ВВЕДЕНИЕ. Пассивная иммунотерапия с использованием антител широкого спектра действия является перспективным направлением разработки новых лекарственных средств для борьбы с гриппом. Однако технологии получения, очистки и хранения рекомбинантных антител, пригодных для клинического применения, по-прежнему сопряжены со значительными трудностями. scFv-фрагменты антител (одноцепочечные вариабельные фрагменты) являются более простой, надежной и гибкой альтернативой полноразмерным аналогам антител.

ЦЕЛЬ. Разработка экспрессионных конструкций для синтеза scFv-фрагментов рекомбинантных антител к вирусу гриппа А и В, получение белковых препаратов scFv и оценка их функциональной активности in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Экспрессионные конструкции, кодирующие scFv-фрагменты антител, получали методом ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров и методами генной инженерии. Построение 3D-моделей разработанных scFv-фрагментов проводили по первичной аминокислотной последовательности на сервере AlfaFold. Наработку антител проводили в клеточной линии HEK293 в ходе транзиентной экспрессии. Препараты антител очищали из культуральной жидкости методом металл-аффинной хроматографии. Иммуноферментный анализ (ИФА) использовали для изучения вирус-специфической активности антител. Вируснейтрализующую активность антител изучали на монослойной культуре клеток MDCK по цитопатическому действию и регистрировали в реакции гемагглютинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ. На основе рекомбинантных антител, специфичных к вирусу гриппа А и В, был осуществлен дизайн и предсказана пространственная структура scFv-фрагментов, получены три генетические конструкции для экспрессии белков scFv в культуре эукариотических клеток. scFv-фрагменты были наработаны и очищены методом аффинной хроматографии с никелевым сорбентом в количестве не менее 0,5 мг и концентрации около 1 мг/мл каждого. Методом электрофореза белков в полиакриламидном геле было подтверждено соответствие выделенных scFv-фрагментов ожидаемому значению молекулярной массы — около 28 кДа. Методом ИФА было показано специфическое связывание scFv-фрагментов с различными штаммами вируса гриппа А и B. Установлено, что 50% вируснейтрализующая доза scFv-фрагмента антитела к поверхностному гемагглютинину вируса гриппа (170 нг/мл) сопоставима с нейтрализующей дозой для исходного полноразмерного антитела (179 нг/мл).

ВЫВОДЫ. Разработан дизайн и получены scFv-фрагменты двух антител, одного — обладающего широкой нейтрализующей активностью против вируса гриппа A, другого — специфичностью в отношении вируса гриппа В. Благодаря малым размерам scFv-фрагменты могут эффективно проникать через слизистые оболочки при интраназальном введении. Указанное свойство определяет потенциал использования scFv-фрагментов в экстренной профилактике и ранней терапии ОРВИ. Перспективным направлением для усиления нейтрализующей активности является создание биспецифических scFv-фрагментов, способных одновременно нацеливаться на два вирусных эпитопа.