Применение метода детекции антителозависимого усиления инфекции in vitro на примере вируса Чикунгунья

ВВЕДЕНИЕ

Среди вирусов, которые могут вызывать антителозависимое усиление инфекции (antibody-dependent enhacement, ADE), есть представители нескольких семейств Flaviviridaе, Coronaviridae, Arteriviridae, Retroviridae, Pneumoviridae [1–7], Filoviridae [8][9]. Общепринято, что для ADE необходим «сенсибилизирующий» первичный иммунный ответ, каковыми могут быть предшествующие инфекции гомологичными или близкородственными вирусами. ADE является комплексным феноменом, и то, как наличие предшествующих антител (АТ) влияет на течение вирусной инфекции, зависит от множества факторов, среди которых штамм вируса, доза заражения, взаимодействие между АТ и рецепторами клеток, комплементарным компонентом, а также стехиометрия «вирус–антитело», класс и специфичность АТ [2][10]. Феномен ADE впервые был описан для арбовирусных инфекций в 1960-х годах [11], а детальное изучение феномена было начато S.B. Halsted с соавт. для инфекции, вызываемой вирусом денге (ДенВ) [1][12]. В ранних исследованиях было продемонстрировано, что увеличение продукции вируса связано с взаимодействием иммунных комплексов и Fc-рецепторов (FcR) клетки [1][13]. По мнению S.B. Halsted с соавт., именно этот механизм приводит к превращению легкого самоограниченного заболевания в синдром повышенной проницаемости сосудов, который, в свою очередь, является основным патофизиологическим механизмом развития геморрагической лихорадки / синдрома шока при инфекции, вызываемой ДенВ [14].

В настоящее время механизм ADE, опосредуемый через FcR на поверхности клеток, принято считать основным [2][15–17], не исключая роль комплимента и других менее значимых факторов. Для взаимодействия с Fc-частью иммуноглобулина G (IgG) наиболее важным является Fcγ рецептор (FcγR) иммунных клеток [3][15][18][19]. На поверхности клеток человека присутствуют три типа FcγR: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), на клетках мышей еще распознается и FcγRIV [17].

При вирусных инфекциях ADE имеет два основных пути, которые приводят к увеличению продукции вируса. Первый путь представляет собой усиленное поглощение вируса фагоцитарными клетками, что приводит к увеличению количества инфицированных клеток (extrinsic ADE). Второй путь представляет собой усиленное внутриклеточное размножение вируса в результате модулирования эффекторных функций клетки и блокировки противовирусной защиты (intinsic ADE) [14][20][21]. В обоих случаях, по мнению многих исследователей, FcγR является ключевым рецептором на поверхности клеток, включая макрофаги, эозинофилы, нейтрофилы, дендритные клетки, В-клетки и тучные клетки, который способствует усилению инфекции.

Феномен ADE при ДенВ достаточно давно изучается in vitro с применением линий клеток, экспрессирующих FcγR [22–25]. Так, например, линия клеток K562 является FcγRII-экспрессирующей и достаточно широко применяется для исследования феномена ADE не только при инфекции ДенВ, но и при инфекции вирусом Чикунгунья (ЧикВ) [26] и вирусом Зика [6]. Используемые для оценки нейтрализующих анти-ДенВ АТ клетки Vero (рекомендации Всемирной организации здравоохранения¹) не позволяют оценить эффекторные функции Fc, так как клетки линии Verо являются FcR-негативными. Это объясняет, почему использование только метода реакции нейтрализации недостаточно, чтобы определить, является ли иммунный ответ исключительно протективным [19]. Так, проведенные сравнительные исследования вируснейтрализующих анти-ДенВ АТ в сыворотке крови с применением FcR-негативных клеток линии Vero и FcR-экспрессирующих линий клеток демонстрируют существенную разницу в результатах [14][27–29]. Исследования подтвердили специфичность феномена ADE для разного типа клеток и зависимости от генетики хозяина [13][27]. Разработка методов оценки in vitro риска развития ADE подтвердила возможность проведения анализа у пациентов со вторичной ДенВ-инфекцией как по уровню инфицирования [23], по инфекционному титру [1][22], так и по количеству инфекционных центров [23]. У вакцинированных риск развития ADE впервые был оценен при проведении клинических исследований тетравалентной вакцины против ДенВ. Анализ был проведен in vitro с использованием сывороток от вакцинированных по уровню инфицирования клеток линии K562 с помощью цитофлуометрического метода [30].

Цель работы — применение метода детекции антителозависимого усиления in vitro с использованием клеток линий К562 и Vero, а также штамма вируса Чикунгунья Nika21.

В работе использовали охарактеризованные сыворотки пациентов, перенесших инфекцию ЧикВ. Титр ЧикВ определяли с помощью стандартного метода титрования вируса in vitro, а количество РНК ЧикВ — с помощью флуоресцентного метода (ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени). Параллельно проводили сравнительное изучение репликации ЧикВ в клетках FcR-негативной линии Vero.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы. В работе был использован штамм Nika21 (генотип ECSA), полученный из коллекции вирусов ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова». Нуклеотидная последовательность штамма Nika21 представлена в GenBank (OQ320495). Характеристики ЧикВ, используемого для экспериментов, представлены в таблице S1 (онлайн-приложение опубликовано на сайте журнала²). Все работы проводили с соблюдением действующих санитарных норм и правил³ и в соответствии с протоколом, одобренным локальным этическим комитетом ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» № 17/2025 от 25.11.2020.

Клетки. В экспериментах использовались клеточные линии Vero и К562. Клетки линии Vero получены из банка посевных клеток ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова». Клетки линии Vero использовали на уровне 145-го пассажа. Клетки линии К562 (хроническая миелогенная лейкемия человека) получены из банка клеток ООО «БиолоТ» (Россия). В качестве среды поддержки для клеток Vero использовали среду DMEM (ООО «БиолоТ») с 5% эмбриональной телячьей сывороткой — ЭТС (ООО «БиолоТ»). Для клеток линии К562 в качестве среды поддержки использовали RPMI 1640 с 10% ЭТС в соответствии с паспортом производителя (ООО «БиолоТ»).

Клетки линии К562 обладают слабыми адгезивными свойствами [23], и их обычно культивируют суспензионным способом, однако небольшая часть этих клеток проявляет полуадгезивные свойства. Нами была повторена ранее описанная процедура селективного пассирования полуадгезивных клеток К562 [23]. В дальнейшем при проведении исследований для увеличения прикрепления этих клеток к поверхности культуральных планшетов использовали поли-L-лизин («ПанЭко», Россия) в соответствии с протоколом⁴ компании Ibidi GmbH (Германия). Клетки двух линий культивировались при 37±1 °С с содержанием 5% СO₂.

Сыворотки. В исследовании использовали сыворотки, содержащие анти-ЧикВ АТ (IgG), но не содержащие АТ к вирусам ДенВ, ЗикВ и вирусу желтой лихорадки (ЖЛВ). Получение сывороток, а также определение в них специфических АТ методами иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции нейтрализации (РН) по 50% подавлению бляшек описано ранее [31]. РН проводили по ранее описанному методу [32]. В качестве контроля использовались сыворотки крови здоровых добровольцев, не содержащие АТ к вышеперечисленным вирусам. Все используемые сыворотки были проверены на наличие специфических РНК к ЧикВ, ДенВ, ЗикВ и ЖЛВ методом ПЦР, как описано ранее [31][33]. Результаты анализа сывороток представлены в таблице S2 (онлайн-приложение опубликовано на сайте журнала⁵).

Определение биологического титра ЧикВ проводили с использованием линии клеток Vero по ранее описанному методу [32]. Кратко: для проведения титрования использовали 24-луночные планшеты со сформированным монослоем клеток. Готовили десятикратные разведения ЧикВ от 10^–1 до 10^–9 в питательной среде DМЕМ; на анализ одного разведения ЧикВ использовали 3 лунки; в каждую лунку вносили по 100 мкл каждого разведения ЧикВ. В контрольные лунки вносили по 100 мкл среды DMEM. Далее планшеты инкубировали в условиях термостата при 37±1 °С и 5% СO₂ в течение 1 ч. Затем неадсорбировавшийся вирус удаляли и на клетки наносили первое покрытие в объеме 0,5 мл, которое содержало 1,5% Noble Agar (Difco, США) и 10% ЭТС в среде Игла МЕМ с двойным набором витаминов и аминокислот («ПанЭко», Россия). Планшеты инкубировали в условиях термостата при 37±1 °С и 5% СО₂ в течение 4 сут. На 4 сут проводили второе покрытие в объеме 1 мл, которое содержало 1,5% Noble Agar (Difco) в среде Игла МЕМ с двойным набором витаминов и аминокислот («ПанЭко») с 0,01% нейтральным красным (Sigma, США). Плашки культивировали при ранее описанных условиях еще в течение 1 сут. Бляшки считали ad oculus. Результат титрования учитывали по бляшкообразующим единицам (БОЕ) и выражали его в lg/мл [32].

Определение содержания РНК ЧикВ проводили методом ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), как было описано ранее [34]. Для выделения РНК из образцов использовали комплект реагентов «АмплиСенс® Магно-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. Экстракцию РНК проводили в 50 мкл элюирующего раствора и хранили при минус 70 °С до дальнейшего использования. Амплификацию проводили на приборе «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 95 °С — 1 мин 30 с; 40 циклов: 95 °С — 15 с, 55 °С — 40 с. Содержание РНК ЧикВ оценивали по показателю порогового цикла флуоресценции (Ct). Расчет Ct проводили с использованием программного обеспечения к амплификатору «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Расчет геном-эквивалентов (ГЭ) проводили согласно описанию в работе [34].

Методика оценки ADE. Оценку ADE проводили, как описано ранее для ДенВ, c использованием клеток FcR-позитивной линии К562 и клеток FcR-негативной линии Vero для сравнительного анализа [35]. Кратко: для получения комплекса ЧикВ + АТ предварительно все сыворотки (табл. S2) были прогреты при 56 ºС в течение 30 мин. После этого были приготовлены три разведения каждой сыворотки: цельная (неразведенная), разведение 1:10 и 1:100. Далее каждое разведение сывороток смешивали с ЧикВ (титр 3 lg/мл БОЕ, что соответствовало множественности заражения, MOI, 1:10³ клеток) в объемном соотношении 1:1 (100 мкл сыворотки + 100 мкл вирусной суспензии). Контроль вируса представлял собой ЧикВ (титр 3 lg/мл БОЕ, MOI 1:10³ клеток) в объемном соотношении 1:1 со средой «Игла МЕМ».

Контроль «смесь» представлял собой ЧикВ и сыворотку здорового добровольца в объемном соотношении 1:1 (100 мкл сыворотки + 100 мкл вирусной суспензии). Далее все приготовленные образцы, включая контрольные, инкубировали при 37±1 ºС в течение 60 мин в соответствии с ранее описанными условиями [23]. По окончании инкубации образцы переносили на клетки линий Vero и К562. При использовании клеток линии Vero образцы переносили на заранее подготовленный монослой в лунках 24-луночного планшета и помещали в термостат при 37±1 °С на 2 ч. По окончании контакта в лунки добавляли по 1 мл соответствующей среды поддержки и помещали в термостат при 37±1 °С на 3 сут.

При использовании клеток линии К562 образцы в объеме 100 мкл смешивали со 100 мкл суспензии клеток и в термошейкере (скорость вращения 300 об/мин) снова помещали в термостат при 37±1 °С на 2 ч. По окончании контакта смесь в объеме 200 мкл переносили в лунки подготовленного, как описано выше, 24-луночного планшета, в которые добавляли соответствующую среду поддержки в объеме 1 мл, и далее помещали в термостат при 37±1 °С на 3 сут. Затем из лунок планшетов собирали жидкость объемом не менее 1 мл, переносили в пробирки и центрифугировали в течение 5 мин при 200 об/мин. После окончания центрифугирования собирали надосадочную жидкость, образцы которой использовали для исследования содержания РНК и определения биологического титра ЧикВ.

Значение суммы среднего значения БОЕ ЧикВ (М), полученного в контроле, и трехкратного значения стандартного отклонения (SD) использовали как пороговое. Усиление репликации ЧикВ, т.е. наличие ADE-феномена, считали подтвержденным, если значения биологического титра ЧикВ в присутствии исследуемой сыворотки были выше 3 SD относительно среднего количества БОЕ в контроле, т.е. выше рассчитанной границы в соответствии с ранее описанным методом оценки [23][36].

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016». Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD). Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента непарного, с двусторонним распределением (t-test). Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поскольку репликация ЧикВ в клетках линии К562 носит ограниченный по времени характер [37], до начала исследования было проведено изучение репликации в динамике как непосредственно ЧикВ, так и в смеси с контрольной сывороткой в обеих линиях клеток. Результаты проведенных исследований представлены в таблице S3 (онлайн-приложение опубликовано на сайте журнала⁶). ЧикВ в клетках К562 статистически достоверно размножался до максимальных значений на 2 и 3 сут, при этом разницы между 2 и 3 сут по всем показателям не обнаружено (p>0,5). На 5 сут репликация ЧикВ относительно данных на 2 и 3 сут достоверно снизилась. Поэтому в дальнейших экспериментах анализ титра ЧикВ проводили до 3 сут включительно как для клеток К562, так и клеток Vero. Все показатели, полученные на 3 сут при заражении клеток Vero, достоверно превосходили аналогичные на клетках К562 (табл. S3).

Для изучения влияния интактной сыворотки человека (контрольные образцы № 2 и 4) на репликацию ЧикВ в клетках обеих линий было проведено заражение клеток «смесью» интактной сыворотки и ЧикВ. Результаты (табл. S3) подтвердили отсутствие значимого влияния интактной сыворотки на репликацию ЧикВ (p>0,1) как для клеток линии К562, так и линии Vero. В дальнейшем для сравнительного анализа результатов ADE использовали контрольные образцы № 2 и 4 как наиболее адекватные контроли (табл. S3).

Для сравнительного анализа аналогичные эксперименты были проведены с использованием клеток линии Vero. Результаты исследования образцов сывороток с разными титрами специфических АТ к ЧикВ с использованием клеток линии Vero представлены в таблице 1.

Из представленных в таблице 1 данных следует, что нейтрализующая активность у исследуемых сывороток статистически достоверно сохранялась даже при максимальном разведении (1:100) и титр ЧикВ был статистически ниже, чем в соответствующем образце К4. Каждое последующее разведение иммунных сывороток приводило к соответствующему усилению репликации ЧикВ. Образцы сывороток № 2 и 3, имеющие одинаковые титры анти-ЧикВ АТ по результатам ИФА и РН, также не имели статистически значимых различий при разведении по всем показателям репликации ЧикВ. Для всех сывороток корреляция между показателями Ct и БОЕ была сильной отрицательной, r = минус 0,995.

Результаты исследования репликации ЧикВ в присутствии образцов сывороток с разными титрами специфических АТ к ЧикВ с использованием клеток линии К562 представлены в таблице 2.

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что все специфические сыворотки, независимо от титра в РН, в неразведенном состоянии обладали выраженными нейтрализующими свойствами, что подтверждено статистически достоверным снижением всех показателей репликации ЧикВ относительно соответствующих показателей образца К2. Образцы сывороток № 2 и 3, имеющие одинаковые титры анти-ЧикВ АТ по результатам РН, не имели статистически значимых различий по всем показателям репликации ЧикВ во всех разведениях. Сыворотка № 1 с максимальным титром анти-ЧикВ АТ сохраняла свои нейтрализующие свойства при всех разведениях. Следует отметить, что каждое последующее разведение сыворотки № 1 приводило к усилению репликации. Наиболее интересными были результаты исследования образцов сывороток № 2, 3 и 4 в промежуточном разведении 1:10. В данном разведении полученные результаты продемонстрировали максимальные показатели репликации ЧикВ, которые достоверно превышали таковые у соответствующих образцов контроля К2; также полученные показатели достоверно превышали показатели репликации ЧикВ последующего разведения сыворотки 1:100. При максимальном разведении 1:100 показатели репликации ЧикВ в присутствии всех сывороток были близки к соответствующим показателям К2 (p>0,01), что можно расценить как значительное снижение нейтрализующей активности, вплоть до ее отсутствия. Для всех сывороток корреляция между показателями Ct и БОЕ была сильной отрицательной: r = минус 0,899.

Усиление репликации ЧикВ в присутствии специфических сывороток, т.е. появление эффекта ADE, оценивали относительно пограничного уровня (М+3 SD), рассчитанного в соответствии с описанием в разделе «Методы», для биологического титра ЧикВ. Результаты оценки репликации ЧикВ по данным биологического титра в клетках линии Vero в присутствии специфических сывороток в разных разведениях представлены на рисунке 1А, а для клеток линии К562 — на рисунке 1В. Горизонтальные линии на рисунках обозначают пороговые значения, относительно которых анализировали активность исследуемых сывороток. Для клеток линии К562 диапазон пороговых значений репликации ЧикВ был рассчитан с учетом данных К2 для неразведенного образца, 4,61±(3×0,05) lg БОЕ/мл (табл. 2). Для клеток линии Vero диапазон пороговых значений репликации ЧикВ был рассчитан с учетом данных К4 для неразведенного образца, 8,50±(3×0,05) lg БОЕ/мл (табл. 1). Разграничение между усиливающей репликацию вируса (усиливающей инфекцию) и нейтрализующей вирус активностью сыворотки проводили, как описано ранее [23].

Титр ЧикВ выше верхней (пороговой) линии указывал на усиление репликации вируса, т.е. усиление инфекционной активности сыворотки. Титр ЧикВ ниже нижней пороговой линии указывал на нейтрализующую активность сыворотки. В экспериментах на клетках линии Vero (рис. 1) биологический титр ЧикВ в присутствии сывороток с разным титром АТ и в разных разведениях всегда оставался ниже нижнего порогового значения, несмотря на то что при каждом последующем разведении сыворотки титр вируса ЧикВ ожидаемо увеличивался. Таким образом, в клетках линии Vero эффект ADE не был зафиксирован. В клетках линии Vero присутствие сыворотки в любом разведении позволяло выявить только нейтрализующую активность специфических АТ.

В клетках линии К562 присутствие специфических АТ по-иному повлияло на репликацию ЧикВ. Сыворотка № 1 оказывала нейтрализующее действие во всех разведениях, т.е. все показатели биологического титра ЧикВ были ниже нижнего порогового значения. Все остальные сыворотки, № 2, 3 и 4, в неразведенном варианте проявили нейтрализующую активность; показатели биологического титра ЧикВ были ниже нижнего порогового значения. В разведении 1:10 образцы сывороток № 2, 3 и 4 статистически достоверно усиливали репликацию ЧикВ, что было подтверждено данными биологического титра, а также данными ОТ-ПЦР-РВ. Биологический титр ЧикВ превысил верхнее пограничное значение, т.е. был достоверно выше, чем у контрольного образца К2, а также титра ЧикВ соответствующего неразведенного образца (p<0,01), что в совокупности было расценено как эффект ADE. Следует отметить, что последующее разведение данных сывороток 1:100 привело к достоверному снижению титра ЧикВ, который оказался внутри диапазона пороговых значений, что свидетельствовало как об отсутствии усиления репликации ЧикВ, так и об отсутствии нейтрализующей активности специфической сыворотки. Для оценки уровня усиления репликации ЧикВ было рассчитано соотношение показателя биологического титра ЧикВ для К2 к показателю биологического титра ЧикВ для образцов сывороток № 2, 3 и 4 в разведении 1:10, как было предложено ранее [23][38]. Данные биологического титра были переведены в антилогарифмы; получены следующие результаты: для образца № 2 усиление биологического титра ЧикВ составило 142%, образца № 3 — 162% и образца № 4 — 166%.

Данные репликации ЧикВ, полученные методом ОТ-ПЦР-РВ, и соответственно данные ГЭ как зависимого показателя полностью повторяли изменения биологического титра ЧикВ во всех экспериментах.

ОБСУЖДЕНИЕ

Вирусы, для которых характерен феномен ADE, имеют общие признаки, а именно: частичная или исключительная репликация в макрофагах; индуцирование продукции большого количества АТ с низкой нейтрализующей активностью даже относительно гомологичного вируса и способность вызывать персистирующие инфекции, которые характеризуются длительно продолжающейся вирусемией. Антигенное разнообразие среди изолятов также является общей особенностью таких вирусов, что и делает их частично устойчивыми к нейтрализации АТ, вырабатываемыми против гетерологичных изолятов [39][40]. ЧикВ, как и ДенВ, относится к такой группе вирусов.

Для ДенВ проводятся многочисленные исследования эффекта ADE, особенно в свете необходимости создания эффективной и безопасной вакцины. Единственное, по нашим данным, исследование ADE при ЧикВ инфекции in vitro было проведено с использованием первичных клеток человека и клеточной линии макрофагов мыши RAW264.7 в присутствии специфических сывороток, с субнейтрализующими титрами АТ [26]. В данном исследовании показано, что ЧикВ инфицировал как первичные моноциты и В-клетки человека, так и мышиные клетки RAW264.7. Полученные результаты авторы объяснили тем, что клетки человека и мыши экспрессируют разные FcγR и поэтому, вероятно, имеют разные пути развития ADE.

Экспериментальная инфекция ЧикВ у трех-недельных мышей показала, что у особей с более низкими титрами ЧикВ-специфических АТ вирусная нагрузка была выше, а воспаление суставов выражено сильнее; а у мышей в возрасте 11 сут наличие низких титров АТ сопровождалось не только более высокой вирусной нагрузкой в мышцах, но и приводило к смерти животных [26]. Таким образом, F.M. Lum c соавт. [26] впервые экспериментально продемонстрировали, что АТ могут усиливать инфекцию ЧикВ. Было предположено, что ограниченная репликация ЧикВ, наблюдаемая в моноцитах и В-клетках человека, может быть формой «подрывной» деятельности ЧикВ для достижения хронизации патологического процесса [41]. Персистирующие артралгии после перенесенной инфекции ЧикВ можно объяснить развитием при определенных условиях ADE, как и у других «артритогенных» альфа-вирусов, таких как вирус Ross River [42][43].

Опираясь на опыт исследований феномена ADE при ДенВ in vitro, мы использовали клетки линии К562. Сравнительные исследования репликации ЧикВ в клетках линии Vero и K562 в нашей работе убедительно продемонстрировали специфичность феномена ADE. Репликация ЧикВ в клетках линии Vero в нашем эксперименте подтвердила высокую чувствительность данной линии клеток к вирусу и возможность использования ее исключительно для анализа нейтрализующей активности специфических АТ. Клетки FcR-экспрессирующей линии К562 позволили анализировать обе функции АТ: нейтрализующую вирус и активирующую вирусную инфекцию, а также позволили разграничить одну функцию от другой. Возможность проведения подобного рода исследований in vitro упрощает исследование феномена ADE в целом.

В представленной работе ADE был обнаружен в промежуточном разведении сывороток со средним или низким титром вируснейтрализующих анти-ЧикВ АТ. Феномен ADE, т.е. усиления репликации вируса, был ранее продемонстрирован для ДенВ в присутствии именно промежуточных разведений специфических сывороток. Длительное наблюдение за детской когортой, которая неоднократно сталкивалась с инфекцией ДенВ, показало, что низкие уровни АТ не усиливали болезнь, а высокие уровни могли успешно защитить от тяжелой формы заболевания. При этом именно промежуточные уровни анти-ДенВ АТ были связаны с ADE и тяжелым течением заболевания [44]. У вакцинированных препаратом Dengvaxia эффект ADE также был обнаружен в промежуточных разведениях сыворотки [30]. Эти исследования подчеркивают неоднозначность корреляции иммунных показателей с протективностью.

В течение достаточно длительного времени методы исследования ADE с использованием FcR-экспрессирующих клеток модифицировались и совершенствовались. Так, например, A. Yamanaka с соавт. [24] оценивали ADE по уровню инфицированных клеток линии К562 и вместо натурального вируса использовали химерные вирусные частицы на основе четырех штаммов ДенВ. Этот метод имел преимущество высокопроизводительного скрининга, но недостаточно имитировал условия in vivo, так как вирус в данном методе представлял собой рекомбинантный белок [24]. В другой экспериментальной работе было продемонстрировано, что только с использованием ДенВ, выделенного непосредственно от пациента, можно in vitro подтвердить вероятность развития ADE, в то время как при использовании рекомбинантного вируса результаты были неубедительными [45].

Как известно, размер вирусных частиц, а также количество и плотность расположения поверхностных антигенных детерминант у рекомбинантного штамма могут сильно отличаться от таковых у нативного вируса [16]. В нашем исследовании мы использовали нативный ЧикВ и, таким образом, исключили влияние структурных особенностей вируса на результат in vitro. Ряд исследователей оценивали ADE при инфекции ДенВ также по инфекционному титру, но при этом использовали специально созданную ими линию клеток BHK, экспрессирующую FcγRIIA [22][38][44]. В примененном нами подходе ADE оценивали в FcγRII-экспрессирующих клетках линии К562 по инфекционному (биологическому) титру ЧикВ и дополнительно по содержанию вирусной РНК. Преимуществом предложенного нами подхода является возможность оценить риск развития ADE стандартным методом прямого титрования бляшек (биологический титр вируса). Данные репликации ЧикВ, полученные в нашем исследовании методом ОТ-ПЦР-РВ и, соответственно, данные ГЭ как зависимого показателя полностью повторяли изменения биологического титра ЧикВ во всех экспериментах. По нашему мнению, при высокой корреляции показателей биологического титра вируса и показателей ОТ-ПЦР-РВ можно разработать критерии оценки ADE по результатам, полученным методом ОТ-ПЦР-РВ, что значительно ускорит и упростит проведение анализа. Безусловно, такой подход к оценке ADE потребует большой подготовительной работы.

Ранее M.L. Moi с соавт. [38] продемонстрировали, что концентрация АТ, а не соотношение между АТ и ДенВ, оказалась ключевым параметром для оценки усиления инфекции с помощью FcR-экспрессирующих клеток. Следует иметь в виду определенные различия в фоновом росте и пороге заражения разных вирусов или их серотипов при использовании той или иной линии клеток. В проведенном исследовании мы предварительно подобрали оптимальную дозу заражения ЧикВ (MOI — 1:10³ на клетку) для клеточной линии К562 и проанализировали динамику репликации ЧикВ двумя методами, затем изучили инфекционную активность ЧикВ в присутствии иммунных сывороток и таким образом продемонстрировали возможности данного подхода для анализа ADE.

Используя FcγRII-экспрессирующую линию клеток К562, мы опирались не только на опыт предыдущих исследователей, но и на тот факт, что внутриклеточная часть FcγRII является основной детерминантой в развитии ADE [19]. Известно, что связь между FcγR и комплексом вирус-АТ контролирует развитие ADE посредством поглощения иммунного комплекса и влияния на баланс между активацией и ингибированием FcγRI, FcγRII и FcγRIII. FcγRII является низкоаффинным рецептором и требует высокоаффинного соединения с комплексом «вирус-АТ». Если последнее условие по каким-то причинам невыполнимо, сформированный иммунный комплекс из-за низкого сродства с FcγRIIa высвобождается внутри клетки, что, в свою очередь, влияет на врожденный иммунитет, который может переключиться от противовирусного состояния к иммуносупрессии. Безусловно, фагоцитирующая клеточная линия может иметь значимые отличия от первичных клеток человека. Весьма вероятно, именно поэтому ADE при исследовании чаще регистрируют in vitro, чем in vivo [16].

Следует учитывать и другие возможные механизмы развития ADE. Например, комплемент-опосредованное ADE, развитие которого может быть синергично с FcγR, но может и быть самостоятельным. В нашем исследовании мы исключили влияние комплемента во всех использованных сыворотках путем их предварительного прогревания; ADE оценивали относительно контроля, который представлял собой не ЧикВ как таковой, а «смесь» ЧикВ с сывороткой крови здорового добровольца, расценив данный вариант контроля как наиболее адекватный.

Остается неясным, будет ли высокая активность ADE коррелировать с тяжестью заболевания. Для более детального изучения этой связи требуется проспективное когортное исследование, которое поможет прояснить, насколько эффективны используемые на данном этапе методы оценки ADE in vitro в прогнозировании риска тяжелого течения болезни у пациентов или вакцинированных [24]. Так, например, в исследованиях тетравалентной живой вакцины Dengvaxia (Sanofi Pasteur, Франция) после однократного применения у 113 детей с использованием 4-х серотипов ДенВ и клеток К562 в единичных случаях было обнаружен «минимальный уровень ADE» при использовании сыворотки в разведении 1:12, что, по мнению авторов, соответствовало состоянию in vivo. При более высоких разведениях сыворотки возникала корреляция между спектром АТ и одновременным падением титра АТ и соответственно риском развития ADE. В целом у 28 детей был обнаружен ADE при использовании в анализе одного или 2–3 серотипов ДенВ [30].

После анализа результатов III фазы клинических исследований Dengvaxia было отмечено, что только IV фаза и постмаркетинговое наблюдение смогут дать окончательный ответ, представляет ли ADE риск для реципиентов данной вакцины. В итоге в 2019 г. FDA (США) одобрило использование вакцины Dengvaxia только для детей в возрасте от 9 до 16 лет, которые ранее переболели лихорадкой денге и живут в районах, где это заболевание распространено, так как у детей, вакцинированных в возрасте от 2 до 5 лет, был выявлен риск госпитализации с тяжелой формой лихорадки денге в 8 раз чаще по сравнению с группой плацебо [46].

История применения тетравакцины против ДенВ компанией Sanofi Pasteur вызвала опасения по поводу ценности теста нейтрализации in vitro как прогностического показателя защиты in vivo и заставила менять подходы к оценке иммунологической безопасности разрабатываемых вакцин и продолжать работу над исследованием феномена ADE.

В Российской Федерации был предложен алгоритм доклинических исследований разрабатываемых вакцин с учетом оценки риска развития ADE, которому, по сути, мы и следовали в данной работе [47]. В представленном исследовании впервые в нашей стране не только предпринята попытка опробовать метод детекции ADE, используя клетки линии К562 и традиционный метод титрования вируса, но и проведена оценка риска развития ADE, используя сыворотки с разным титром специфических анти-ЧикВ АТ.

ВЫВОДЫ

1. Репликация вируса Чикунгунья в FcR-негативных клетках линии Vero подтвердила высокую чувствительность данной линии клеток к вирусу и возможность использования ее исключительно для оценки нейтрализующей активности специфических антител.
2. Клетки FcR-экспрессирующей линии К562 позволили анализировать обе функции антител: и нейтрализующую вирус, и активирующую инфекцию.
3. Результаты работы подтвердили возможность проведения исследований антителозависимого усиления инфекции in vitro, что значительно упрощает исследование данного феномена при оценке безопасности разрабатываемых вакцин.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены таблицы S1–S3.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-761-annex

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.В. Отрашевская — разработка дизайна исследования, проведение исследований, анализ и интерпретация результатов исследований, статистическая обработка, написание рукописи; Т.Г. Самарцева — проведение исследований, анализ и интерпретация результатов исследования; А.С. Оксанич — анализ результатов, критический анализ текста; С.С. Гогина — проведение исследований; В.В. Зверев — обсуждение концепции исследования, обобщение результатов исследования, критический пересмотр текста рукописи; Г.М. Игнатьев — обоснование концепции исследования, разработка дизайна исследований, непосредственное участие в выполнении работ, написание рукописи.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (протокол № 17/2025 от 25.11.2020).

Supplementary information. Tables S1–S3 are available on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-761-annex

Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. E.V. Otrashevskaja developed study design, conducted experiments and statistical analysis, analysed and interpreted the results, drafted the manuscript. T.G. Samartseva conducted the experiments, analysed and interpreted the results. A.S. Oksanich analysed and interpreted the results obtained, performed critical analysis of the manuscript. S.S. Gogina conducted the experiments. V.V. Zverev discussed the study concept, generalized of the results obtained, critically revised the manuscript. G.M. Ignatyev conceptualized the research, developed study design, conducted the experiments, and drafted the manuscript.

Ethics approval. The study protocol was approved by the local ethics committee of the I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (meeting minutes No. 17/2025 dated November 25, 2020).