Разработка высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков представляет собой ключевой этап создания биотехнологических лекарственных препаратов [1]. Для достижения высокой экспрессии рекомбинантных белков применяют различные подходы.

Для стабильной интеграции чужеродной ДНК в геном клетки-хозяина необходимо подобрать оптимальный экспрессионный вектор и включить дополнительные генетические элементы, такие как системы селекции, механизмы амплификации генов, участки, обеспечивающие транскрипционную активность, а также гены, регулирующие пролиферацию (например, bcl-2, xiap, aven, mcl-1) [2][3].

Выбор клеточной линии является важным звеном в разработке биотехнологического препарата. Большинство продуктов производятся с использованием эукариотических клеточных линий: клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки мышиной миеломы (NS0 и Sp2/0-Ag14), клетки эмбриональной почки человека (HEK 293), клетки почки сирийского хомячка (BHK). Выбор клеток эукариотического происхождения обусловлен их способностью синтезировать белки, которые по своей структуре и биохимическим свойствам близки белкам, встречающимся в организме человека [4].

Для крупномасштабного коммерческого производства требуются клеточные линии, способные достигать высоких концентраций жизнеспособных клеток (viable cell density, VCD), что обеспечивает высокую производительность процесса. Важную роль играет оптимизация ростовых сред и подпиток для конкретных клеток-продуцентов, позволяющая значительно повысить выход продукта [5–7]. Применение ростовых сред и добавок определенного химического состава (без использования белков животного происхождения) дает возможность регулировать целевой профиль продукта, включая состав гликанов, биологическую активность и др. Оптимизация условий культивирования клеток-продуцентов по различным параметрам (продолжительность, температурный режим, подача газов, контроль рН и др.) имеет ключевое значение [8][9]. Коэкспрессия дополнительных белков/ферментов может способствовать улучшению выхода целевого продукта [10][11].

Авторами данной статьи рассматривается реализация подхода, направленного на создание высокопроизводительных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных терапевтических белков на примере деносумаба, разрабатываемого в АО «ГЕНЕРИУМ».

Деносумаб представляет собой человеческое моноклональное антитело класса IgG2, специфичное к цитокину RANKL — фактору дифференцировки и активации остеокластов. Ингибирование RANKL подавляет процессы созревания и выживаемости остеокластов, тем самым снижая интенсивность резорбции кости [12]. В настоящее время доступны коммерческие препараты на основе деносумаба, одобренные для лечения постменопаузного остеопороза [13][14] и лечения опухолевых заболеваний (миелома, метастазы в кости, нерезектабельная гигантоклеточная опухоль кости, доброкачественные опухоли кости) [15][16]. Проводятся доклинические и клинические исследования с применением биоаналогов оригинального препарата деносумаба1. Получение российского биоаналога деносумаба повысит доступность препарата для пациентов в Российской Федерации, что будет в целом способствовать реализации государственной политики в сфере развития фармацевтической промышленности.

Цель работы — получение высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов рекомбинантного белка деносумаба на основе суспензионной клеточной линии СНО.

Линия клеток СНО-К1 (Н-188) получена из коллекции клеточных культур НИЦ «Курчатовский институт», ГосНИИгенетика, Россия (далее — линия CHO) и адаптирована к суспензионному культивированию без использования сыворотки и любых других компонентов животного происхождения. В работе использовали следующие реактивы: среда для культивирования BalanCD CHO Growh A (BCD) (Fujifilm, Irvine Scientific, США); подпитка BalanCD CHO Feed 4 (Fujifilm, Irvine Scientific, США); полутвердая среда для клонирования ClonaCell Flex (Stemcell, Канада); буфер для электропорации (MaxCyte, CША); фосфатно-солевой буфер, PBS («ЭкоСервис», Россия); Твин 20 (Panreac AppliChem, Испания); контрольный (референтный) препарат деносумаба (Пролиа, Амджен Европа Б.В., Нидерланды); альбумин (Sigma-Aldrich, Япония); козьи поликлональные антитела против IgG человека (Sigma, Япония); козьи поликлональные антитела против IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, Япония); 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Transgen Biotech, Китай); диметилсульфоксид (Sterile Filtered, Cell Culture Tested, CDH, Индия).

Получение экспрессионных векторов. Синтетические кодон-оптимизированные последовательности генов легкой и тяжелой цепей деносумаба клонировали в экспрессионный вектор с селективным маркером. Полученные плазмиды с генами легкой цепи (pGNR-FAB) и тяжелой цепи (pGNR-FC) в дальнейшем использовали для проведения трансфекции. Экспрессия генов находилась под контролем гибридного CMVe/EF1alpha-промотора. Схема вектора аналогична ранее описанной авторами [11].

Суспензионное культивирование клеток CHO. Посевная концентрация жизнеспособных клеток СНО составляла 0,5×10⁶ клеток/мл. Клетки культивировали в среде BalanCD CHO Growth A при 37 °С и 5% CO2 c поддержанием постоянной влажности не менее 75% и скоростью перемешивания 100 об/мин с помощью шейкера-инкубатора (Infors HT, Multitron, США).

Определение ростовых и продукционных характеристик культуры клеток-продуцентов. Показатель VCD определяли с использованием 0,1% раствора трипанового синего на автоматическом счетчике клеток Countess II FL (Life Technologies, США). Показатели кумулятивной клеточной плотности (cumulative cell density, ССD) и продуктивности вычисляли по формулам, представленным в работах авторов [17][18].

Трансфекция клеток СНО методом электропорации. Трансфекцию проводили с помощью оборудования для электропорации и кюветы ОС-100 (MaxCyte, CША) с использованием протокола СНО. Клетки осаждали центрифугированием, после чего осадок ресуспендировали в буфере для электропорации. Далее суспензию клеток смешивали с плазмидной ДНК легкой и тяжелой цепей (pGNR-FAB и pGNR-FC) в эквимолярном соотношении. В случае отрицательного контроля проводили электропорацию в тех же условиях без добавления плазмидной ДНК.

Получение минипулов. Трансфицированные клетки СНО высевали в плоскодонные 96-луночные планшеты (Greiner Bio-One, Австрия) по 50 мкл в ростовой среде BCD c селективными антибиотиками и культивировали при 37 °С, 5% СO2 и 70% влажности. Затем проводили анализ культуральной жидкости (КЖ) из лунок с минипулами, прошедшими селекцию, методом иммуноферментного анализа (ИФА). Минипулы с наиболее высокой продуктивностью переносили в 24- и 6-луночные планшеты (Greiner Bio-One, Австрия), а затем — в колбы Эрленмейера (Corning, США) с последующей адаптацией к росту в суспензии при постоянном перемешивании.

Получение клонов в полутвердой среде. Клетки лидерного минипула-продуцента высевали в 6-луночные планшеты (Greiner Bio-One, Австрия) в полутвердой среде ClonaCell Flex и инкубировали в стационарных условиях при 37 °С, 5% СO2 в CO2-инкубаторе (Sanyo, Япония) до момента появления колоний. Отбор клонов проводили с помощью роботизированной системы ClonePix FL (Molecular Devices, США).

Периодическое культивирование. Культивирование продуцентов проводили в среде BCD в минибиореакторах TubeSpin Bioreactor (TPP Techno Plastic Products AG, Швейцария) с посевной концентрацией клеток 0,5×10⁶ клеток/мл. В качестве подпитки использовали BalanCD CHO Feed 4. Условия культивирования: содержание СО2 — 5%, влажность — не менее 70%, температурный режим — 37 °С, скорость перемешивания — 100 об/мин. Отбор проб КЖ и подсчет показателей VCD и оценку жизнеспособности проводили каждый день начиная с 3–4 сут культивирования.

Иммуноферментный анализ. Сорбцию проводили в планшетах MaxiSorb (Nunc, Дания) с использованием козьих поликлональных антител против IgG человека в концентрации 4 мкг/мл (карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,4) при 37 °С в течение 1 ч. Далее лунки промывали PBS с добавлением Твин 20 (PBS-T) и проводили блокировку раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS-T (PBS-Ta, Sigma-Aldrich, Япония). Исследуемые образцы, содержащие деносумаб, и контрольный образец (деносумаб, Пролиа) инкубировали 1 ч при 37 °С на орбитальном термостатируемом шейкере ELMI ST-3L (Elmi, Латвия) при скорости 300 об/мин. После промывания лунок PBS-T добавляли детектирующие козьи поликлональные антитела против IgG человека, конъюгированные c пероксидазой хрена, в концентрации 1 мкг/мл в PBS-Ta и инкубировали 1 ч при 37 °С на шейкере ELMI ST-3L при 300 об/мин. Далее лунки промывали PBS-Т и добавляли раствор тетраметилбензидина (50 мкл). Для остановки реакции использовали раствор серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм (OD450) с помощью спектрофотометра Benchmark Plus (Bio-Rad, Германия).

Криоконсервация клеточных культур. Для крио-консервации культур клеток (в логарифмической фазе роста) использовали ростовую среду без антибиотика, содержащую 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в ампуле составляла 5–10 млн клеток/мл. После медленного охлаждения ампул с клетками в морозильнике при температуре минус 80 °C в контейнерах для замораживания (Mr. Frosty, Thermo Scientific) ампулы помещали в пары жидкого азота.

На рисунке 1 представлена схема получения промышленного клона-продуцента терапевтического рекомбинантного белка (на примере деносумаба) на основе клеточной линии СНО, в которой выделяют следующие этапы:

Процесс подбора концентрации антибиотиков генетицина и гигромицина для селекции клеток СНО представлен на рисунке S1 (опубликован на сайте журнала2). Показано, что оптимальными концентрациями антибиотиков для проведения селекции клеток-продуцентов деносумаба являются 600 мг/л гигромицина и 600 мг/л генетицина. При этих концентрациях жизнеспособность клеток снижалась до нулевых значений на 7 сут культивирования.

Трансфекция клеток линии CHO. После проведения трансфекции клеток СНО определяли показатель VCD и жизнеспособность трансфицированных клеток (табл. 1) через 24 и 48 ч для контроля выживаемости клеток. Через 48 ч после трансфекции клетки восстановили свою жизнеспособность, достигнув уровня около 90%.

Получение минипулов-продуцентов. Трансфицированный пул клеток рассевали на минипулы в среде с селективным агентом в 96-луночные планшеты (всего 20 планшетов). Инкубирование проводили в стационарных условиях в СО2-инкубаторе до достижения 70–90% конфлюэнтного монослоя в ростовой среде BCD с селективными антибиотиками (600 мг/л гигромицина и 600 мг/л генетицина), оптимальная концентрация которых была подобрана заранее (рис. S1). Из 1920 минипулов селекцию прошел 1041 минипул, что составило примерно 54% от общей выборки.

Скрининг и отбор лидерных минипулов-продуцентов. На 10 сут инкубирования проводили скрининг проб КЖ минипулов-продуцентов из 96-луночных планшетов с использованием метода ИФА (рис. 2А). Максимальная продуктивность минипулов достигла 200 мг/л. Далее 240 минипулов с максимальной продуктивностью (лидерные минипулы) переносили в 24-луночные планшеты. Скрининг проб КЖ минипулов из 24-луночных планшетов (рис. 2В) показал, что максимальная продуктивность составила 90 мг/л. Затем 88 лидерных минипулов переносили в 6-луночные планшеты и культивировали в стационарных условиях. Анализ продуктивности минипулов из 6-луночных планшетов (рис. 2С) позволил выявить 23 лидерных минипула, которые были переведены в условия культивирования с перемешиванием в мини-биореакторах для адаптации роста и восстановления жизнеспособности клеток.

Таким образом, из 1041 минипула, прошедшего селекцию, после нескольких этапов скрининга было отобрано 23 минипула с лучшими показателями продуктивности деносумаба. Данные минипулы переносили в условия шейкерного культивирования для проведения адаптации и последующей криоконсервации культур клеток.

Исследование ростовых и продукционных характеристик минипулов. Для определения наиболее перспективных кандидатов проводили периодическое культивирование минипулов-продуцентов деносумаба в течение 7 сут (рис. 3). Для всех минипулов отмечали высокую жизнеспособность, превышающую 90% (рис. 3А). Максимальное значение показателя VCD (более 30×10⁶ клеток/мл) наблюдали на 7 сут для следующих минипулов: mp-14 (36,3×10⁶ клеток/мл), mp-16 (34,5×10⁶ клеток/мл), mp-20 (33,8×10⁶ клеток/мл) (рис. 3В). Показатель волюметрической продуктивности (VCD) варьировал от 0,6 до 1,9 г/л среди всей выборки продуцентов (рис. 3С). Выявлены минипулы-продуценты с наибольшим выходом целевого белка (более 1,7 г/л) на 7 сут: mp-19 (1,92 г/л), mp-14 (1,82 г/л), mp-4 (1,75 г/л).

Таким образом, определены минипулы, для которых продемонстрирован высокий показатель клеточной плотности одновременно с максимальным выходом целевого продукта деносумаба: mp-14, mp-4, mp-19 (рис. 3D). После сравнительного исследования физико-химических свойств полученного белка и контрольного препарата, включая изучение профиля гликозилирования (результаты не приведены), для дальнейшего клонирования был выбран минипул-продуцент mp-19.

Клоны-продуценты рекомбинантного белка деносумаба получали методом клонирования в полутвердую среду с последующим отбором клонов с помощью роботизированной системы ClonePix FL (в 12- и 96-лучных планшетах, всего 1056 колоний). Для определения лидерных клонов проводили серию скринингов КЖ клонов-продуцентов деносумаба методом ИФА. В ходе скрининга отбирали клоны с максимальной продуктивностью (результаты не приведены), в соответствии с принципом, представленным на рисунке 1. Выбранные лидерные клоны-продуценты (24 клона) переносили в условия шейкерного культивирования для проведения адаптации и последующей криоконсервации культур клеток.

Культивирование клонов-продуцентов деносумаба в непрерывном режиме с подпиткой проводили в течение 9 сут, исследуя ростовые и продукционные характеристики культур (рис. S2, опубликован на сайте журнала3). Жизнеспособность клонов к 9 сут оставалась более 80% (рис. S2А). Максимальное значение показателя VCD (более 45×10⁶ клеток/мл) фиксировали на 6–8 сут культивирования для следующих клонов-продуцентов: clone-12 (48,5×10⁶ клеток/мл) и clone-23 (47,7×10⁶ клеток/мл) (рис. S2B). Продуктивность клонов варьировала от 0,9 до 6,5 г/л (рис. S2C). Выделены лидерные клоны с продуктивностью деносумаба более 6 г/л: clone-8 (6,58 г/л), clone-13 (6,52 г/л), clone-19 (6,04 г/л). Определены клоны, для которых продемонстрированы одновременно высокие значения плотности жизнеспособных клеток и выхода продукта: clone-13, clone-8, clone-11, clone-6 (рис. S2D). Максимальная специфическая продуктивность (выше 35 пг/клетка/сут) показана для следующих клонов: clone-16 (38,5 пг/клетка/сут), clone-5 (36,2 пг/клетка/сут), clone-19 (35,9 пг/клетка/сут) (табл. 2).

Таким образом, в результате проведенного исследования была получена панель клонов-продуцентов рекомбинантного терапевтического белка деносумаба. Лидерные клоны (6–8 клонов), характеризующиеся оптимальными параметрами, были отобраны для последующих экспериментов, направленных на оценку стабильности ростовых и продукционных свойств.

Критическим аспектом разработки рекомбинантных терапевтических белков является выбор клеточной линии-продуцента. Для производства рекомбинантных белков в биофармацевтическом производстве наиболее часто используют линию клеток яичника китайского хомячка CHO [19]. Имеющийся опыт создания препаратов на основе этой клеточной линии может существенно сократить сроки и затраты при разработке лекарственных средств [20]. Клетки СНО пригодны для крупномасштабных промышленных процессов культивирования в суспензионных условиях благодаря способности достигать высоких показателей VCD и обеспечивать максимальный выход белка [21–23]. Важным преимуществом является профиль гликозилирования продуцируемых белков, близкий человеческому, что повышает вероятность сохранения биологической активности рекомбинантных белков в организме человека и обеспечивает эффективность терапии [24]. Культура клеток СНО характеризуется низкой восприимчивостью к вирусам человека, обусловленной отсутствием экспрессии многих человеческих вирусных генов, что делает эту клеточную линию предпочтительной с точки зрения биобезопасности при коммерческом производстве препаратов [25–27]. Способность клеток линии СНО адаптироваться к изменениям pH, уровню кислорода, давлению или температуре [28] позволяет варьировать критические параметры качества конечного продукта. Клетки СНО способны к росту в бессывороточных средах, что снижает риск контаминации вирусами и прионами, обеспечивая биобезопасность терапевтических белков. Применение таких сред также способствует воспроизводимости профиля качества белка, повышению продуктивности клеточной линии и оптимизации стадий выделения и очистки белка (за счет снижения белковых примесей) [29].

К недостаткам линии СНО относится присутствие в гликозилированных рекомбинантных белках гликанов (галактоза-альфа-1,3-галактоза, N-гликолилнейраминовая кислота) [30][31], что может повышать иммуногенность и изменять фармакокинетику терапевтического белка [32].

Основные этапы процесса разработки стабильных моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков (cell line development) могут варьировать в зависимости от используемых модифицированных клеточных линий, экспрессионных векторов, методов и оборудования.

Экспрессионный вектор должен содержать все необходимые регуляторные элементы для обеспечения эффективной экспрессии целевого гена, встроенного в геном родительской клеточной линии. Вектор подбирается под определенный тип клеток и целевой белок. От должного конструирования генно-инженерной конструкции и содержания регуляторных элементов зависит продукция целевого белка. В настоящее время изучены и апробированы различные регуляторные генетические элементы, которые способствуют увеличению выхода целевого белка [33].

Тип селективного маркера является ключевым фактором при получении продуцентов. Для селекции продуцентов традиционно применяют векторы, содержащие гены устойчивости к антибиотикам, такие как ген пуромицин-N-ацетилтрансферазы, позволяющий трансфицированным клеткам расти в присутствии антибиотика. Для эффективного проведения селекции и отбора высокопродуктивных клеточных линий на предварительном этапе работ подбирается оптимальная концентрация селективного антибиотика. Выбор системы селекции определяется конкретной клеточной линией; например, существуют линии, система селекции которых основана на механизмах ауксотрофии, такие как CHO-DG44 [34], СНО-GS и др. В последнее время активно внедряют методы получения новых клеточных линий и улучшения клеточного метаболизма существующих линий с помощью CRISPR/Cas9 [35].

Для трансфекции эукариотических клеточных линий применяются различные реагенты (липофектамин, полиэтиленимин), а также электропораторы и др. Наиболее распространенным методом для стабильной трансфекции эукариотических клеток является электропорация [36]. Параметры электропорации (напряжение, длительность импульса, частота и др.) подбираются индивидуально для каждой клеточной линии, обеспечивая максимальную эффективность трансфекции и стабильную интеграцию генно-инженерной конструкции в геном клеток хозяина.

Использование моноклональной клеточной линии для производства рекомбинантных терапевтических белков является обязательным регуляторным требованием для регистрации лекарственных препаратов. Моноклональность культуры играет ключевую роль в обеспечении качества биотехнологического продукта, полученного с помощью технологии рекомбинантной ДНК, и стабильности производственного процесса [37]. При разработке моноклональных клеточных линий используют различные подходы, в том числе метод предельного разведения, а также специализированное оборудование, предназначенное для обеспечения получения клеточной линии из одной клетки-предшественницы с высокой вероятностью (дозаторы единичных клеток, сортеры, роботизированные системы для получения клонов, системы фотодокументирования планшетов и др.). В данной работе для получения клонов-продуцентов деносумаба была использована роботизированная система Clone Pix, осуществляющая отбор колоний клеток из полутвердой среды в автоматическом режиме при асептических условиях [38].

Для получения высокопродуктивного продуцента необходима большая выборка клеточных линий. В данной работе из 1920 минипулов селекцию прошел 1041 минипул (около 54%). Среди них при культивировании в периодическом режиме в течение 7 сут было выявлено 4 минипула с продуктивностью более 1,5 г/л (0,2%). Затем лидерный минипул с продуктивностью около 2 г/л был клонирован, в результате чего получено 1056 моноклонов. При культивировании среди них было выявлено 3 моноклона с продуктивностью более 6 г/л (0,3%). Таким образом, на основе имеющейся выборки минипулов и клонов удалось выявить моноклоны, обеспечивающие титр целевого белка на 9 сут более 6 г/л. Этот подход позволяет прогнозировать необходимое количество исследуемых клеточных линий для достижения требуемого уровня выхода целевого белка. В настоящее время активно применяется математическое моделирование при отборе наиболее предпочтительных клонов по разным показателям [39].

Подход к разработке моноклональных клеточных линий-продуцентов может значительно различаться в зависимости от выбора родительской клеточной линии, экспрессионных векторов, используемых материалов, методов анализа и оборудования на разных этапах разработки. Достижение высоких титров целевого рекомбинантного белка стало возможным благодаря комплексу работ, направленных на усовершенствование векторов экспрессии; выбора клеток-хозяев, методов скрининга, продуцентов, высокотехнологичного оборудования; оптимизацию сред и подпиток определенного химического состава, а также благодаря применению инновационных решений в этой области.

Рост спроса на биотерапевтические препараты стимулирует необходимость сокращения времени и затрат на разработку клеточных линий. Это способствует совершенствованию методов, реактивов и оборудования для получения клонов-продуцентов.

Авторы данной работы представили собственный подход и описали основные этапы процесса разработки стабильных моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков на основе суспензионной клеточной линии СНО на примере получения продуцентов деносумаба.

1. https://dhpp.hpfb-dgpsa.ca/review-documents/resource/RDS1710769045419https://dhpp.hpfb-dgpsa.ca/review-documents/resource/RDS1710165579186https://adisinsight.springer.com/drugs/8000492952. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-553-fig-s13. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-553-fig-s2