Сравнительный анализ красителей, используемых при оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима биологическим методом in vitro

При оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима отечественных и зарубежных производителей биологическим методом in vitro применяются различные виды красителей. Для унификации методики с использованием клеточной культуры, позволяющей оценивать специфическую активность филграстима, важен выбор одного из красителей, используемых для окрашивания клеток. Цель работы: сравнительное изучение красителей тетразолиевого и резазуринового рядов в испытаниях по определению способности филграстима активировать пролиферацию чувствительных клеток. Материалы и методы: использовали клеточную линию NFS-60 (клетки миелолейкоза мышей), 2-й Международный стандарт гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (МСО), красители МТТ, MTS, WST-1, alamarBlue. Оценку пролиферативной активности клеток проводили в условиях in vitro. Уровень пролиферации клеток учитывали по интенсивности флуоресценции или абсорбции. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin Pro 9.1. и приложения Microsoft Excel. Результаты: приведена сравнительная характеристика наиболее часто используемых красителей. Описана процедура выбора оптимальных условий проведения испытания с некоторыми из изучаемых красителей. Для анализа потенциальной возможности влияния на конечный результат рассмотрены такие факторы, как продолжительность инкубации клеточной суспензии с МСО и с красителем, состав лизирующего буфера (для окрашивания с помощью МТТ) и различные режимы считывания. Несмотря на то что все изученные красители в заданных условиях испытания позволили получить воспроизводимые кривые «доза–эффект», значения 50% эффективных концентраций статистически значимо не отличались только между испытаниями с использованием трех красителей: МТТ, MTS и alamarBlue (р > 0,05). Выводы: лучшая воспроизводимость результатов была получена в испытаниях с использованием МТТ и alamarBlue. Более простая и менее продолжительная процедура испытания с alamarBlue, отсутствие стадии лизиса клеток и необходимости применения дополнительных реагентов позволяет рекомендовать этот краситель для унификации методики, проводимой в связи с разработкой проекта общей фармакопейной статьи.

1. Аникина ЛВ, Пухов СА, Дубровская ЕС, Афанасьева СВ, Клочков СГ. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ и ресазурина. Фундаментальные исследования. 2014;(12-7):1423–7.

2. Лягоскин ИВ, Берестовой МА, Потеряев ДА, Зейналова ЭС, Вишневский АЮ, Казаров АА. Валидация XTT-теста для оценки антипролиферативной активности препаратов на основе моноклональных антител. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015;(1):45–50.

3. Präbst K, Engelhardt H, Ringgeler S, Hübner H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and resazurin. In: Gilbert FD, Friedrich O. Cell Viability Assays (Methods and Protocols). Methods in Molecular Biology. Vol. 1601. New York: Humana Press; 2017. P. 1–17. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6960-9_1

4. Stoddart JM. Cell viability assays: Introduction. In: Stoddart JM, eds. Mammalian Cell Viability (Methods and Protocols).Methods in Molecular Biology. Vol. 740. New York: Humana Press; 2011. P. 1–6. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-108-6_1

5. Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochem. 2018;120(3):159–67. https://doi.org/10.1016/j.acthis.2018.02.005

6. Мотузова ЕВ, Алпатова НА, Гайдерова ЛА, Рунова ОБ, Волкова РА, Мыца ЕД и др. Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца активности филграстима. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016;16(3):172–8.

7. Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018:095505. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505

8. Bopp SK, Lettieri T. Comparison of four different colorimetric and fluorometric cytotoxicity assays in a zebrafish liver cell line. BMC Pharmacol. 2008;8:8. https://doi.org/10.1186/1471-2210-8-8

9. van Tonder A, Joubert AM, Cromarty D. Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 2015;8:47. https://doi.org/10.1186/s13104-015-1000-8

10. Berridge MV, Herst PM, Tan An S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:127–52. https://doi.org/10.1016/S1387-2656(05)11004-7

11. Tiwari K, Wavdhane M, Haque S, Govender T, Kruger GH, Mishra M, et al. A sensitive WST-8-based bioassay for PEGylated granulocyte colony stimulating factor using the NFS-60 cell line. Pharm Biol. 2015;53(6):849–54. https://doi.org/10.3109/13880209.2014.943248

12. Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of cell viability by the alamarBlue assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018:095489. https://doi.org/10.1101/pdb.prot095489

13. Lall N, Henley-Smith CJ, De Canha MN, Oosthuizen CB, Berrington D. Viability reagent, PrestoBlue, in comparison with other available reagents, utilized in cytotoxicity and antimicrobial assays. Int J Microbiol. 2013;2013:420601. https://doi.org/10.1155/2013/420601