Терапевтические гликопротеины: способ пробоподготовки для профилирования N-гликанов моноклональных антител

ВВЕДЕНИЕ. Гликановый профиль — критический параметр качества лекарственных средств (ЛС) на основе моноклональных антител (МкАТ), контроль которого обязателен при разработке и выпуске каждой серии ЛС. Актуальность работы обусловлена необходимостью разработки воспроизводимого протокола пробоподготовки для анализа гликанового профиля, адаптированного к условиям стандартной физико-химической лаборатории и не требующего применения коммерческих наборов ограниченной доступности.

ЦЕЛЬ. Разработать альтернативный способ пробоподготовки для количественной характеризации гликанового профиля терапевтических антител без использования коммерческих наборов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Объекты исследования — лекарственные средства на основе МкАТ: омализумаб, устекинумаб, канакинумаб, тоцилизумаб, натализумаб и иммуноглобулин класса G2, специфичный к рецептору PD-1. N-гликаны отщепляли от МкАТ пептид-N-гликозидазой (ПНГаза F), затем присоединяли к ним флуоресцентные метки — 2-аминобензамид (2-АВ) или 2-аминобензойную кислоту (2-АА) или InstantAB и очищали пробы от посторонних примесей. Для анализа смесей гликанов использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию гидрофильного взаимодействия с детектированием флуоресценции (HILIC-FLD) на оборудовании Alliance e2695 и Acquity Arc Bio с детектором флуоресценции FLR 2475. Гликановый профиль оценивали по содержанию функциональных групп гликанов.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В работе подобраны следующие условия пробоподготовки N-гликанов терапевтических МкАТ: инкубация с 2 мЕД ПНГазой F на 100 мкг белка в 10 мМ трис-HCl (pH 8,0) в течение 3 ч при температуре 37 °C без предварительной денатурации белка; окрашивание гликанов 2-АА в течение 1,5 ч при 65 °C; удаление избытка красителя путем экстракции ацетонитрилом. Осаждение ацетонитрилом меченых 2-АА гликанов пригодно для очистки и концентрирования проб. Применение метода HILIC-FLD позволило определять в пробах минорные гликаны с содержанием до 0,1–0,2%. Сравнение наших данных с данными, полученными при использовании коммерческого набора, указало на приемлемую сопоставимость результатов хроматографического анализа. При пробоподготовке важно учитывать структурные особенности конкретных МкАТ, например для высокосиалированных МкАТ обоснован контроль десиалирования в процессе окрашивания.

ВЫВОДЫ. Разработанный способ пробоподготовки пригоден для анализа омализумаба, канакинумаба и натализумаба. Предложенные аналитические подходы к пробоподготовке будут также полезны при разработке методики анализа гликанового профиля других гликопротеинов с использованием метода HILIC-FLD.

1. Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al. Essentials of glycobiology. 4th ed. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2022.

2. Mimura Y, Katoh T, Saldova R, et al. Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: Challenges for the safety, functionality and efficacy. Protein Cell. 2018;9(1):47–62. https://doi.org/10.1007/s13238-017-0433-3

3. Beck A, Debaene F, Diemer H, et al. Cutting-edge mass spectrometry characterization of originator, biosimilar and biobetter antibodies. J Mass Spectrom. 2015;50(2):285–97. https://doi.org/10.1002/jms.3554

4. Chirino AJ, Mire-Sluis A. Characterizing biological products and assessing comparability following manufacturing changes. Nat Biotechnol. 2004;22(11):1383–91. https://doi.org/10.1038/nbt1030

5. Zhou Q, Qiu H. The mechanistic impact of N-glycosylation on stability, pharmacokinetics, and immunogenicity of therapeutic proteins. J Pharm Sci. 2019;108(4):1366–77. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2018.11.029

6. Majewska N, Tejada ML, Betenbaugh MJ, Agarwal N. N-Glyco sylation of IgG and IgG-like recombinant therapeutic proteins: Why is it important and how can we control it? Annu Rev Chem Biomol Eng. 2020;11:311–38. https://doi.org/10.1146/annurev-chembioeng-102419-010001

7. Hajba L, Szekrényes Á, Borza B, Guttman A. On the glycosylation aspects of biosimilarity. Drug Discov Today. 2018;23(3):616–25. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2018.01.009

8. Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009;32(2):107–21. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2007.11.005

9. Boune S, Hu P, Epstein AL, Khawli LA. Principles of N-linked glycosylation variations of IgG-based therapeutics: Pharmacokinetic and functional considerations. Antibodies (Basel). 2020;9(2):22. https://doi.org/10.3390/antib9020022

10. Ikegami T. Hydrophilic interaction chromatography for the analysis of biopharmaceutical drugs and therapeutic peptides: A review based on the separation characteristics of the hydrophilic interaction chromatography phases. J Sep Sci. 2019;42(1):130–213. https://doi.org/10.1002/jssc.201801074

11. De Leoz MLA, Duewer DL, Fung A, et al. NIST interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods. Mol Cell Proteomics. 2020;19(1):11–30. https://doi.org/10.1074/mcp.RA119.001677

12. Cajic S, Hennig R, Grote V, et al. Removable dyes — the missing link for in-depth N-glycan analysis via multi-method approaches. Engineering. 2023;26(4):132–50. https://doi.org/10.1016/j.eng.2023.02.016

13. Kinoshita M, Yamada K. Recent advances and trends in sample preparation and chemical modification for glycan analysis. J Pharm Biomed Anal. 2021;207:114424. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2021.114424

14. Keser T, Paviс T, Lauc G, Gornik O. Comparison of 2-aminobenzamide, procainamide and rapifluor-MS as derivatizing agents for high-throughput HILIC-UPLC-FLR-MS N-glycan analysis. Front Chem. 2018;6:324. https://doi.org/10.3389/fchem.2018.00324

15. Kameyama A, Dissanayake SK, Thet Tin WW. Rapid chemical de-N-glycosylation and derivatization for liquid chromatography of immunoglobulin N-linked glycans. PLoS One. 2018;13(5):e0196800. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196800

16. Zhang Q, Lasanajak Y, Song X. Oxidative release of natural glycans: Unraveling the mechanism for rapid N-glycan glycomics analysis. Anal Chem. 2024;96(42):16750–7. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03246

17. Magnelli P, Guthrie E, Taron CH, et al. Deglycosylation reagents and methods. US Patent No. US 9964548 B2; 2018. https://patents.google.com/patent/US9964548B2/en

18. Tiwold EK, Gyorgypal A, Chundawat SPS. Recent advances in biologic therapeutic N-glycan preparation techniques and analytical methods for facilitating biomanufacturing automation. J Pharm Sci. 2023;112(6):1485–91. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2023.01.012

19. Anumula KR, Dhume ST. High resolution and high sensitivity methods for oligosaccharide mapping and characterization by normal phase high performance liquid chromatography following derivatization with highly fluorescent anthranilic acid. Glycobiology. 1998;8(7):685–94. https://doi.org/10.1093/glycob/8.7.685

20. Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, et al. Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem. 1995;230(2):229–38. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1468

21. Jeong YR, Kim SY, Park YS, Lee GM. Simple and robust N-glycan analysis based on improved 2-aminobenzoic acid labeling for recombinant therapeutic glycoproteins. J Pharm Sci. 2018;107(7):1831–41. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2018.03.013

22. Kimzey M, Gyenes A. Compounds for labeling amine-containing compounds, and their use. US Patent No. US 20180156809 A1; 2018. https://patents.google.com/patent/US20180156809A1/en

23. Brousmiche DW, Yu Y-Q, Lauber M. Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals. US Patent No. US 10436790 B2; 2014. https://patents.google.com/patent/US10436790

24. Baginski T. Compounds and methods for rapid labeling of N-glycans. US Patent No. US 8445292 B2; 2013. https://patents.google.com/patent/US8445292B2/en

25. Kimzey M. Use of mild electrophiles to reduce artifacts in analyzing glycans released from glycoproteins or glycopeptides. US Patent No. US 20190170763 A1; 2019. https://patents.google.com/patent/US20190170763A1/en

26. Stöckmann H, Duke RM, Millán Martín S, Rudd PM. Ultrahigh throughput, ultrafiltration-based n-glycomics platform for ultraperformance liquid chromatography (ULTRA(3)). Anal Chem. 2015;87(16):8316–22. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b01463

27. Kinoshita M, Nakatani Y, Yamada K, et al. A rapid and facile preparation of APTS-labeled Nglycans by combination of ion pair-assisted extraction and HILIC-SPE for routine glycan analysis. J Pharm Biomed Anal. 2021;195:113875. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113875

28. Pabst M, Kolarich D, Pöltl G, et al. Comparison of fluorescent labels for oligosaccharides and introduction of a new postlabeling purification method. Anal Biochem. 2009;384(2):263–73. https://doi.org/10.1016/j.ab.2008.09.041

29. Xie Y, Mota LM, Bergin A, et al. High-throughput and high-sensitivity N-glycan profiling: A platform for biopharmaceutical development and disease biomarker discovery. Anal Biochem. 2021;623:114205. https://doi.org/10.1016/j.ab.2021.114205

30. Trbojević-Akmačić I, Lageveen-Kammeijer GSM, Heijs B, et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 2022;122(20):15865–913. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.1c01031

31. Sun X, Tao L, Yi L, et al. N-glycans released from glycoproteins using a commercial kit and comprehensively analyzed with a hypothetical database. J Pharm Anal. 2017;7(2):87–94. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2017.01.004

32. Helali Y, Delporte C. Updates of the current strategies of labeling for N-glycan analysis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2024;1237:124068. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2024.124068

33. Aich U, Lakbub J, Liu A. State-of-the-art technologies for rapid and high-throughput sample preparation and analysis of N-glycans from antibodies. Electrophoresis. 2016;37(11):1468–88. https://doi.org/10.1002/elps.201500551

34. Reusch D, Haberger M, Maier B, et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles — part 1: Separation-based methods. MAbs. 2015;7(1):167–79. https://doi.org/10.4161/19420862.2014.986000

35. Segu Z, Stone T, Berdugo C, et al. A rapid method for relative quantification of N-glycans from a therapeutic monoclonal antibody during trastuzumab biosimilar development. mAbs. 2020;12(1):1750794. https://doi.org/10.1080/19420862.2020.1750794

36. Subedi GP, Barb AW. The structural role of antibody N-glycosylation in receptor interactions. Structure. 2015;23(9):1573–83. https://doi.org/10.1016/j.str.2015.06.015

37. Cantin G, Liu Q, Shah B, et al. Analytical and functional similarity of the biosimilar candidate ABP 654 to ustekinumab reference product. Drugs R D. 2023;23(4):421–38. https://doi.org/10.1007/s40268-023-00441-7

38. Alt N, Zhang TY, Motchnik P, et al. Determination of critical quality attributes for monoclonal antibodies using quality by design principles. Biologicals. 2016;44(5):291–305. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2016.06.005

39. Watanabe T, Inoue N, Kutsukake T, et al. Labeling conditions using a 2-aminobenzamide reagent for quantitative analysis of sialo-oligosaccharides. Biol Pharm Bull. 2000;23(3):269–73. https://doi.org/10.1248/bpb.23.269

40. Li M, Shen S, Letarte S, Flick T. Discovery and characterization of novel G0 glycan isomers in an afucosylated thera peutic antibody using liquid chromatography — mass spectro metry. J Am Soc Mass Spectrom. 2025;36(5):1034–40. https://doi.org/10.1021/jasms.4c00474

41. Аскретков АД, Шаталов ДО. Разработка методики определения профиля гликозилирования в субстанции экулизумаб и иных моноклональных антителах. В кн.: Марданлы СГ, Помазанов ВВ, Киселева ВА, ред. Перспективы внедрения инновационных технологий в медицине и фармации. Орехово-Зуево; 2021. C. 30–6. EDN: NCQEMC

42. Zhang Q, Azzam T, Lasanajak Y, et al. Oxidative release of natural glycans (ORNG): Preparation of truncated N-glycans for engineering glycoproteins. Chem Eur J. 2025;31:e202501020. https://doi.org/10.1002/chem.202501020