Бифункциональные гибридные белки Z-mHoneydew и Z-CyOFP1 на основе Z-домена белка A Staphylococcus aureus для иммунофлуоресцентного анализа иммуноглобулинов G в сыворотке крови

ВВЕДЕНИЕ. Традиционные методы обнаружения иммуноглобулинов G (IgG) в сыворотке крови основаны на применении антител, химически конъюгированных с ферментными или флуоресцентными метками. Эффективность таких методов ограничивается стерическими помехами, возникающими в процессе химической конъюгации. В качестве альтернативы для иммунофлуоресцентного анализа IgG предложены бифункциональные гибридные белки Z-mHoneydew и Z-CyOFP1 на основе Z-домена белка A Staphylococcus aureus и ярких флуоресцентных белков mHoneydew и CyOFP1, которые сочетают способность связываться с IgG и интенсивную флуоресценцию, а их получение исключает этап химической конъюгации.

ЦЕЛЬ. Получение гибридных белков на основе Z-домена белка A для создания универсальных флуоресцентных реагентов для обнаружения IgG в сыворотке крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Генетические конструкции pCCO-Z-mHoneydew и pCCO-Z-CyOFP1 получали методами молекулярного клонирования в вектор pCCO. Экспрессию белков Z-mHoneydew и Z-CyOFP1 (~35 кДа) проводили в Escherichia coli штамм M15. Белки очищали аффинной хроматографией на Ni²⁺-NTA агарозе. Свойства белков изучали с использованием спектрофлуориметрии, иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунофлуоресцентного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Генетические конструкции pCCO-Z-mHoneydew и pCCO-Z-CyOFP1 под контролем промотора T5 кодируют гибридные белки со следующей структурой: Z-домен белка A — гибкий линкер (Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly) — флуоресцентный белок mHoneydew или CyOFP1 — гексагистидиновая метка. При экспрессии выход растворимых белков составил ~37 мг/л (Z-mHoneydew) и ~6 мг/л (Z-CyOFP1) с чистотой ≥90%. Максимумы возбуждения и эмиссии Z-mHoneydew зарегистрированы при длинах волн 480 и 536 нм соответственно со сдвигом эмиссии в синюю область на 26 нм относительно нативного mHoneydew (562 нм). Максимум возбуждения Z-CyOFP1 зарегистрирован при 515 нм со сдвигом в красную область на 18 нм относительно нативного CyOFP1 (497 нм) при сохранении максимума эмиссии. Методом ИФА показано дозозависимое связывание IgG c гибридными белками. Для Z-mHoneydew линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций от 30 до 235 нг/мкл (R²=0,96), а для Z-CyOFP1 — от 15 до 250 нг/мкл (R²=0,97), что подтверждает способность гибридных белков связываться с IgG. Данные иммунофлуоресцентного анализа указали на возможность обнаружения IgG, специфических к конъюгату бензо[а]пирена с бычьим сывороточным альбумином, в сыворотке крови кролика с использованием гибридных белков. Линейная зависимость для Z-mHoneydew наблюдалась в диапазоне разведений сыворотки 1:10–1:160 (R²=0,92), а для Z-CyOFP1 — 1:10–1:80 (R²=0,98), что свидетельствует о пригодности данных белков для обнаружения специфических антител в сыворотке крови.

ВЫВОДЫ. Гибридные белки Z-mHoneydew и Z-CyOFP1 сохраняют флуоресцентные свойства и способность связываться с IgG, в том числе с IgG сыворотки крови, что перспективно с точки зрения разработки прототипов универсальных иммунофлуоресцентных тест-систем.

1. Ghagane S, Puranik S, Gan S, et al. Frontiers of monoclonal antibodies: Applications in medical practices. Hum Antibodies. 2017;26(3):135–42. https://doi.org/10.3233/HAB-170331

2. Sidorin E, Solov’eva T. IgG-binding proteins of bacteria. Biochemistry (Mosc). 2011;76(3):295–308. https://doi.org/10.1134/s0006297911030023

3. Cruz A, Boer M, Strasser J, et al. Staphylococcal protein A inhibits complement activation by interfering with IgG hexamer formation. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118(7):e2016772118. https://doi.org/10.1073/pnas.2016772118

4. Goding J. Use of staphylococcal protein A as an immunological reagent. J Immunol Methods. 1978;(20):241–53. https://doi.org/10.1016/0022-1759(78)90259-4

5. Bao L, Yang A, Liu Z, et al. Development of a mammalian cell-based ZZ display system for IgG quantification. BMC Biotechnol. 2023;23(1):1–10. https://doi.org/10.1186/s12896-023-00798-2

6. Девдариани ЗЛ, Терешкина НЕ, Тараненко ТМ и др. Результаты модельных экспериментов по конструированию тест-системы иммуноферментной для выявления антител к Ф1 чумного микроба (ИФА-АТ-Ф1 Yersinia pestis). Проблемы особо опасных инфекций. 2013;(1):74–7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2013-1-74-77

7. Mazigi O, Schofield P, Langley D, Christ D. Protein A superantigen: structure, engineering and molecular basis of antibody recognition. Protein Eng Des Sel. 2019;32(8):359–66. https://doi.org/10.1093/protein/gzz026

8. Braisted A, Wells J. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Nat Acad Sci USA. 1996;93(12):5688–92. https://doi.org/10.1073/pnas.93.12.5688

9. Tashiro M, Tejero R, Zimmerman D, et al. High-resolution solution NMR structure of the Z domain of staphylococcal protein A. J Mol Biol. 1997;272(4):573–90. https://doi.org/10.1006/jmbi.1997.1265

10. Le Brun A, Shah D, Athey D, et al. Self-assembly of protein monolayers engineered for improved monoclonal immunoglobulin G binding. Int J Mol Sci. 2011;12(8):5157–67. https://doi.org/10.3390/ijms12085157

11. Viviani V, Silva J, Ho P. A novel brighter bioluminescent fusion protein based on ZZ domain and Amydetes vivianii firefly luciferase for immunoassays. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:755045. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.755045

12. Park J, Kim M, Jose J, Park M. Covalently immobilized regene­rable immunoaffinity layer with orientation-controlled antibodies based on Z-domain autodisplay. Int J Mol Sci. 2021;23(1):459. https://doi.org/10.3390/ijms23010459

13. Jeon D, Pyun J, Jose J, Park M. A regenerative immunoaffi­nity layer based on the outer membrane of Z-domains autodisplaying E. coli for immunoassays and immunosensors. Sensors (Basel). 2018;18(11):4030. https://doi.org/10.3390/s18114030

14. Hajdu T, Rebenku I, Serrano Cano T, et al. Fluorescence labeling-induced structural rearrangement of a monoclonal IgG revealed by biophysical experiments and simulations. Int J Biol Macromol. 2025;321(Pt 2):146209. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.146209

15. Witting E, Hober S, Kanje S. Affinity-based methods for site-specific conjugation of antibodies. Bioconjug Chem. 2021;32(8):1515–24. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.1c00313

16. Ji P, Wang K, Zhang L, et al. A new nanobody-enzyme fusion protein-linked immunoassay for detecting antibodies against influenza A virus in different species. J Biol Chem. 2022;298(12):102709. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102709

17. Yu K, Liu C, Kim B, Lee D. Synthetic fusion protein design and applications. Biotechnol Adv. 2015;33(1):155–64. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2014.11.005

18. Nienhaus K, Nienhaus G. Genetically encodable fluorescent protein markers in advanced optical imaging. Methods Appl Fluoresc. 2022;10(4):042002. https://doi.org/10.1088/2050-6120/ac7d3f

19. Liu M, Wang B, Wang F, et al. Soluble expression of single-chain variable fragment (scFv) in Escherichia coli using superfolder green fluorescent protein as fusion partner. Appl Microbiol Biotechnol. 2019;103(15):6071–9. https://doi.org/10.1007/s00253-019-09925-6

20. Lu Q, Li X, Zhao J, et al. Nanobody-horseradish peroxidase and -EGFP fusions as reagents to detect porcine parvovirus in the immunoassays. J Nanobiotechnology. 2020;18(1):7. https://doi.org/10.1186/s12951-019-0568-x

21. Ilgen P, Grotjohann T, Jans DC, et al. RESOLFT nanoscopy of fixed cells using a Z-domain based fusion protein for labelling. PLoS One. 2015;10(9):e0136233. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136233

22. Yu XT, Fu XY, Gao XY, et al. Fc-specific and covalent conjugation of a fluorescent protein to a native antibody through a photoconjugation strategy for fabrication of a novel photostable fluorescent antibody. Anal Bioanal Chem. 2021;413(3):945–53. https://doi.org/10.1007/s00216-020-03051-3

23. Глушков АН, Костянко МВ, Аносова ТП и др. Модель исследования иммунологических образов химических канцерогенов. Российский иммунологический журнал. 2007;1(3–4):246–50. EDN: SWMMFP

24. Костянко МВ, Глушков АН. Способ получения конъюгата гаптен-белок. Патент Российской Федерации № 2141114; 1998. EDN: JPYAJM

25. Shaner N, Campbell R, Steinbach P, et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 2004;22(12):1567–72. https://doi.org/10.1038/nbt1037

26. Chu J, Oh Y, Sens A, et al. A bright cyan-excitable orange fluorescent protein facilitates dual-emission microscopy and enhances bioluminescence imaging in vivo. Nat Biotechnol. 2016;34(7):760–7. https://doi.org/10.1038/nbt.3550

27. Гинцбург АЛ, Карягина-Жулина АС, Кормилицына МИ и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pTUL4spCBD] — продуцент рекомбинантного белка TUL4spCBD, рекомбинантный белок TUL4spCBD и способ его получения, способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD. Патент Российской Федерации № 2270249; 2006. EDN: VETEJD

28. Nandy S, Crum M, Wasden K, et al. Protein A-Nanoluciferase fusion protein for generalized, sensitive detection of immunoglobulin G. Anal Biochem. 2023;660:114929. https://doi.org/10.1016/j.ab.2022.114929

29. Huang QL, Chen C, Chen YZ, et al. Application to immunoassays of the fusion protein between protein ZZ and enhanced green fluorescent protein. J Immunol Methods. 2006;309(1–2):130–8. https://doi.org/10.1016/j.jim.2005.11.009

30. Chu J, Oh Y, Sens A, et al. A bright cyan-excitable orange fluorescent protein facilitates dual-emission microscopy and enhances bioluminescence imaging in vivo. Nat Biotechnol. 2016;34(7):760–7. https://doi.org/10.1038/nbt.3550

31. Bajar BT, Wang ES, Zhang S, et al. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Basel). 2016;16(9):1488. https://doi.org/10.3390/s16091488