Разработка клеточных линий-продуцентов рекомбинантных терапевтических белков на примере деносумаба

ВВЕДЕНИЕ. При создании биотехнологических лекарственных препаратов ключевое значение имеет разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков. Отработка протоколов селекции и подходов для эффективного скрининга линий-продуцентов целевых белков — необходимый этап разработки технологии производства рекомбинантных белков с высоким выходом целевого продукта.

ЦЕЛЬ. Получение высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного белка деносумаба на основе суспензионной клеточной линии СНО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Использовалась суспензионная клеточная линия СНО-К1. Для культивирования применялись среды и подпитки без использования сыворотки или других компонентов животного происхождения. Клетки линии СНО трансфицировали плазмидами, содержащими гены легкой и тяжелой цепей деносумаба, с использованием метода электропорации с помощью системы MaxCyte STX. Селекцию трансфицированных клеток проводили с добавлением антибиотиков (гигромицин, генетицин). Моноклональные клеточные линии получали с использованием системы ClonePix FL. Проводили периодическое культивирование с добавлением подпитки и определение концентрации деносумаба методом иммуноферментного анализа (ИФА) в культуральной жидкости для выявления лидерных моноклональных клеточных линий.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Оптимальная концентрация антибиотиков для селекции клеточных линий-продуцентов на основе клеток СНО составила 600 мг/л гигромицина и 600 мг/л генетицина. После проведения трансфекции из 1920 минипулов селекцию прошел 1041 (около 54%). Отбор минипулов-продуцентов деносумаба проводили путем скрининга проб культуральной жидкости с использованием ИФА из 96-, 24- и 6-луночных планшетов. Отобранные 23 лидерных минипула были адаптированы к условиям шейкерного культивирования. С учетом показателей ростовых и продукционных характеристик минипулов определен лидерный минипул (mp-19) с продуктивностью 1,92 г/л (на 7 сут периодического культивирования). На основе mp-19 получены моноклональные клеточные линии-продуценты деносумаба с продуктивностью до 6,5 г/л на 9 сут культивирования с подпиткой.

ВЫВОДЫ. Получены высокопродуктивные моноклональные клеточные линии-продуценты деносумаба. Предложенный подход к созданию клеток-продуцентов может быть применен для получения различных рекомбинантных белков, включая моноклональные антитела, ферменты, факторы свертывания крови.

1. Zhu MM, Mollet M, Hubert RS, Kyung YS, Zhang GG. Industrial production of therapeutic proteins: Cell lines, cell culture, and purification. Handbook of Industrial Chemistry and Biotechnology. 2017;(3):1639–69. https://doi.org/10.1007/978-3-319-52287-6_29

2. Yang Y, Li Z, Li Q, Ma K, Lin Y, Feng H, Wang T. Increase recombinant antibody yields through optimizing vector design and production process in CHO cells. Appl Microbiol Biotechnol. 2022;106(13–16):4963–75. https://doi.org/10.1007/s00253-022-12051-5

3. Fischer S, Handrick R, Otte K. The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives. Biotechnol Adv. 2015;33(8):1878–96. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.10.015

4. Zhu J. Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production. Biotechnol Adv. 2012;30(5):1158–70. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2011.08.022

5. Thombre S, Gadgil M. Increase in efficiency of media utilization for recombinant protein production in Chinese hamster ovary culture through dilution. Biotechnol Appl Biochem. 2011;58(1):25–31. https://doi.org/10.1002/bab.9

6. Pal D, Patel G, Dobariya P, Nile SH, Pande AH, Banerjee UC. Optimization of medium composition to increase the expression of recombinant human interferon-β using the Plackett–Burman and central composite design in E. coli SE1. 3 Biotech. 2021;11(5):226. https://doi.org/10.1007/s13205-021-02772-1

7. Li W, Fan Z, Lin Y, Wang T-Y. Serum-free medium for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary cells front. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:646363. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.646363

8. Almo SC, Love JD. Better and faster: Improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 2014;26:39–43. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2014.03.006

9. Schellenberg J, Nagraik T, Wohlenberg OJ, Ruhl S, Bahnemann J, Scheper T, Solle D. Stress-induced increase of monoclonal antibody production in CHO cells. Eng Life Sci. 2022;22(5):427–36. https://doi.org/10.1002/elsc.202100062

10. Zhu X, Zhang K, Luo H, Wu J. Overexpression of the class A penicillin-binding protein PonA in Bacillus improves recombinant protein production. Bioresour Technol. 2023;383:129219. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.129219

11. Тимонова СС, Смолова КА, Зарипова ДТ, Пантюшенко МС, Королева МА, Анисимов РЛ и др. Увеличение продуктивности клеточной линии-продуцента арилсульфатазы B за счет коэкспрессии формилглицин-генерирующего фермента. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(1):80–93. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-1-80-93

12. Lu J, Hu D, Zhang Y, Ma C, Shen L, Shuai B. Current comprehensive understanding of denosumab (the RANKL neutralizing antibody) in the treatment of bone metastasis of malignant tumors, including pharmacological mechanism and clinical trials. Front Oncol. 2023;13:1133828. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1133828

13. Di Lorenzo L. Denosumab in elderly osteoporotic patients. A narrative review. Clin Ter. 2023;174(6):545–9. https://doi.org/10.7417/CT.2023.5023

14. Abduelkarem AR, Guella A, Hamrouni AM, Hassanein MM, Nasr A, Rana O. Denosumab use in chronic kidney disease associated osteoporosis: A narrative review. Risk Manag Healthc Policy. 2023;16:1809–13. https://doi.org/10.2147/RMHP.S426869

15. Tan X, Zhang Y, Wei D, Yang Y, Xiang F. Denosumab for giant cell tumors of bone from 2010 to 2022: A bibliometric analysis. Clin Exp Med. 2023;23(7):3053–75. https://doi.org/10.1007/s10238-023-01079-0

16. Imre A, Zoltán S, Miklós S. Current indications for denosumab in benign bone tumours. EFORT Open Rev. 2023;8(12):895–905. https://doi.org/10.1530/EOR-23-0138

17. Тимонова СС, Пантюшенко МС, Тихонов РВ, Пискунов АА, Бадэ ВН. Оптимизация процесса культивирования клона-продуцента рекомбинантного лизосомального фермента идуронат-2-сульфатазы. Биотехнология. 2021;37(2):34–47. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-2-34-47

18. Тимонова СС, Павелко ВИ, Кирик ИА, Бадэ ВН, Малыгина ТО, Хамитов РА, Пискунов АА. Принцип оперативного выбора лидерных клонов-продуцентов моноклональных антител при создании стабильных клеточных линий на основе СНО. Биотехнология. 2019;35(4):65–72. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2019-35-4-65-72

19. Tihanyi B, Nyitray L. Recent advances in CHO cell line development for recombinant protein production. Drug Discov Today Technol. 2020;38:25–34. https://doi.org/10.1016/j.ddtec.2021.02.003

20. Lewis NE, Liu X, Li Y, Nagarajan H, Yerganian G, O’Brien E. Genomic landscapes of Chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome. Nat Biotechnol. 2013;31(8):759–65. https://doi.org/10.1038/nbt.2624

21. Huang YM, Hu W, Rustandi E, Chang K, Yusuf-Makagiansar H, Ryll T. Maximizing productivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically defined media conditions and typical manufacturing equipment. Biotechnol Prog. 2010;26(5):1400–10. https://doi.org/10.1002/btpr.436

22. Lai T, Yang Y, Ng SK. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 2013;6(5):579–603. https://doi.org/10.3390/ph6050579

23. Kim JY, Kim YG, Lee GM. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: Current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;93(3):917–30. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3758-5

24. El Maï N, Donadio-Andréi S, Iss C, Calabro V, Ronin C. Engineering a human-like glycosylation to produce therapeutic glycoproteins based on 6-linked sialylation in CHO cells. Methods Mol Biol. 2013;988:19–29. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-327-5_2

25. Boeger H, Bushnell DA, Davis R, Griesenbeck J, Lorch Y, Strattan JS, et al. Structural basis of eukaryotic gene transcription. FEBS Lett. 2005;579(4):899–903. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2004.11.027

26. Bandaranayake A.D, Almo SC. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 2014;588(2):253–260. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2013.11.035

27. Xu X, Nagarajan H, Lewis NE, Pan S, Cai Z, Liu X, et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nat Biotechnol. 2011;29(8):735–41. https://doi.org/10.1038/nbt.1932

28. Li F, Vijayasankaran N, Shen AY, Kiss R, Amanullah A. Cell culture processes for monoclonal antibody production. MAbs. 2010;2(5):466–79. https://doi.org/10.4161/mabs.2.5.12720

29. Dumont J, Euwart D, Mei B, Estes S, Kshirsagar R. Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: History, status, and future perspectives. Crit Rev Biotechnol. 2016;36(6):1110–22. https://doi.org/10.3109/07388551.2015.1084266

30. Liu L. Antibody glycosylation and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. J Pharm Sci. 2015;104(6):1866–84. https://doi.org/10.1002/jps.24444

31. Sommer JM, Buyue Y, Bardan S, Peters RT, Jiang H, Kamphaus GD, et al. Comparative field study: impact of laboratory assay variability on the assessment of recombinant factor IX Fc fusion protein (rFIXFc) activity. Thromb Haemost. 2014;112(5):932–40. https://doi.org/10.1160/TH13-11-0971

32. Butler M, Spearman M. The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering. Curr Opin Biotechnol. 2014;30:107–12. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2014.06.010

33. Maksimenko O, Gasanov NB, Georgiev P. Regulatory elements in vectors for efficient generation of cell lines producing target proteins. Acta Naturae. 2015;7(3):15–26. https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-3-15-26

34. Csató-Kovács E, Salamon P, Fikó-Lászlo S, Kovács K, Koka A, András-Korodi M, et al. Development of a mammalian cell line for stable production of anti-PD-1. Antibodies (Basel). 2024;13(4):82. https://doi.org/10.3390/antib13040082

35. Grav LM, Rojek JB, la Cour Karottki KJ, Lee JS, Kildegaard HF. Application of CRISPR/Cas9 genome editing to improve recombinant protein production in CHO cells. Methods Mol Biol. 2025;2853:49–69. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-4104-0_5

36. Chong ZX, Yeap SK, Ho WY. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 2021;9:e11165. https://doi.org/10.7717/peerj.11165

37. Welch JT, Arden NS. Considering “clonality”: A regulatory perspective on the importance of the clonal derivation of mammalian cell banks in biopharmaceutical development. Biologicals. 2019;62:16–21. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2019.09.006

38. Тимонова СС, Павелко ВИ, Кирик ИА, Бадэ ВН, Пискунов АА, Хамитов РА. Метод Монте-Карло для вычисления вероятности моноклональности клеточных линий. Биотехнология. 2024;40(1):100–8. https://doi.org/10.56304/S0234275824010113

39. Goldrick S, Alosert H, Lovelady C, Bond NJ, Senussi T, Hatton D, et al. Next-generation cell line selection methodology leveraging data lakes, natural language generation and advanced data analytics. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1160223. https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1160223