhrman JA, et al. Unlocking the potential of metagenomics through replicated experimental design. Nature Biotechnology 2012; 30: 513-20.

21. Antonov AV, Mewes HW. Complex phylogenetic profiling reveals fundamental genotype-phenotype associations. Comput Biol Chem. 2008; 32: 412-6.

22. Benfey PN, Mitchell-Olds T. From genotype to phenotype: systems biology meets natural variation. Science. 2008; 320: 495-7.

23. Harris SR, Cartwright EJP, Török ME, et al. Whole-genome sequencing for analysis of an outbreak of meticillin-resistant Staphylococcus aureus: a descriptive study. Lancet Infect Dis. 2013; 13(2): 130-6.

24. Тотолян АА. Современные подходы и технологии в инфекционной эпидемиологии (на примере инфекций, вызываемых патогенными стрептококками). Журнал инфектологии 2012; 4(3): 88-100.

25. Kīser CU, Ellington MJ, Cartwright EJP, Gillespie SH, Brown NM, Farrington M, et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathogen 2012; 8(8): 1-9.

26. Алексеева АЕ, Бруснигина НФ. Возможности и перспективы применения методов массивного параллельного секвенирования в диагностике и эпидемиологическом надзоре за инфекционными заболеваниями (аналитический обзор). Медиаль 2014; 2(12): 1-28.

27. Pareek CS, Smoczynski R, Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. J Appl Genetics. 2011; 52(4): 413-35.