ОБЗОРЫ
Актуальность. В настоящее время разработано множество различных подходов к редактированию генома, основанных на применении разных систем редактирования, осуществлении модификаций генома с образованием одноцепочечных или двухцепочечных разрывов ДНК, in vivo или ex vivo, с восстановлением последовательности генома с помощью гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов ДНК. Однако применение систем редактирования генома сопряжено с возможным возникновением целого ряда рисков, вследствие сложной биологии таких препаратов и фундаментального значения цели их воздействия – молекулы ДНК.
Цель. Анализ актуальных направлений и рисков, связанных с применением препаратов на основе систем редактирования генома, способов снижения рисков и методов их исследования, используемых для выявления и контроля возникновения нежелательных эффектов.
Обсуждение. Анализ данных литературы показал, что нежелательные эффекты от применения препаратов на основе систем редактирования генома могут быть связаны как со способами доставки компонентов системы в клетку, так и с функциональной активностью самой системы (недостаточное целевое или нежелательное нецелевое действия). В обзоре обозначены основные риски при использовании систем редактирования генома. Установлено, что для снижения рисков применения систем редактирования генома предпочтительно проведение репарации разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации, использование обладающих большей специфичностью и точностью рестрикции систем редактирования генома и эндонуклеаз в их составе, увеличение специфичности гРНК (для CRISPR/Cas), контролируемая коррекция активности элементов системы регуляции клеточного цикла и апоптоза, регуляция продолжительности экспрессии и персистенции компонентов систем редактирования генома в клетках и др.
Заключение. Освещение основных рисков, связанных с применением этой группы препаратов, является актуальным в связи с необходимостью предоставления данных в регистрационном досье на высокотехнологичный лекарственный препарат, касающихся оценки качества, эффективности и безопасности.
Актуальность. Лекарственные препараты ботулинического токсина представляют собой хороший пример использования смертельно опасного токсина в составе уникальных терапевтических препаратов. Однако остается много нерешенных вопросов в отношении биотехнологии, биологической активности, взаимозаменяемости и стандартизации препаратов ботулотоксина.
Цель. Обзор актуальных направлений по совершенствованию лекарственных препаратов на основе ботулинического токсина.
Обсуждение. Рассмотрены лекарственные препараты ботулинического токсина типа А, а также связанные с ними вопросы, требующие решения. Зарегистрированные отечественные и зарубежные лекарственные препараты ботулинического токсина типа А из-за отсутствия международных непатентованных наименований, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения, Коллегией Евразийской экономической комиссии, а также в Российской Федерации, имеют только группировочные наименования. Кроме того, каждый производитель присваивает собственные наименования препаратам ботулотоксина. Для более четкой идентификации, правильного выбора и назначения требуются унификация названий и объединение данных препаратов в одну группу. Продемонстрирована особенность препаратов ботулинического токсина типа А — их существенное различие по многим параметрам, которое не позволяет считать эти препараты сопоставимыми по качественным и количественным характеристикам, что порождает проблему взаимозаменяемости и биоэквивалентности. В связи с этим требуется разработка и закрепление в соответствующих нормативных документах единой номенклатуры лекарственных препаратов ботулотоксина. Анализ данных литературы показал, что производители используют собственные стандартные образцы, поэтому при определении токсичности и лечебного действия разных препаратов ботулотоксина одной и той же единице измерения активности может соответствовать различная белковая нагрузка. В связи с этим рассмотрены вопросы разработки единого международного стандартного образца для определения активности ботулинического токсина типа А с целью стандартизации имеющихся и вновь создаваемых препаратов.
Заключение. Описаны препараты ботулотоксина, имеющие новый состав, в том числе находящиеся на поздних стадиях разработки. Обобщенные данные клинических исследований по эффективности, безопасности и рентабельности препаратов ботулинического токсина типа А могут служить ориентиром для терапевтических назначений.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Актуальность. Интраназальная вакцинация может в значительной мере изменить подходы к массовой иммунизации населения для профилактики различных инфекций, меняя акцент с формирования системного гуморального и клеточного ответа на создание барьерной защиты слизистых оболочек – входных ворот возбудителя, и развитие мукозального иммунного ответа. В связи с этим актуальной представляется оценка безопасности применения вакцин для профилактики коронавирусной инфекции при изменении способа введения – с внутримышечного на интраназальный.
Цель. Сравнительная оценка безопасности интраназальной и внутримышечной вакцинации на основании промежуточных результатов клинического исследования III фазы VCI-COV-III с участием здоровых добровольцев.
Материалы и методы. Оценка безопасности проводилась на основании зарегистрированных исследователями нежелательных явлений и реакций на момент составления промежуточного отчета по данным 42 дней наблюдения за 137 добровольцами в рамках рандомизированного двойного слепого клинического исследования интраназальной вакцины (ИнВ) Салнавак и внутримышечной вакцины (ВмВ) Гам-КОВИД-Вак для профилактики коронавирусной инфекции.
Результаты. Число добровольцев с зарегистрированными нежелательными реакциями в исследовании составило 17 из 68 (25%) и 30 из 69 (43,5%) человек в группах с введением ИнВ и ВмВ соответственно (p=0,036). В группе добровольцев, получавших ИнВ, были зарегистрированы кратковременные общие и местные нежелательные реакции в основном легкой степени тяжести. Частота и характер отмечаемых реакций в целом соответствуют таковым при применении иных продуктов с интраназальным путем введения.
Выводы. Предварительные данные клинического исследования показали высокий уровень безопасности исследуемой интраназальной вакцины. Профиль безопасности ИнВ сопоставим с иными интраназальными или внутримышечными вакцинами для профилактики коронавирусной инфекции.
Актуальность. Активация механизмов врожденного иммунитета на ранних фазах развития инфекции COVID-19 и, как следствие, последующая индукция продукции интерферонов может способствовать контролю репликации вируса и защите еще неинфицированных SARS-CoV-2 клеток. В связи с этим в качестве средств постконтактной профилактики и лечения COVID-19 на ранних этапах представляется перспективным применение иммуностимулирующих препаратов, вызывающих индукцию интерферонов, в том числе препаратов на основе двуспиральной РНК.
Цель. Оценка противовирусной активности лекарственного препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в отношении вируса SARS-CoV-2 in vitro.
Материалы и методы. Препарат на основе РНК двуспиральной натриевой соли (РАДАМИН®ВИРО). Эксперименты выполняли на культуре клеток Vero. В исследовании использовали вариант дельта вируса SARS-CoV-2 (B.1.617). Проводили оценку цитопатического действия вируса. Титр вируса рассчитывали как показатель тканевой цитопатической дозы, вызывающей гибель 50% клеток. Содержание интерферонов α и γ в культуральной жидкости определяли с помощью метода иммуноферментного анализа, вирусную нагрузку – методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (по показателю Ct) и титр вируса – титрованием на культуре клеток Vero.
Результаты. Внесение препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в концентрациях 250 мкг/мл и 500 мкг/мл к клеткам линии Vero приводит к индукции секреции интерферонов α и γ, что повышает резистентность клеток к заражению вирусом SARS-CoV-2. Противовирусная активность исследуемого препарата, оцениваемая по значениям показателей титра вируса, вирусной нагрузки и уровня поражения клеточного монослоя, отмечается через 24 ч после его воздействия, что показывает способность препарата задерживать размножение вируса SARS-CoV-2 in vitro уже в течение первых суток после заражения.
Выводы. Препарат на основе РНК двуспиральной натриевой соли индуцирует синтез интерферонов α и γ клетками линии Vero, повышая устойчивость клеток к заражению SARS-CoV-2 in vitro, что свидетельствует о иммуномодулирующем и противовирусном потенциале исследованного препарата.
Актуальность. Препараты иммуноглобулинов человека, содержащие в составе антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg), являются средством экстренной профилактики гепатита В у взрослых и детей и применяются для лечения легких и среднетяжелых форм острого вирусного гепатита В. Клиническая эффективность таких препаратов определяется специфической активностью, оцениваемой по содержанию антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (anti-HBs антитела), которую в настоящее время определяют с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА).
Цель. Анализ различных математических методов оценки экспериментальных данных, полученных с применением ИФА для определения активности антител к поверхностному антигену вируса гепатита В в препаратах иммуноглобулинов человека.
Материалы и методы. В работе использовали международный стандартный образец иммуноглобулина человека, содержащий anti-HBs антитела; препараты иммуноглобулинов; набор реагентов для иммуноферментного качественного и количественного определения антител к HBsAg в сыворотке (плазме) крови.
Результаты. С использованием сэндвич-варианта ИФА установлена зависимость получаемого результата определения концентрации anti-HBs антител от выбора способа построения калибровочного графика («ручной» подход, метод параллельных линий с использованием программы «PARALINE», метод линейной регрессии, 4-параметрическая логистическая модель). Разброс полученных значений концентрации anti-HBs антител составил ±19 МЕ/мл от среднего значения. Установлено, что неверно подобранный метод обработки данных может приводить к ошибочным расчетам значений активности (концентрации) анализируемого вещества в испытуемом образце.
Выводы. Показана необходимость совершенствования математических методов оценки экспериментальных данных, используемых для определения концентрации anti-HBs антител в препаратах иммуноглобулинов человека, и важность перехода от «ручного» к автоматизированному обсчету получаемых результатов (например, с использованием 4-параметрической логистической модели) в соответствии с требованиями, предъявляемыми к биоаналитическим методам испытаний, и с учетом возможностей современного оборудования.
Актуальность. Производство качественных лекарственных препаратов, в том числе вакцин, возможно только в условиях сохранения стабильности всех стадий технологического процесса производства. Подходом для оценки стабильности процесса производства является использование контрольных карт Шухарта, построенных по данным анализируемых показателей качества.
Цель. Оценка стабильности качества туберкулезных вакцин БЦЖ и БЦЖ-М и стабильности процесса их производства с помощью контрольных карт Шухарта.
Материалы и методы. Образцы вакцины туберкулезной (БЦЖ) и вакцины туберкулезной для щадящей первичной иммунизации (БЦЖ-М) серий, выпущенных в гражданский оборот в 2019–2022 гг. Стабильность качества вакцин оценивали по показателям качества «Специфическая активность» и «Общее содержание бактерий», которые являются ключевыми при оценке иммуногенности. Сравнительную оценку показателей качества вакцин проводили согласно результатам анализа, предоставленным предприятием-производителем, а также результатам, полученным при контроле качества в испытательном центре. Проводили построение контрольных карт Шухарта индивидуальных значений (Х-карта) и карт скользящих размахов (R-карта) в соответствии с ГОСТ Р 50779.42-99 и ГОСТ Р ИСО 7870-2-2015.
Результаты. Показано, что качество вакцин БЦЖ и БЦЖ-М оставалось стабильным в течение всего периода наблюдения (2019–2022 гг.). Ретроспективный анализ R- и X-карт выявил наличие характерных трендов, присущих критериям для особых причин в отдельные временные промежутки исследования. Значение коэффициента корреляции Пирсона (r) между данными производителя и данными, полученными при контроле качества в испытательном центре, составило от 0,2 до 0,8.
Выводы. С помощью контрольных карт Шухарта подтверждена стабильность качества туберкулезных вакцин БЦЖ и БЦЖ-М, выпущенных в 2019–2022 гг. Проведенный анализ R- и X-карт свидетельствует о стабильности процесса производства вакцин, однако наличие предупреждающих сигналов указывает на необходимость проведения дополнительных мероприятий, направленных на стандартизацию технологического процесса. Полученные результаты могут служить основанием для рекомендации применения карт Шухарта при производстве и контроле качества туберкулезных вакцин.
Актуальность. Современные методы оценки иммуногенности дифтерийного и столбнячного анатоксинов разделяют на две группы: золотой стандарт — с введением токсина иммунизированным животным, и серологические методы — определение уровня защитных антител в сыворотке иммунизированных животных. Международные валидационные исследования серологических методов для определения иммуногенности дифтерийного и столбнячного анатоксинов привели к пересмотру соответствующих глав Руководства Всемирной организации здравоохранения, Европейской и Японской фармакопей. В связи с этим некоторые производители вакцин против дифтерии и столбняка заменили методы с введением токсинов на альтернативные серологические методы в оценке иммуногенности.
Цель. Оценить пригодность, воспроизводимость и возможность внедрения в отечественную практику альтернативного метода иммуноферментного анализа при определении иммуногенности дифтерийного и столбнячного компонентов комбинированных вакцин с цельноклеточным коклюшным компонентом; изучить возможность использования отечественных стандартных образцов и реактивов.
Материалы и методы. Использовали комбинированные вакцины и анатоксины для профилактики дифтерии, дифтерийный токсин, референс-препараты. Определение специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов проводили на морских свинках и мышах фармакопейными методами: летального заражения и иммуноферментного анализа.
Результаты. Получены сопоставимые результаты оценки специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов методами иммуноферментного анализа и летального заражения: 230 МЕ/мл и 264 МЕ/мл, 188 МЕ/мл и 160 МЕ/мл соответственно. Данный серологический метод позволяет использовать одних и тех же особей (в отличие от метода летального заражения) для проверки эффективности нескольких антигенов. Значения титров антител, полученных от каждой особи, при использовании в качестве покрывающих антигенов неадсорбированных дифтерийного и столбнячного анатоксинов отечественного производства оказались сопоставимы с таковыми при использовании в качестве покрывающих антигенов международных стандартов.
Выводы. Показана возможность применения метода иммуноферментного анализа для определения специфической активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов в вакцинах против дифтерии и столбняка, содержащих цельноклеточный коклюшный компонент. В качестве покрывающих антигенов возможно использование дифтерийного и столбнячного неадсорбированных анатоксинов отечественного производства. Необходимо продолжить работу по валидации методики иммуноферментного анализа с целью гармонизации отечественных и международных методов оценки иммуногенности дифтерийного и столбнячного анатоксинов, что не только облегчит регистрацию зарубежных вакцин в России, но и ускорит регистрацию отечественных вакцин в других странах.
Актуальность. Главными факторами, определяющими реактогенность коклюшной цельноклеточной вакцины, принято считать содержание липоолигосахарида Bordetella pertussis и остаточное содержание активного коклюшного токсина. Изучение токсического воздействия коклюшных компонентов бактериальной клетки B. pertussis на основные показатели качества цельноклеточной коклюшной вакцины (защитную активность и специфическую токсичность — термины, принятые в рекомендациях ВОЗ и Европейской фармакопее) актуально и необходимо для повышения качества препарата.
Цель. Изучение токсического влияния липоолигосахарида B. pertussis и остаточного количества активного коклюшного токсина, присутствующих в цельноклеточной адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцине, на специфическую токсичность и защитную активность препарата.
Материалы и методы. Исследовали 57 коммерческих серий адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины на соответствие показателей качества требованиям нормативной документации. К группе 1 отнесли серии, не выдержавшие испытания по показателю «Специфическая токсичность»; к группе 2 — соответствующие требованиям. Защитную активность определяли в тесте экспериментального менингоэнцефалита на мышах линии F1 CBA×C57Bl/6j, иммунизированных АКДС- и референс-вакцинами. Специфическую токсичность препарата определяли в тесте изменения массы тела мышей после внутрибрюшинного введения вакцины АКДС. Токсическое действие липоолигосахарида оценивали опосредованно — через изменение массы тела мышей в первые 16–24 ч; коклюшного токсина — на 7-е сутки. Корреляционный анализ тесноты связи между установленными показателями токсического действия исследуемых компонентов и показателями специфической токсичности и защитной активности, полученными в этих же сериях вакцины, проводили при помощи коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Результаты. Опосредованно определили токсическое действие липоолигосахарида и остаточного количества активного коклюшного токсина в исследуемых сериях. Коэффициенты корреляции между показателями специфической токсичности и защитной активности вакцины и показателями токсического действия липоолигосахарида составили 0,113 (р>0,05) и 0,049 (р>0,05) соответственно, для коклюшного токсина — 0,595 (р<0,01) и –0,534 (р<0,01) соответственно.
Выводы. Выявили и оценили токсическое действие липоолигосахарида B. pertussis и остаточного количества активного коклюшного токсина в цельноклеточной вакцине; установили обратную корреляционную связь между защитной активностью вакцины и токсическим действием остаточного уровня активного коклюшного токсина. Тесты продемонстрировали, что показатель, оценивающий специфическую токсичность цельноклеточной коклюшной вакцины, не отражает присутствие и содержание липоолигосахарида в вакцине. Опираясь на результаты исследования, можно утверждать, что в производственных коклюшных штаммах, используемых для изготовления цельноклеточной коклюшной вакцины, целесообразно определять содержание липоолигосахарида B.pertussis, что в Российской Федерации в настоящее время не принято.
Актуальность. В работе Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России основной метод работы — лиофилизация, обеспечивающая сохранение свойств депонированных тест-штаммов. Для успешной лиофилизации необходимо экспериментальное определение основных параметров и критических условий процесса.
Цель. Оценить влияние скорости и времени замораживания, времени высушивания, объема заполнения ампул, плотности ватного фильтра на качество коллекционных бактериальных тест-штаммов при лиофилизации на аппарате коллекторного типа.
Материалы и методы. Тест-штаммы Pseudomonas aeruginosa NCTC 12924, Staphylococcus aureus NCTC 10788, Salmonella Abony NCTC 6017 высушивали методом лиофилизации на аппарате коллекторного типа. Замораживание велось при температуре –70±2 °С в низкотемпературном морозильнике (медленная заморозка) и в смеси «сухого льда» со спиртом (быстрая заморозка). Статистическую обработку данных проводили при помощи программ MS Exсel и Statistica, v. 10.
Результаты. Время замораживания ампул в низкотемпературном морозильнике при –70±2 °С не менее 4 ч, дальнейшее хранение возможно при данной температуре до 1 мес. без потери качества конечного продукта. Время замораживания ампул в смеси «сухого льда» и спирта составило менее 1 мин. Различий в показателях качества лиофилизатов, полученных при быстрой и медленной заморозке, не выявлено, кроме внешнего вида: при быстром замораживании таблетка лиофилизата формируется неровная, легко отделяется от стекла и крошится, что нежелательно. Длительность этапа первичного высушивания ампул наполнения 0,2 мл составила 6–8 ч. Показано, что время досушивания в течение 11, 18, 35 и 59 ч приводит к получению лиофилизатов сравнимого качества: количество жизнеспособных микробных клеток (КОЕ/мл) сразу после лиофилизации и по завершении стресс-теста во всех случаях статистически значимо не отличалось. Содержание остаточной влаги при досушивании в течение 59 ч — менее 2 %. Плотность ватного фильтра имеет критическое влияние на качество лиофилизата, рекомендуется использование ватного фильтра массой не более 50 мг.
Выводы. Изучены основные этапы высушивания коллекционных тест-штаммов на аппарате коллекторного типа. Исследовано влияние на качество конечного продукта следующих факторов: скорости и времени замораживания, длительности высушивания, объема заполнения ампул, плотности ватного фильтра. Полученные результаты используются в работе коллекции микроорганизмов.
ISSN 2619-1156 (Online)