ВВЕДЕНИЕ. Гликановый профиль — критический параметр качества лекарственных средств (ЛС) на основе моноклональных антител (МкАТ), контроль которого обязателен при разработке и выпуске каждой серии ЛС. Актуальность работы обусловлена необходимостью разработки воспроизводимого протокола пробоподготовки для анализа гликанового профиля, адаптированного к условиям стандартной физико-химической лаборатории и не требующего применения коммерческих наборов ограниченной доступности.

ЦЕЛЬ. Разработать альтернативный способ пробоподготовки для количественной характеризации гликанового профиля терапевтических антител без использования коммерческих наборов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Объекты исследования — лекарственные средства на основе МкАТ: омализумаб, устекинумаб, канакинумаб, тоцилизумаб, натализумаб и иммуноглобулин класса G2, специфичный к рецептору PD-1. N-гликаны отщепляли от МкАТ пептид-N-гликозидазой (ПНГаза F), затем присоединяли к ним флуоресцентные метки — 2-аминобензамид (2-АВ) или 2-аминобензойную кислоту (2-АА) или InstantAB и очищали пробы от посторонних примесей. Для анализа смесей гликанов использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию гидрофильного взаимодействия с детектированием флуоресценции (HILIC-FLD) на оборудовании Alliance e2695 и Acquity Arc Bio с детектором флуоресценции FLR 2475. Гликановый профиль оценивали по содержанию функциональных групп гликанов.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В работе подобраны следующие условия пробоподготовки N-гликанов терапевтических МкАТ: инкубация с 2 мЕД ПНГазой F на 100 мкг белка в 10 мМ трис-HCl (pH 8,0) в течение 3 ч при температуре 37 °C без предварительной денатурации белка; окрашивание гликанов 2-АА в течение 1,5 ч при 65 °C; удаление избытка красителя путем экстракции ацетонитрилом. Осаждение ацетонитрилом меченых 2-АА гликанов пригодно для очистки и концентрирования проб. Применение метода HILIC-FLD позволило определять в пробах минорные гликаны с содержанием до 0,1–0,2%. Сравнение наших данных с данными, полученными при использовании коммерческого набора, указало на приемлемую сопоставимость результатов хроматографического анализа. При пробоподготовке важно учитывать структурные особенности конкретных МкАТ, например для высокосиалированных МкАТ обоснован контроль десиалирования в процессе окрашивания.

ВЫВОДЫ. Разработанный способ пробоподготовки пригоден для анализа омализумаба, канакинумаба и натализумаба. Предложенные аналитические подходы к пробоподготовке будут также полезны при разработке методики анализа гликанового профиля других гликопротеинов с использованием метода HILIC-FLD.