biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2026-734biopreparat-734Research ArticleСтатьиОптимизация количественного определения гемагглютинина вируса гриппа в первичном жидком стандартном образце методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометриейQuantitative determination of influenza virus hemagglutinin in a primary liquid reference standard by polyacrylamide gel electrophoresis followed by densitometry: Method optimizationhttps://orcid.org/0000-0002-4064-2484ИванютинаН. Л.IvanutinaN. L.

Иванютина Наталья Леонидовна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Natalia L. Ivanutina

8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051

ivanutina@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5506-4496ДовбышС. И.DovbyshS. I.

Довбыш Степан Игоревич

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Stepan I. Dovbysh

8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051

https://orcid.org/0000-0001-8698-2890ВолковаР. А.VolkovaR. A.

Волкова Рауза Асхатовна, д-р биол. наук

Rauza A. Volkova, Dr. Sci. (Biol.)

https://orcid.org/0000-0003-2901-8688ЕкимовА. А.EkimovA. A.

Екимов Алексей Александрович

ул. Тестовская, д. 10, Москва, 123112

Aleksei A. Ekimov

10 Testovskaya St., Moscow 123112

https://orcid.org/0000-0002-3670-5614СавинаН. Н.SavinaN. N.

Савина Наталья Николаевна

ул. Свободы, д. 52, г. Красное Село, Санкт-Петербург, 198320

Natalya N. Savina

52 Svoboda St., Krasnoe Selo 198320, Saint Petersburg

https://orcid.org/0000-0003-0763-0884ЗайцеваЕ. С.ZaytsevaE. S.

Зайцева Елена Сергеевна

ул. Свободы, д. 52, г. Красное Село, Санкт-Петербург, 198320

Elena S. Zaytseva

52 Svoboda St., Krasnoe Selo 198320, Saint Petersburg

https://orcid.org/0000-0003-0026-7365МинероА. С.MineroA. S.

Минеро Анастасия Сальвадоровна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Anastasia S. Minero

8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051

https://orcid.org/0000-0002-0352-522XБутырскийА. Ю.ButyrskiyA. Yu.

Бутырский Алексей Юрьевич

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Aleksey Yu. Butirskiy

8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051

https://orcid.org/0009-0005-0478-1558МорозоваЕ. Н.MorozovaE. N.

Морозова Елена Николаевна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Elena N. Morozova

8/2 Petrovsky Blvd., Moscow 127051

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian FederationОбщество с ограниченной ответственностью «Нанолек»РоссияNanolek Limited Liability CompanyRussian FederationФедеральное государственное унитарное предприятие «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентстваРоссияSaint Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Sera and Enterprise for the Production of Bacterial PreparationsRussian Federation20260408202600Принято в печать (Online First)734Copyright © Иванютина Н.Л., Довбыш С.И., Волкова Р.А., Екимов А.А., Савина Н.Н., Зайцева Е.С., Минеро А.С., Бутырский А.Ю., Морозова Е.Н., 20262026Иванютина Н.Л., Довбыш С.И., Волкова Р.А., Екимов А.А., Савина Н.Н., Зайцева Е.С., Минеро А.С., Бутырский А.Ю., Морозова Е.Н.Ivanutina N.L., Dovbysh S.I., Volkova R.A., Ekimov A.A., Savina N.N., Zaytseva E.S., Minero A.S., Butyrskiy A.Y., Morozova E.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/734ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. В отсутствие возможности использовать международный стандартный образец (СО) антигена и антисыворотку к нему для количественного определения содержания гемагглютинина (ГА) вируса гриппа методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД), а также в условиях пандемии или другой чрезвычайной ситуации необходимы валидированные альтернативные методы для количественного определения ГА.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Оптимизация методики аттестации первичного стандартного образца содержания гемагглютинина вируса гриппа с использованием электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом с последующей денситометрической обработкой гелей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Содержание ГА (%) в СО определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилсульфата (ДСН-ПААГ) в условиях воспроизводимости (2 лаборатории). Концентрацию ГА (мкг/мл) определяли с учетом содержания общего белка, которое определяли по методу Лоури. Метод ОРИД использовался для оценки правильности количественного определения ГА. Обработку изображений пластин, расчет квадратов диаметров колец преципитации и количества ГА в образцах проводили с помощью программного обеспечения CombiStats. Сахарозу и глицерин в вирусном и разведенном вирусном концентратах (РВК) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Добавление 0,072 мМ 2-меркаптоэтанола для обработки образцов позволяет исключить использование мочевины при проведении электрофореза в ДСН-ПААГ с дегликозилированием. Результаты определения концентрации ГА в РВК методом электрофореза в ДСН-ПААГ при использовании 4–12% бис-трис гелей в лаборатории № 1 практически совпадают с результатами лаборатории № 2 (4–20% трис-глициновые гели) — 135,8 и 135,5 мкг/мл соответственно; значение коэффициента вариации не превышает 4% в обеих лабораториях. Концентрация ГА, определенная методом электрофореза в ДСН-ПААГ в лаборатории № 1, сопоставима с данными ОРИД (123,6 мкг/мл). Содержание вспомогательных веществ (глицерин, сахароза) не превышает 55 мкг/мл в РВК и не влияет на результаты определения белка.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Установлены оптимальные условия электрофореза в ДСН-ПААГ для аттестации первичного жидкого СО содержания ГА вируса гриппа, что позволяет получать результаты, сопоставимые с данными метода ОРИД. На следующем этапе исследования планируется апробация условий пробоподготовки и количественного определения всех типов ГА (H1N1, H3N2, В), актуальных в сезоне 2025–2026 гг.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. In the absence of an international reference standard for the antigen and the corresponding antiserum for quantifying influenza virus hemagglutinin (HA) content by single radial immunodiffusion (SRID), as well as during pandemics or other emergencies, validated alternative methods for HA quantification are required.

AIM

AIM. Optimization of the method for certifying a primary reference standard for quantification of influenza virus hemagglutinin using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by densitometric analysis of the gels.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. The HA content (%) in the reference standard was determined by SDS-PAGE under reproducibility conditions (two laboratories). HA concentration (µg/mL) was calculated from the total protein content determined by the Lowry method. The SRID method was used to evaluate the accuracy of HA quantification. The CombiStats software was used for plate image processing, calculation of the squared diameters of precipitation rings, and determination of HA content in the samples. Sucrose and glycerol in the virus concentrate and the diluted virus concentrate (DVC) were quantified by high-performance liquid chromatography.

RESULTS

RESULTS. When performing SDS-PAGE with deglycosylation, the addition of 0.072 mM 2-mercaptoethanol for sample processing eliminates the need for urea. The HA concentrations in DVC determined by SDS-PAGE using 4–12% Bis-Tris gels in Laboratory 1 (135.8 µg/mL) and 4–20% Tris-glycine gels in Laboratory 2 (135.5 µg/mL) were virtually identical; the coefficient of variation did not exceed 4% in either laboratory. The HA concentration determined by SDS-PAGE in Laboratory 1 was comparable to the SRID data (123.6 µg/mL). The content of excipients (glycerol and sucrose) in DVC did not exceed 55 µg/mL and did not affect the results of protein determination.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. Optimal SDS-PAGE conditions were established for certifying a primary liquid reference standard for quantification of influenza virus HA, yielding results comparable to those of the SRID method. The next phase of the study will involve testing the sample preparation conditions and quantification methods for all HA types (H1N1, H3N2, and B) relevant to the 2025–2026 season.

гемагглютининвирус гриппаДСН-ПААГэлектрофорезОРИДдегликозилированиевакцинастандартизациястандартный образецhemagglutinininfluenza virusSDS-PAGEelectrophoresisSRIDdeglycosylationvaccinestandardizationreference standardРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00061-26-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 124022200103-5).The study was conducted by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00061-26-00 (R&D State Registration No. 124022200103-5).ReferencesLi C, Shao M, Cui X, et al. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 2010;38(2):284–9. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2009.12.004Li C, Shao M, Cui X, et al. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 2010;38(2):284–9. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2009.12.004Chen J, Liu Y, Tseng Y, Ma C. Better influenza vaccines: An industry perspective. J Biomed Sci. 2020;27(1):33. https://doi.org/10.1186/s12929-020-0626-6Chen J, Liu Y, Tseng Y, Ma C. Better influenza vaccines: An industry perspective. J Biomed Sci. 2020;27(1):33. https://doi.org/10.1186/s12929-020-0626-6Poland GA, Rottinghaus ST, Jacobson RM. Influenza vaccines: a review and rationale for use in developed and underdeveloped countries. Vaccine. 2001;19(17–19):2216–20. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(00)00448-5Poland GA, Rottinghaus ST, Jacobson RM. Influenza vaccines: a review and rationale for use in developed and underdeveloped countries. Vaccine. 2001;19(17–19):2216–20. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(00)00448-5Simonsen L, Taylor RJ, Viboud C, et al. Mortality benefits of influenza vaccination in elderly people: An ongoing controversy. Lancet Infect Dis. 2007;7(10):658–66. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(07)70236-0Simonsen L, Taylor RJ, Viboud C, et al. Mortality benefits of influenza vaccination in elderly people: An ongoing controversy. Lancet Infect Dis. 2007;7(10):658–66. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(07)70236-0Wood JM, Schild GC, Newman RW, Seagroatt V. An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: Application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines. J Biol Stand. 1977;5(3):237–47. https://doi.org/10.1016/S0092-1157(77)80008-5Wood JM, Schild GC, Newman RW, Seagroatt V. An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: Application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines. J Biol Stand. 1977;5(3):237–47. https://doi.org/10.1016/S0092-1157(77)80008-5Minor PD. Assaying the potency of influenza vaccines. Vaccines (Basel). 2015;3(1):90–104. https://doi.org/10.3390/vaccines3010090Minor PD. Assaying the potency of influenza vaccines. Vaccines (Basel). 2015;3(1):90–104. https://doi.org/10.3390/vaccines3010090Creskey MC, Smith DG, Cyr TD. Strain identification of commercial influenza vaccines by mass spectrometry. Anal Biochem. 2010;406(2):193–203. https://doi.org/10.1016/j.ab.2010.07.016Creskey MC, Smith DG, Cyr TD. Strain identification of commercial influenza vaccines by mass spectrometry. Anal Biochem. 2010;406(2):193–203. https://doi.org/10.1016/j.ab.2010.07.016Williams T, Pirkle J, Barr J. Simultaneous quantification of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus using isotope dilution mass spectrometry. Vaccine. 2012;30(14): 2475–82. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.12.056Williams T, Pirkle J, Barr J. Simultaneous quantification of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus using isotope dilution mass spectrometry. Vaccine. 2012;30(14): 2475–82. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.12.056Tarasov M, Shanko A, Kordyukova L, Katlinski A. Characterization of inactivated influenza vaccines used in the Russian National immunization program. Vaccines (Basel). 2020;8(3):488. https://doi.org/10.3390/vaccines8030488Tarasov M, Shanko A, Kordyukova L, Katlinski A. Characterization of inactivated influenza vaccines used in the Russian National immunization program. Vaccines (Basel). 2020;8(3):488. https://doi.org/10.3390/vaccines8030488Engelhardt O, Edge C, Dunleavy U, et al. Comparison of single radial immunodiffusion, SDS-PAGE and HPLC potency assays for inactivated influenza vaccines shows differences in ability to predict immunogenicity of haemagglutinin antigen. Vaccine. 2018;36(29):4339–45. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.05.076Engelhardt O, Edge C, Dunleavy U, et al. Comparison of single radial immunodiffusion, SDS-PAGE and HPLC potency assays for inactivated influenza vaccines shows differences in ability to predict immunogenicity of haemagglutinin antigen. Vaccine. 2018;36(29):4339–45. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.05.076Ekimov A, Arunachalam A, Blake T, et al. Assessing the stability-indicating properties of alternative potency assays for inactivated influenza vaccine. Vaccine. 2023;41(32):4639–47. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2023.06.051Ekimov A, Arunachalam A, Blake T, et al. Assessing the stability-indicating properties of alternative potency assays for inactivated influenza vaccine. Vaccine. 2023;41(32):4639–47. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2023.06.051Hawksworth A, Jayachander M, Hester S, et al. Proteomics as a tool for live attenuated influenza vaccine characterization. Vaccine. 2020;38(4):868–77. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.10.082Hawksworth A, Jayachander M, Hester S, et al. Proteomics as a tool for live attenuated influenza vaccine characterization. Vaccine. 2020;38(4):868–77. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.10.082Harvey R, Michelle H, James SR, et al. Application of deglycosylation to SDS PAGE analysis improves calibration of influenza antigen standards. Biologicals. 2012;40(1):96–9. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2011.12.009Harvey R, Michelle H, James SR, et al. Application of deglycosylation to SDS PAGE analysis improves calibration of influenza antigen standards. Biologicals. 2012;40(1):96–9. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2011.12.009Савина НН, Екимов АА, Трухин ВП и др. Тест-система для определения специфической активности вируса гриппа и способ получения препаратов к подтипам вируса гриппа типа А. Патент Российской Федерации № 2804067; 2023. EDN: ZSLHCASavina NN, Ekimov AA, Trukhin VP, et al. Test system for determining specific activity of influenza virus and method for its obtaining. Patent of the Russian Federation No. 2804067; 2023 (In Russ.). EDN: ZSLHCAМинеро АС, Рунова ОБ, Коротков МГ, Устинникова ОБ. Разработка методики количественного определения стабилизаторов углеводной природы в биологических лекарственных препаратах на основе метода ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием. Химико-фармацевтический журнал. 2024;58(3):54–9. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2024-58-3-54-59Minero AS, Rounova OB, Korotkov MG, Ustinnikova OB. Development of a method for quantitative determination of carbohydrate stabilizers in biologics based on HPLC with refractometric detection. Pharm Chem J. 2024;58(3):512–8. https://doi.org/10.1007/s11094-024-03172-4Минеро АС, Рунова ОБ, Коротков МГ, Устинникова ОБ. Разработка методики ионообменной ВЭЖХ для количественного определения стабилизаторов углеводной природы в биологических лекарственных препаратах. Химико-фармацевтический журнал. 2023;57(4):59–64. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2023-57-4-59-64Minero AS, Rounova OB, Korotkov MG, Ustinnikova OB. Development of an ion-exchange HPLC technique for quantitative determination of carbohydrate stabilizers in biological medicinal products. Pharm Chem J. 2023;57(4):578–83 (In Russ.). https://doi.org/10.1007/s11094-023-02923-zМинеро АС, Рунова ОБ, Коротков МГ, Устинникова ОБ. Определение стабилизаторов углеводной природы в биологически активных препаратах. Патент Российская Федерация № 2816030; 2024. EDN: LWHOTFMinero AS, Rounova OB, Korotkov MG, Ustinnikova OB. Determination of carbohydrate stabilizers in biologically active preparations. Patent of the Russian Federation No. 2816030; 2024 (In Russ.). EDN: LWHOTFWood JM, Weir JP. Standardisation of inactivated influenza vaccines — Learning from history. Influenza Other Respir Viruses. 2018;12(2):195–201. https://doi.org/10.1111/irv.12543Wood JM, Weir JP. Standardisation of inactivated influenza vaccines — Learning from history. Influenza Other Respir Viruses. 2018;12(2):195–201. https://doi.org/10.1111/irv.12543Lai CC, Weng TC, Chen PL, et al. Development and characterization of standard reagents for cell-based prepandemic influenza vaccine products. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(9):2245–51. https://doi.org/10.1080/21645515.2020.1721223Lai CC, Weng TC, Chen PL, et al. Development and characterization of standard reagents for cell-based prepandemic influenza vaccine products. Hum Vaccin Immunother. 2020;16(9):2245–51. https://doi.org/10.1080/21645515.2020.1721223Минеро АС, Рунова ОБ, Фадейкина ОВ и др. Разработка стандартного образца для количественной оценки стабилизаторов углеводной природы методом ионообменной ВЭЖХ. Биомедицина. 2025;21(1):26–33. https://doi.org/10.33647/2074-5982-21-1-26-33Minero AS, Rounova OB, Fadeikina OV, et al. Certified reference material for quantitative evaluation of carbohydrate stabilizers by ion exchange HPLC. Journal Biomed. 2025;21(1):26–33 (In Russ.). https://doi.org/10.33647/2074-5982-21-1-26-33

The authors declare that there are no conflicts of interest present.