Разработка и валидация методики пептидного картирования инновационного препарата ингибитора С1 эстеразы

Пептидное картирование является одним из ключевых методов изучения первичной структуры белка. Метод чувствителен даже к малейшим изменениям в ковалентной структуре белка, что позволяет использовать его для проверки подлинности препарата на стадии контроля и мониторинга стабильности производственного процесса.

Цель работы: разработка и валидация методики пептидного картирования для подтверждения подлинности инновационного высокогликозилированного рекомбинантного белка — ингибитора С1 эстеразы.

Материалы и методы: рекомбинантный ингибитор С1 эстеразы человека, трипсин. Исследование проводили методом пептидного картирования с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и метода масс-спектрометрии высокого разрешения. Результаты оценивали с применением статистических методов расчета среднего арифметического, стандартного отклонения, коэффициента вариации. Методику валидировали по показателям: специфичность, прецизионность и устойчивость.

Результаты: апробированы разные варианты пробоподготовки трипсинолизатов, включая дополнительную обработку белка N-гликаназой и полное дегликозилирование. Подобраны условия пробоподготовки и хроматографического разделения пептидов ингибитора С1 эстеразы с получением стабильного профиля пептидной карты. Разработаны и определены реперные пики, а также диапазоны их относительных времен удерживания и относительной площади. Абсолютное время удерживания второго (референтного) пика составило 16,5–16,9 мин. Относительное время удерживания пика 9 — 2,14–2,21, пика 12 — 2,55–2,64, пика 14 — 2,97–3,14, пика 15 — 3,11–3,29 и пика 28 — 6,20–6,63.

Выводы: разработана методика пептидного картирования ингибитора С1 эстеразы. Оптимизация условий методики позволила сократить время пробоподготовки более чем на 18 ч. Разработанная методика по валидационным характеристикам специфичности, прецизионности и устойчивости соответствовала установленным критериям приемлемости.

1. Lalonde ME, Durocher Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. J Biotechnol. 2017;251:128–40. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028

2. Qian C, Niu B, Jimenez R, Wang J, Albarghouthi M. Fully automated peptide mapping multi-attribute method by liquid chromatography-mass spectrometry with robotic liquid handling system. J Pharm Biomed Anal. 2021;198:113988. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2021.113988

3. Bongers J, Cummings JJ, Ebert MB, Federici MM, Gledhill L, Gulati D, et al. Validation of a peptide mapping method for a therapeutic monoclonal antibody: what could we possibly learn about a method we have run 100 times J Pharm Biomed Anal. 2000;21(6):1099–128. https://doi.org/10.1016/s0731-7085(99)00181-8

4. Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS peptide mapping protocol for the NISTmAb. Anal Bioanal Chem. 2018;410(8):2111–26. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0848-6

5. Allen D, Baffi R, Bausch J, Bongers J, Costello M, Dougherty J Jr, et al. Validation of peptide mapping for protein identity and genetic stability. Biologics and Biotechnology Section, Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Biologicals. 1996;24(3):255–74. https://doi.org/10.1006/biol.1996.0034

6. Andersen N, Vampola L, Jain R, Alvarez M, Chamberlain S, Hilderbrand A, et al. Rapid UHPLC-HRMS peptide mapping for monoclonal antibodies. American Pharmaceutical review. 2014.

7. Xu CF, Wang Y, Bryngelson P, Sosic Z, Zang L. Sequence variant and posttranslational modification analysis during cell line selection via high-throughput peptide mapping. Adv Exp Med Biol. 2019;1140:225–36. https://doi.org/10.1007/978-3-030-15950-4_12

8. Beinrohr L, Harmat V, Dobó J, Loörincz Z, Gál P, Závodszky P. C1 inhibitor serpin domain structure reveals the likely mechanism of heparin potentiation and conformational disease. J Biol Chem. 2007;282(29):21100–9. https://doi.org/10.1074/jbc.M700841200

9. Keating GM. Human C1-esterase inhibitor concentrate (Berinert). BioDrugs. 2009;23(6):399–406. https://doi.org/10.2165/11201100-000000000-00000

10. Ruddy S, Manning MC, Holcomb RE. C1-INH compositions and methods for the prevention and treatment of disorders associated with C1 esterase inhibitor deficiency. Patent of the USA US9616111B2; 2015.

11. Stavenhagen K, Kayili HM, Holst S, Koeleman CAM, Engel R, Wouters D, et al. N- and O-glycosylation analysis of human C1-inhibitor reveals extensive mucin-type O-glycosylation. Mol Cell Proteomics. 2018;17(6):1225–38. https://doi.org/10.1074/mcp.RA117.000240

12. Устинникова ОБ, Волкова РА, Мовсесянц АА, Меркулов ВА, Бондарев ВП. Рекомендации по аттестации стандартных образцов для подтверждения подлинности структуры рекомбинантных терапевтических белков. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(2):218–25. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-2-218-225

13. Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959;82(1):70–7. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6

14. Riener CK, Kada G, Gruber HJ. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4’-dithiodipyridine. Anal Bioanal Chem. 2002;373(4–5):266–76. https://doi.org/10.1007/s00216-002-1347-2

15. Winther JR, Thorpe C. Quantification of thiols and disulfides. Biochim Biophys Acta. 2014;1840(2):838–46. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.03.031

16. Zubareva E, Degterev M, Kazarov A, Zhiliaeva M, Ulyanova K, Simonov V, et al. Physicochemical and biological characterization of rhC1INH expressed in CHO cells. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(11):1180. https://doi.org/10.3390/ph14111180

17. Голощапова ЕО, Минеро АС, Рунова ОБ, Устинникова ОБ. Разработка методики пептидного картирования для оценки подлинности рекомбинантного интерферона бета-1b. Биофармацевтический журнал. 2021;13(1):21–6. https://doi.org/10.30906/2073-8099-2021-13-1-21-26

18. Устинникова ОБ, Голощапова ЕО, Рунова ОБ, Коротков МГ, Волкова РА. Разработка порядка аттестации стандартного образца метиониновой формы интерферона альфа-2b для подтверждения подлинности методом пептидного картирования. Медицинская иммунология. 2018;20(4):543–50. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-4-543-550