Оптимизация условий индукции синтеза проинсулина аспарт в клетках бактериального штамма-продуцента

Сахарный диабет несет серьезную угрозу здоровью людей во всем мире, в связи с чем в 2021 г. Всемирная организация здравоохранения учредила Глобальный пакт по борьбе с диабетом — инициативу, направленную на обеспечение улучшений в области лечения и профилактики диабета. Быстрый рост числа больных диабетом увеличивает потребность в инсулине. Применение аналогов инсулина человека ультракороткого действия, в том числе инсулина аспарт, способствует повышению эффективности инсулинотерапии. Одним из способов получения инсулина аспарт является его биосинтез в виде проинсулина в клетках Escherichia coli, однако выход рекомбинантного белка в значительной степени определяется оптимизацией процесса производства.

Цель работы: оптимизация условий индукции синтеза рекомбинантного проинсулина аспарт в клетках штамма-продуцента E. coli с помощью подхода математического планирования эксперимента (Design of Experiment, DoE) для повышения продуктивности.

Материалы и методы: использовали штамм-продуцент проинсулина аспарт на основе клеток E. coli. Эксперимент планировали с помощью программного обеспечения MODDE с использованием дизайна, который позволяет оценить взаимодействие факторов и в дальнейшем построить проектные поля (reduced central composite design, face-centred, CCF). Культивирование штамма-продуцента проводили в биореакторе Biostat® объемом 5,0 л. Определение концентрации проинсулина аспарт осуществляли методом капиллярного гель-электрофореза. Обработку результатов выполняли с помощью программы GraphPad Prism 6.

Результаты: проведена оптимизация условий роста штамма-продуцента и биосинтеза проинсулина аспарт с применением подхода DoE. На основании данных графиков поверхности отклика (для параметров — концентрация влажной биомассы, удельная продуктивность и объемная продуктивность) и построенных моделей были определены проектные поля процесса индукции проинсулина аспарт в клетках штамма-продуцента E. coli. Показано, что построенные модели характеризуются высокой прогностической способностью и высокой воспроизводимостью полученных результатов. Проведена успешная валидация процесса индукции синтеза проинсулина аспарт в оптимизированных условиях в биореакторе. Значение показателя объемной продуктивности штамма-продуцента проинсулина аспарт увеличено с 3,06±0,16 г/л (стандартные условия) до 4,93±0,80 г/л (оптимизированные условия).

Выводы: достигнуто увеличение объемной продуктивности штамма-продуцента проинсулина аспарт на 60%. Полученные результаты исследования могут быть использованы для интенсификации промышленного производства инсулина аспарт.

1. Chapman TM, Noble S, Goa KL. Insulin aspart: a review of its use in the management of type 1 and 2 diabetes mellitus. Drugs. 2002;62(13):1945–81. https://doi.org/10.2165/00003495-200262130-00014

2. Valerio LG, Jr. Tenth anniversary of Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2014;10(6):767–8. https://doi.org/10.1517/17425255.2014.920007

3. Siew YY, Zhang W. Downstream processing of recombinant human insulin and its analogues production from E. coli inclusion bodies. Bioresour Bioprocess. 2021;8(1):65. https://doi.org/10.1186/s40643-021-00419-w

4. Baeshen NA, Baeshen MN, Sheikh A, Bora RS, Ahmed MM, Ramadan HA, et al. Cell factories for insulin production. Microb Cell Fact. 2014;13:141. https://doi.org/10.1186/s12934-014-0141-0

5. Mikiewicz D, Bierczyńska-Krzysik A, Sobolewska A, Stadnik D, Bogiel M, Pawłowska M, et al. Soluble insulin analogs combining rapid- and long-acting hypoglycemic properties — from an efficient E. coli expression system to a pharmaceutical formulation. PLoS One. 2017;12(3):e0172600. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0172600

6. Uhoraningoga A, Kinsella GK, Henehan GT, Ryan BJ. The Goldilocks approach: a review of employing design of experiments in prokaryotic recombinant protein production. Bioengineering (Basel). 2018;5(4):89. https://doi.org/10.3390/bioengineering5040089

7. Haider MA, Pakshirajan K. Screening and optimization of media constituents for enhancing lipolytic activity by a soil microorganism using statistically designed experiments. Appl Biochem Biotechnol. 2007;141(2–3):377–90. https://doi.org/10.1007/BF02729074

8. Gutiérrez-González M, Farías C, Tello S, Pérez-Etcheverry D, Romero A, Zúñiga R, et al. Optimization of culture conditions for the expression of three different insoluble proteins in Escherichia coli. Sci Rep. 2019;9(1):16850. https://doi.org/10.1038/s41598-019-53200-7

9. Ashayeri-Panah M, Eftekhar F, Kazemi B, Joseph J. Cloning, optimization of induction conditions and purification of Mycobacterium tuberculosis Rv1733c protein expressed in Escherichia coli. Iran J Microbiol. 2017;9(2):64–73.

10. 10. Azaman SN, Ramakrishnan NR, Tan JS, Rahim RA, Abdullah MP, Ariff AB. Optimization of an induction strategy for improving interferon-alpha2b production in the periplasm of Escherichia coli using response surface methodology. Biotechnol Appl Biochem. 2010;56(4):141–50. https://doi.org/10.1042/BA20100104

11. Huang Y, Lu X, Wang J, Jin X, Zhu J. Optimization of expression conditions of an induction strategy for improving liver targeted interferon (IFN-CSP) production in E. coli. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2014;31(2):432–8.

12. Larentis AL, Corrêa Argondizzo AP, dos Santos Esteves G, Jessouron E, Galler R, Medeiros MA. Cloning and optimization of induction conditions for mature PsaA (pneumococcal surface adhesin A) expression in Escherichia coli and recombinant protein stability during long-term storage. Protein Expr Purif. 2011;78(1):38–47. https://doi.org/10.1016/j.pep.2011.02.013

13. Mandenius CF, Brundin A. Bioprocess optimization using design-of-experiments methodology. Biotechnol Prog. 2008;24(6):1191–203. https://doi.org/10.1002/btpr.67

14. Dolnik V. Capillary electrophoresis of proteins 2005–2007. Electrophoresis. 2008;29(1):143–56. https://doi.org/10.1002/elps.200700584

15. Castellanos-Mendoza A, Castro-Acosta RM, Olvera A, Zavala G, Mendoza-Vera M, García-Hernández E, et al. Influence of pH control in the formation of inclusion bodies during production of recombinant sphingomyelinase-D in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 2014;13:137. https://doi.org/10.1186/s12934-014-0137-9

16. Slouka C, Kopp J, Hutwimmer S, Strahammer M, Strohmer D, Eitenberger E, et al. Custom made inclusion bodies: impact of classical process parameters and physiological parameters on inclusion body quality attributes. Microb Cell Fact. 2018;17(1):148. https://doi.org/10.1186/s12934-018-0997-5

17. Chen H, Jiang P, Li F, Wu H. Improving production of thermostable and fluorescent holo-β-allophycocyanin by metabolically engineered Escherichia coli using response surface methodology. Prep Biochem Biotechnol. 2015;45(7):730–41. https://doi.org/10.1080/10826068.2014.943374

18. Einsfeldt K, Severo Júnior JB, Corrêa Argondizzo AP, Medeiros MA, Alves TL, Almeida RV, Larentis AL. Cloning and expression of protease ClpP from Streptococcus pneumoniae in Escherichia coli: study of the infl uence of kanamycin and IPTG concentration on cell growth, recombinant protein production and plasmid stability. Vaccine. 2011;29(41):7136–43. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.05.073

19. Marini G, Luchese MD, Corrêa Argondizzo AP, Magalhães Andrade de Góes AC, Galler R, Moitinho Alves TL, et al. Experimental design approach in recombinant protein expression: determining medium composition and induction conditions for expression of pneumolysin from Streptococcus pneumoniae in Escherichia coli and preliminary purification process. BMC Biotechnol. 2014;14:1. https://doi.org/10.1186/1472-6750-14-1

20. Mühlmann M, Forsten E, Noack S, Büchs J. Optimizing recombinant protein expression via automated induction profiling in microtiter plates at different temperatures. Microb Cell Fact. 2017;16(1):220. https://doi.org/10.1186/s12934-017-0832-4