ВВЕДЕНИЕ. В отсутствие возможности использовать международный стандартный образец (СО) антигена и антисыворотку к нему для количественного определения содержания гемагглютинина (ГА) вируса гриппа методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), а также в условиях пандемии или другой чрезвычайной ситуации необходимы валидированные альтернативные методы для количественного определения ГА.

ЦЕЛЬ. Оптимизация методики аттестации первичного стандартного образца содержания гемагглютинина вируса гриппа с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом с последующей денситометрической обработкой гелей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Содержание ГА (%) в СО определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата (ДСН-ПААГ) в условиях воспроизводимости (2 лаборатории). Концентрацию ГА (мкг/мл) определяли с учетом содержания общего белка, которое определяли по методу Лоури. Метод ОРИД использовался для оценки правильности количественного определения ГА. Обработку изображений пластин, расчет квадратов диаметров колец преципитации и количества ГА в образцах проводили с помощью программного обеспечения CombiStats. Сахарозу и глицерин в вирусном и разведенном вирусном концентратах (РВК) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Добавление 0,072 мМ 2-меркаптоэтанола для обработки образцов позволяет исключить использование мочевины при проведении электрофореза в ДСН-ПААГ с дегликозилированием. Результаты определения концентрации ГА в РВК методом электрофореза в ДСН-ПААГ при использовании 4–12% бис-трис гелей в лаборатории № 1 практически совпадают с результатами лаборатории № 2 (4–20% трис-глициновые гели) — 135,8 и 135,5 мкг/мл соответственно; значение коэффициента вариации не превышает 4% в обеих лабораториях. Концентрация ГА, определенная методом электрофореза в ДСН-ПААГ в лаборатории № 1, сопоставима с данными ОРИД (123,6 мкг/мл). Содержание вспомогательных веществ (глицерин, сахароза) не превышает 55 мкг/мл в РВК и не влияет на результаты определения белка.

ВЫВОДЫ. Установлены оптимальные условия электрофореза в ДСН-ПААГ для аттестации первичного жидкого СО содержания ГА вируса гриппа, что позволяет получать результаты, сопоставимые с данными метода ОРИД. На следующем этапе исследования планируется апробация условий пробоподготовки и количественного определения всех типов ГА (H1N1, H3N2, В), актуальных в сезоне 2025–2026 гг.

ВВЕДЕНИЕ. Гликановый профиль — критический параметр качества лекарственных средств (ЛС) на основе моноклональных антител (МкАТ), контроль которого обязателен при разработке и выпуске каждой серии ЛС. Актуальность работы обусловлена необходимостью разработки воспроизводимого протокола пробоподготовки для анализа гликанового профиля, адаптированного к условиям стандартной физико-химической лаборатории и не требующего применения коммерческих наборов ограниченной доступности.

ЦЕЛЬ. Разработать альтернативный способ пробоподготовки для количественной характеризации гликанового профиля терапевтических антител без использования коммерческих наборов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Объекты исследования — лекарственные средства на основе МкАТ: омализумаб, устекинумаб, канакинумаб, тоцилизумаб, натализумаб и иммуноглобулин класса G2, специфичный к рецептору PD-1. N-гликаны отщепляли от МкАТ пептид-N-гликозидазой (ПНГаза F), затем присоединяли к ним флуоресцентные метки — 2-аминобензамид (2-АВ) или 2-аминобензойную кислоту (2-АА) или InstantAB и очищали пробы от посторонних примесей. Для анализа смесей гликанов использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию гидрофильного взаимодействия с детектированием флуоресценции (HILIC-FLD) на оборудовании Alliance e2695 и Acquity Arc Bio с детектором флуоресценции FLR 2475. Гликановый профиль оценивали по содержанию функциональных групп гликанов.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В работе подобраны следующие условия пробоподготовки N-гликанов терапевтических МкАТ: инкубация с 2 мЕД ПНГазой F на 100 мкг белка в 10 мМ трис-HCl (pH 8,0) в течение 3 ч при температуре 37 °C без предварительной денатурации белка; окрашивание гликанов 2-АА в течение 1,5 ч при 65 °C; удаление избытка красителя путем экстракции ацетонитрилом. Осаждение ацетонитрилом меченых 2-АА гликанов пригодно для очистки и концентрирования проб. Применение метода HILIC-FLD позволило определять в пробах минорные гликаны с содержанием до 0,1–0,2%. Сравнение наших данных с данными, полученными при использовании коммерческого набора, указало на приемлемую сопоставимость результатов хроматографического анализа. При пробоподготовке важно учитывать структурные особенности конкретных МкАТ, например для высокосиалированных МкАТ обоснован контроль десиалирования в процессе окрашивания.

ВЫВОДЫ. Разработанный способ пробоподготовки пригоден для анализа омализумаба, канакинумаба и натализумаба. Предложенные аналитические подходы к пробоподготовке будут также полезны при разработке методики анализа гликанового профиля других гликопротеинов с использованием метода HILIC-FLD.

ВВЕДЕНИЕ. Спонтанные мутации часто возникают и накапливаются в геноме РНК-содержащих вирусов, таких как вирусы кори, краснухи и паротита. Современные требования к производству вакцинных препаратов, содержащих живые вакцинные штаммы вирусов, предполагают контроль генетической стабильности производственных штаммов. Метод высокопроизводительного секвенирования позволяет выявить все мутации, возникшие в вирусной популяции, и оценить генетическую стабильность производственных штаммов.

ЦЕЛЬ. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов посевных и производственных штаммов вирусов кори (Ленинград-16), краснухи (RA-27/3) и паротита (Ленинград-3) в сравнении с референсными нуклеотидными последовательностями геномов вакцинных штаммов, депонированных ранее в базу данных GenBank.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали посевные вирусы и производственные штаммы вакцин: коревая культуральная живая, паротитная культуральная живая и вакцина против краснухи культуральная живая. Проведено полногеномное секвенирование с использованием генетических анализаторов MGI DNBSEQ G-400 и Illumina NextSeq2000. Для обработки и анализа данных секвенирования использовали программы и инструменты FastQC v.0.12.1, FastP v.0.23.4, BWA-MEM2 v.2.2.1, VizCoV.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Анализ распространения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) внутри вирусной популяции в исследованных образцах выявил ряд минорных вариантов, способных при дальнейшем накоплении привести к изменению консенсусных последовательностей белков вакцинных штаммов. В образцах вируса кори не выявлено полиморфизмов в белке Н, при этом обнаружен несинонимичный полиморфизм в белке F, встречающийся в 30,0–40,9% вирусных геномов. В капсидном белке С и в поверхностном гликопротеине Е2 вируса краснухи выявлены полиморфизмы, встречающиеся в вирусной популяции с частотой до 30%. В поверхностных антигенах — гемагглютинин-нейраминидаза HN и белок слияния F вируса паротита обнаружены полиморфизмы, встречающиеся в геномах менее чем в 20% вирусной популяции. Мутации в геномах производственных штаммов, которые могли бы оказывать влияние на иммуногенность вакцин против кори, краснухи и паротита, не найдены.

ВЫВОДЫ. Выявленный набор минорных вариантов с частотой встречаемости в популяции более 10%, которые при дальнейшем накоплении могут привести к изменению консенсусных последовательностей вакцинных штаммов, актуализирует задачу контроля стабильности вакцинных штаммов методом высокопроизводительного секвенирования.

ВВЕДЕНИЕ. Мониторинг стабильности производства вакцины чумной живой критически важен для выпуска эффективного и безопасного лекарственного препарата. Перспективным инструментом для решения этой задачи служат контрольные карты Шухарта, позволяющие статистически оценить стабильность процесса по основному показателю качества — специфической активности (количество живых микробных клеток).

ЦЕЛЬ. Оценка стабильности производства вакцины чумной живой на основе ретроспективного анализа специфической активности (количество живых микробных клеток) серий вакцины с использованием контрольных карт Шухарта (X- и R-карт) и корреляционного анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Проведен ретроспективный анализ результатов контроля качества по показателю «Специфическая активность» 121 серии вакцины чумной живой, произведенной в Российской Федерации в 2012–2025 гг. Специфическая активность оценивалась по количеству живых микробных клеток (в процентах от общего количества). Статистическую оценку стабильности процесса выполняли методом контрольных карт Шухарта. Строили два типа карт: скользящих размахов (R-карты) для оценки однородности и индивидуальных значений анализируемых показателей (X-карты) для оценки стабильности процесса. Использовали данные сводных протоколов предприятия-производителя и результаты, полученные в Испытательном центре. Рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (r).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Анализ контрольных карт за 2012–2018 гг. выявил признаки статистической нестабильности технологического процесса на предприятии: на X- и R-картах зафиксированы тренды, выходящие за контрольные пределы (критерии особых причин), что потребовало корректирующих мероприятий. Данные за 2019–2025 гг., полученные после оптимизации технологического процесса, показали стабилизацию показателей: количество критериев особых причин сократилось, продолжительность периодов статистической управляемости процесса увеличилась. Корреляционный анализ выявил сильную прямую связь (r=0,7) между результатами предприятия-производителя и в Испытательном центре.

ВЫВОДЫ. Контрольные карты Шухарта являются эффективным инструментом статистического управления процессом производства лекарственных препаратов: их применение для оценки стабильности производства вакцины чумной живой показало, что модернизация технологического процесса способствовала переходу из статистически нестабильного состояния в управляемое. Высокая корреляция результатов предприятия-производителя и Испытательного центра (r=0,7) подтверждает надежность системы контроля качества и позволяет рекомендовать метод контрольных карт Шухарта для мониторинга стабильности производства вакцинных препаратов.