Оптимизация количественного определения гемагглютинина вируса гриппа в первичном жидком стандартном образце методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией

ВВЕДЕНИЕ. В отсутствие возможности использовать международный стандартный образец (СО) антигена и антисыворотку к нему для количественного определения содержания гемагглютинина (ГА) вируса гриппа методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), а также в условиях пандемии или другой чрезвычайной ситуации необходимы валидированные альтернативные методы для количественного определения ГА.

ЦЕЛЬ. Оптимизация методики аттестации первичного стандартного образца содержания гемагглютинина вируса гриппа с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом с последующей денситометрической обработкой гелей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Содержание ГА (%) в СО определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата (ДСН-ПААГ) в условиях воспроизводимости (2 лаборатории). Концентрацию ГА (мкг/мл) определяли с учетом содержания общего белка, которое определяли по методу Лоури. Метод ОРИД использовался для оценки правильности количественного определения ГА. Обработку изображений пластин, расчет квадратов диаметров колец преципитации и количества ГА в образцах проводили с помощью программного обеспечения CombiStats. Сахарозу и глицерин в вирусном и разведенном вирусном концентратах (РВК) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Добавление 0,072 мМ 2-меркаптоэтанола для обработки образцов позволяет исключить использование мочевины при проведении электрофореза в ДСН-ПААГ с дегликозилированием. Результаты определения концентрации ГА в РВК методом электрофореза в ДСН-ПААГ при использовании 4–12% бис-трис гелей в лаборатории № 1 практически совпадают с результатами лаборатории № 2 (4–20% трис-глициновые гели) — 135,8 и 135,5 мкг/мл соответственно; значение коэффициента вариации не превышает 4% в обеих лабораториях. Концентрация ГА, определенная методом электрофореза в ДСН-ПААГ в лаборатории № 1, сопоставима с данными ОРИД (123,6 мкг/мл). Содержание вспомогательных веществ (глицерин, сахароза) не превышает 55 мкг/мл в РВК и не влияет на результаты определения белка.

ВЫВОДЫ. Установлены оптимальные условия электрофореза в ДСН-ПААГ для аттестации первичного жидкого СО содержания ГА вируса гриппа, что позволяет получать результаты, сопоставимые с данными метода ОРИД. На следующем этапе исследования планируется апробация условий пробоподготовки и количественного определения всех типов ГА (H1N1, H3N2, В), актуальных в сезоне 2025–2026 гг.

1. Li C, Shao M, Cui X, et al. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 2010;38(2):284–9. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2009.12.004

2. Chen J, Liu Y, Tseng Y, Ma C. Better influenza vaccines: An industry perspective. J Biomed Sci. 2020;27(1):33. https://doi.org/10.1186/s12929-020-0626-6

3. Poland GA, Rottinghaus ST, Jacobson RM. Influenza vaccines: a review and rationale for use in developed and underdeveloped countries. Vaccine. 2001;19(17–19):2216–20. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(00)00448-5

4. Simonsen L, Taylor RJ, Viboud C, et al. Mortality benefits of influenza vaccination in elderly people: An ongoing controversy. Lancet Infect Dis. 2007;7(10):658–66. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(07)70236-0

5. Wood JM, Schild GC, Newman RW, Seagroatt V. An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: Application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines. J Biol Stand. 1977;5(3):237–47. https://doi.org/10.1016/S0092-1157(77)80008-5

6. Minor PD. Assaying the potency of influenza vaccines. Vaccines (Basel). 2015;3(1):90–104. https://doi.org/10.3390/vaccines3010090

7. Creskey MC, Smith DG, Cyr TD. Strain identification of commercial influenza vaccines by mass spectrometry. Anal Biochem. 2010;406(2):193–203. https://doi.org/10.1016/j.ab.2010.07.016

8. Williams T, Pirkle J, Barr J. Simultaneous quantification of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus using isotope dilution mass spectrometry. Vaccine. 2012;30(14): 2475–82. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.12.056

9. Tarasov M, Shanko A, Kordyukova L, Katlinski A. Characterization of inactivated influenza vaccines used in the Russian National immunization program. Vaccines (Basel). 2020;8(3):488. https://doi.org/10.3390/vaccines8030488

10. Engelhardt O, Edge C, Dunleavy U, et al. Comparison of single radial immunodiffusion, SDS-PAGE and HPLC potency assays for inactivated influenza vaccines shows differences in ability to predict immunogenicity of haemagglutinin antigen. Vaccine. 2018;36(29):4339–45. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.05.076

11. Ekimov A, Arunachalam A, Blake T, et al. Assessing the stability-indicating properties of alternative potency assays for inactivated influenza vaccine. Vaccine. 2023;41(32):4639–47. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2023.06.051

12. Hawksworth A, Jayachander M, Hester S, et al. Proteomics as a tool for live attenuated influenza vaccine characterization. Vaccine. 2020;38(4):868–77. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.10.082

13. Harvey R, Michelle H, James SR, et al. Application of deglycosylation to SDS PAGE analysis improves calibration of influenza antigen standards. Biologicals. 2012;40(1):96–9. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2011.12.009

14. Савина НН, Екимов АА, Трухин ВП и др. Тест-система для определения специфической активности вируса гриппа и способ получения препаратов к подтипам вируса гриппа типа А. Патент Российской Федерации № 2804067; 2023. EDN: ZSLHCA

15. Минеро АС, Рунова ОБ, Коротков МГ, Устинникова ОБ. Разработка методики количественного определения стабилизаторов углеводной природы в биологических лекарственных препаратах на основе метода ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием. Химико-фармацевтический журнал. 2024;58(3):54–9. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2024-58-3-54-59

16. Минеро АС, Рунова ОБ, Коротков МГ, Устинникова ОБ. Разработка методики ионообменной ВЭЖХ для количественного определения стабилизаторов углеводной природы в биологических лекарственных препаратах. Химико-фармацевтический журнал. 2023;57(4):59–64. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2023-57-4-59-64

17. Минеро АС, Рунова ОБ, Коротков МГ, Устинникова ОБ. Определение стабилизаторов углеводной природы в биологически активных препаратах. Патент Российская Федерация № 2816030; 2024. EDN: LWHOTF

18. Wood JM, Weir JP. Standardisation of inactivated influenza vaccines — Learning from history. Influenza Other Respir Viruses. 2018;12(2):195–201. https://doi.org/10.1111/irv.12543

19. Lai CC, Weng TC, Chen PL, et al. Development and characterization of standard reagents for cell-based prepandemic influenza vaccine products. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(9):2245–51. https://doi.org/10.1080/21645515.2020.1721223

20. Минеро АС, Рунова ОБ, Фадейкина ОВ и др. Разработка стандартного образца для количественной оценки стабилизаторов углеводной природы методом ионообменной ВЭЖХ. Биомедицина. 2025;21(1):26–33. https://doi.org/10.33647/2074-5982-21-1-26-33