Разработка количественной иммуноферментной тест-системы для определения концентрации Е2 антигена вируса Чикунгунья и расчета массы цельновирионного антигена в культуральных образцах

ВВЕДЕНИЕ

Вирус Чикунгунья (ВЧИК) является представителем рода Alphavirus семейства Togaviridae. Вирус чаще всего передается людям через укусы комаров видов Aedes aegypti и Aedes albopictus при попадании вируса в слои эпидермиса и дермы кожи. Далее вирус реплицируется и распространяется в различные жизненно важные органы. Заражение ВЧИК обычно приводит к лихорадке, сыпи, миалгии и артралгии, которые могут длиться от нескольких недель до нескольких месяцев [1–3].

Геном ВЧИК представляет собой положительную одноцепочечную РНК (+ssRNA) размером около 12 тыс. нуклеотидов, содержащую 5’-метилгуанилатный кэп, полиаденилированный 3’-конец и две открытые рамки считывания. Геном ВЧИК кодирует четыре неструктурных белка (nsP1–4) и пять структурных белков (C, E3, E2, 6K и E1) [4][5]. ВЧИК — это сферическая частица диаметром 70 нм. Вирион состоит из белкового капсида и липопротеиновой оболочки хозяина.

У ВЧИК выделяют четыре генотипа: Азиатский (Asian), Западно-Африканский (West African, WAf), Восточно-Центральный Южно-Африканский (East/Central/South African, ECSA) и Восточно-Центральный Южно-Африканский — линия Индийского океана (East/Central/South African genotype, Indian Ocean Lineage, ECSA-IOL). Однако указанные генотипы не имеют четкой территориальной локализации, то есть на одной территории могут одновременно выявляться разные генотипы ВЧИК. После 2004 г. во время вспышек заболеваний, вызванных ВЧИК, на островах Индийского океана была выявлена эволюция линии генотипа ECSA, в которой аланин в положении 226 E1 гликопротеина был заменен на валин (E1-A226V). Эта замена, наряду со специфическими мутациями в Е2 белке, позволила переносить ВЧИК комарам вида Ae. albopictus. Комары вида Ae. albopictus, в отличие от Ае. aegypti, обладают более высокой способностью выживать в прохладных регионах. Таким образом, адаптация ВЧИК к Ae. albopictus как переносчику, вероятно, содействовала резкому распространению ВЧИК и может привести к дальнейшему расширению ареала вируса как в тропических, так и в нетропических регионах [5–7].

В последние годы инфекция ВЧИК была зарегистрирована в различных частях мира, включая регион Индийского океана, Европу, Ближний Восток и Тихоокеанский регион, тогда как ранее ВЧИК выявляли спорадически только в странах Африки и Азии. Широкое распространение ВЧИК представляет проблему для общественного здравоохранения и подчеркивает острую необходимость принятия мер предосторожности и изучения вариантов борьбы с инфекцией [8–10].

Профилактика и контроль распространения ВЧИК сопряжены с совершенствованием существующих диагностических подходов для правильного обнаружения различий между заболеваниями, вызванными ВЧИК, и другими лихорадками [11]. Возбудителями последних являются другие альфа-вирусы и, что наиболее важно, иные семейства арбовирусов, например вирусы денге и Зика, способные циркулировать в тех же географических регионах и вызывать схожие клинические симптомы, что и ВЧИК [12–14].

Обнаружение антигена может быть положено в основу одного из подходов для быстрого обнаружения ВЧИК в полевых образцах (экстракты комаров), поскольку присутствие антигена напрямую связано с присутствием вируса. В то же время при анализе полевых материалов можно также использовать реакцию обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-кПЦР-РВ). Этот метод обладает более высокой чувствительностью, но ограниченно применим в условиях экспедиций в предполагаемые вирусные очаги.

Е2 белок ВЧИК является потенциальным целевым антигеном для серодиагностики, который может стимулировать иммунный ответ у инфицированного и выработку высокого уровня специфических антител [3][4][11]. Таким образом, контроль вируссодержащих жидкостей (ВСЖ) имеет важное значение, поскольку они содержат Е2 антиген в виде рекомбинантного белка или цельновирионного антигена и используются при изготовлении вакцинных препаратов [15–18].

В настоящее время не существует специфической терапии против ВЧИК, но в 2024 г. была зарегистрирована первая живая аттенуированная вакцина Ixchiq® (Valneva Austria GmbH, Австрия)¹. Несмотря на появление вакцины, профилактика ВЧИК по-прежнему во многом зависит от использования мер индивидуальной защиты и борьбы с переносчиками, эффективность которых ограничена [19–22].

Цель работы — разработка количественной тест-системы на основе одностадийного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа для выявления Е2 антигена вируса Чикунгунья в культуральных жидкостях, а также методики расчета массы цельновирионного антигена в образце.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Вирусы. Для проведения исследования использовали вирусы Чикунгунья (штамм Nika21, генотип ECSA, GenBank ID PQ673601) и денге 2 типа [23], полученные из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова. При постановке ИФА и ОТ-кПЦР-РВ использовали образцы ВСЖ, содержащие ВЧИК (штамм Nika21), отобранные через 18, 24, 46 и 72 ч после заражения клеток Vero вирусом Чикунгунья, и образцы культуральной жидкости, содержащие вирус денге и отобранные через 46 ч после заражения клеток Vero вирусом денге 2 типа (множественность заражения 0,001 MOI²), в качестве отрицательного контроля.

Антигены. При проведении ИФА использовали инактивированные β-пропиолактоном экстракты мозговых антигенов новорожденных мышей, зараженных вирусами денге (1 тип — штамм Hawaii, 2 тип — New Guinea C (NGC), 3 тип — H-87, 4 тип — H241), желтой лихорадки (штамм 17D), Западного Нила (штамм Ast-986) и Синдбис (штамм 574). Инактивированные мозговые антигены были любезно предоставлены Биотехнологической компанией «Биосервис» (Россия). Также в исследовании использовали культуральные жидкости, содержащие ВЧИК (штамм Nika21) и вирус краснухи (штамм RA-27). Вирусы были получены из коллекции вирусов ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.

Клеточная линия Vero была получена из коллекции клеточных культур ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.

Рекомбинантный антиген. Для построения калибровочной прямой зависимости оптической плотности при длине волны 450 нм (ОП450) от концентрации Е2 антигена ВЧИК использовали коммерческий аффинно-очищенный рекомбинантный Е2 антиген ВЧИК (штамм SL-CK1, GenBank ID ADG95913.1), полученный в бакуловирусной системе экспрессии белка (Sino Biological, Китай). Белок включает в себя 352 аминокислоты и His-метку на C-конце (молекулярная масса белка 39,8 кДа). Пробы, содержащие Е2 антиген ВЧИК в концентрациях 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 нг/мл, использовали при построении калибровочной прямой для его количественной оценки в исследуемых образцах ВСЖ.

Моноклональные антитела. В работе использовали специфические к ВЧИК мышиные моноклональные антитела (МАт), полученные по классической гибридомной технологии и любезно предоставленные Биотехнологической компанией «Биосервис» (Россия). Всего были получены два препарата МАт, узнающие различные эпитопы Е2 белка ВЧИК. Одно МАт (клон МАт25) использовали для сорбции на 96-луночных планшетах, а второе (клон МАт26) было конъюгировано с пероксидазой хрена.

Методы

Подготовка иммуносорбента. На поверхности лунок 96-луночных ИФА-планшетов (кат. № 2592, Corning, США) с высоким уровнем сорбции (до 500 нг IgG/см²) адсорбировали МАт25 в концентрации 2 мкг/мл, разведенные в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), из расчета 100 мкл/лунка. Планшеты инкубировали в течение 16–18 ч при температуре 4 °C. После сорбции планшеты пятикратно промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,5) с добавлением 0,05% Твин-20 (ФСБ-Т), а затем поверхность лунок блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре 1% раствором казеина в ФСБ из расчета 200 мкл/лунка.

Положительный контрольный образец инактивированный (К⁺). В качестве положительного контрольного образца при постановке ИФА использовали рекомбинантный коммерческий Е2 антиген ВЧИК (Sino Biological, Китай), описание которого приведено выше.

Отрицательный контрольный образец инактивированный (К^–). В качестве отрицательного контроля при постановке ИФА использовали лизат интактной культуры клеток Vero.

Приготовление культуральной жидкости, содержащей вирус Чикунгунья. В экспериментах для получения ВСЖ использовали ВЧИК (штамм Nika21). Нуклеотидная последовательность штамма Nika21 депонирована в GenBank ID PQ673601³. Доза заражения ВЧИК составляла 0,0001 MOI, что соответствовало 100 ТЦД₅₀/100 мкл (ТЦД₅₀ — показатель тканевой цитопатической дозы, вызывающей гибель 50% клеток). Вирус наносили на монослой клеток линии Vero, выращенных в культуральных флаконах Corning® (США) площадью 25 см². Вирус адсорбировали в течение 1 ч, после чего во флаконы добавляли среду поддержки DMEM (ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН»), содержащую 2% фетальной эмбриональной сыворотки (Gibco, США). Флаконы находились в термостате в течение 3 сут при температуре 32 °С и с 5% содержанием СО₂, после чего полученную ВСЖ исследовали в ИФА или ОТ-кПЦР-РВ.

Пробоподготовка ВСЖ для ИФА и ОТ-кПЦР-РВ. В четыре пробирки добавляли по 500 мкл ВСЖ, в две из них вносили 25 мкл РНКазы («Биолот», Россия) до конечной концентрации 50 мкг/мл, а в остальные пробирки — 25 мкл ФСБ и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Образцы ВСЖ, обработанные и необработанные РНКазой, анализировали в ИФА в четырех повторах согласно разработанному нами протоколу. ОТ-кПЦР-РВ проводили в трех повторах, как это было описано ранее. По калибровочным прямым оценивали геном-эквиваленты на 1 мл по данным ОТ-кПЦР-РВ, и концентрацию Е2 белка по данным ИФА, а затем рассчитывали общую концентрацию вирусного антигена.

Протокол одностадийного сэндвич-варианта метода ИФА. При постановке ИФА все образцы вносили в лунки в двух повторах. Для анализа брали по 50 мкл исследуемых образцов культуральной жидкости, содержащей вирус Чикунгунья, и контрольных образцов в рабочем разведении, а также калибровочные пробы в концентрациях 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 нг/мл. Затем вносили по 50 мкл раствора конъюгата МАт26 с пероксидазой хрена в рабочем разведении. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 °С, после чего лунки пятикратно промывали ФСБ-Т. Затем в лунки вносили по 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) с пероксидом водорода и инкубировали при комнатной температуре (23–25 °С). Реакцию ИФА останавливали через 15 мин добавлением в лунки 50 мкл раствора 0,5 M серной кислоты и сразу определяли ОП450 с помощью микропланшетного спектрофотометра LisaScan EM (Erba Mannheim, Чехия) при длине волны сравнения 620 нм.

Выделение РНК из образцов ВСЖ проводили при помощи комплекта реагентов «АмплиСенс®Магно-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

ОТ-кПЦР-РВ. Для количественной оценки геном-эквивалентов (ГЭ) ВЧИК в ВСЖ использовали реакцию обратной транскрипции (ОТ) с последующей количественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-кПЦР-РВ) [23]. Для проведения реакций ОТ и ПЦР применяли реагенты НПК «Синтол» (Россия).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2016. Данные представлены в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения среднего (SD), где это было приемлемо. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью непарного двухстороннего t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. При построении калибровочных графиков рассчитывали коэффициент детерминации (R²) с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2016. Коэффициент корреляции Пирсона (r_xy) применяли для оценки связи между параметрами количественных методов.

Дизайн исследования

При оценке диагностических характеристик разработанной ИФА тест-системы для количественного определения Е2 антигена ВЧИК руководствовались требованиями ГОСТ 51352–2013⁴. Оценивали аналитическую чувствительность, специфичность, воспроизводимость и коэффициент вариации, проводили тесты на «линейность» и на «открытие» (метод добавок). После определения эффективности ИФА тест-системы проводили ее сравнение с ранее разработанным методом ОТ-кПЦР-РВ, для чего анализируемую ВСЖ разделяли на 4 пробирки. Образцы в первых двух пробирках обрабатывали РНКазой, а в остальных — обработку не проводили. Далее образцы анализировали методом ИФА и ОТ-кПЦР-РВ. Обработку РНКазой проводили для оценки только той РНК, которая находилась внутри вирионов; образцы без обработки РНКазой использовали в качестве сравнения. Исходя из данных о молекулярных массах вириона и Е2 белка ВЧИК пересчитывали установленные при помощи двух количественных методов геном-эквиваленты и массы Е2 белка в массу цельновирионного антигена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Количественное определение Е2 белка вируса Чикунгунья методом одностадийного сэндвич-варианта иммуноферментного анализа

Основной целью нашего исследования была разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения Е2 белка ВЧИК в культуральной жидкости с использованием двух МАт к различным эпитопам Е2 белка ВЧИК, одно из которых сорбировали на твердую фазу, а второе было конъюгировано с пероксидазой хрена. Принцип разработанной тест-системы основан на одновременном взаимодействии МАт25, адсорбированных на поверхности лунок ИФА-планшетов, и конъюгата МАт26 с пероксидазой хрена, с Е2 антигеном ВЧИК, присутствующим в образцах культуральной жидкости и калибровочных пробах. При добавлении раствора, содержащего хромоген TMБ и пероксид водорода, образуется окрашенный комплекс, что подтверждает связывание конъюгата с комплексом МАт25–Е2 антигена ВЧИК. Интенсивность окраски раствора, возникающей при остановке реакции, прямо пропорциональна концентрации Е2 белка ВЧИК в исследуемых образцах.

Существующие методы диагностики ВЧИК до сих пор имеют недостатки, несмотря на большое количество исследований в этой области. Совершенствование диагностики особенно актуально для раннего выявления вируса в острой фазе заболевания и в природных очагах [24][25]. Чувствительность и специфичность ИФА с захватом антигена зависят от качества самого антигена и мышиных моноклональных антител, используемых в экспериментах [26][27]. Поскольку недавние исследования показали, что большинство гуморальных реакций человека при инфекции ВЧИК направлено против E2 белка, то это свидетельствует о том, что основные нейтрализующие антитела имеют специфичность именно к этому белку [28]. Поверхностный Е2 антиген обычно входит в состав разрабатываемых вакцинных препаратов против ВЧИК. Для контроля их качества, а также расчета дозы в лекарственной форме необходима ИФА тест-система для количественного определения E2 белка ВЧИК.

Обширная перекрестная реактивность среди близкородственных представителей рода Alphavirus требует использования высокоселективных и специфических антител для дифференцирования вируса Чикунгунья от других альфа-вирусов с высокой степенью точности [29]. Таким образом, использование МАт является наиболее надежным вариантом для разработки оптимальных недорогих диагностических методов [30][31]. Иммуноферментные тест-системы, основанные на использовании МАт, имеют более высокую специфичность при дифференциальной диагностике вируса Чикунгунья, чем ИФА тест-системы, в которых применяют поликлональные антитела [32].

Определение количественного содержания антигенного Е2 белка ВЧИК в образцах культуральной жидкости

Для количественного определения Е2 белка ВЧИК в исследуемых образцах при каждой постановке ИФА использовали калибровочную прямую. Оптимальный диапазон концентраций калибруемых образцов (0,5–16 нг/мл Е2 белка) определяли путем титрования серии различных концентраций при условии R²≥0,99 (рис. 1).

Количественное содержание Е2 белка ВЧИК в исследуемых образцах культуральной жидкости определяли по уравнению линейной регрессии, выведенному по результатам титрования калибранта. Для расчета концентрации антигена в каждом из исследуемых образцов культуральной жидкости подставляли значения оптической плотности для каждого образца в уравнение линейной регрессии по формуле (1):

y = ax + b, (1)

где y — концентрация Е2 белка вируса Чикунгунья в исследуемых образцах (нг/мл); х — оптическая плотность исследуемых образцов при длине волны 450 нм; a и b — постоянные коэффициенты.

Полученное через уравнение линейной регрессии значение концентрации умножали на коэффициент разведения исследуемого образца, равный 10.

Оценка основных функциональных характеристик разработанной тест-системы

Оценку аналитической чувствительности, специфичности, воспроизводимости и других характеристик разработанной тест-системы проводили в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р 51352-2013.

Аналитическую чувствительность оценивали следующим образом. В лунки ИФА-планшета трех разных серий вносили нулевую калибровочную пробу в 8 повторах и калибровочные пробы, содержащие 0,5–16 нг/мл Е2 белка (рис. 1), и затем проводили ИФА согласно разработанному протоколу. По результатам калибровки строили калибровочный график и рассчитывали среднее значение ОП нулевой калибровочной пробы и стандартное отклонение. Подставляли полученные значения в формулу (2):

B₀ + 2σ, (2)

где B₀ — среднее значение оптической плотности нулевой калибровочной пробы; σ — стандартное отклонение оптической плотности нулевой калибровочной пробы.

Из полученного значения ОП проводили прямую, перпендикулярную оси абсцисс, до пересечения с калибровочным графиком; затем из точки пересечения проводили параллель на ось ординат. Соответствующая этому значению концентрация характеризовала аналитическую чувствительность метода. Эксперимент по аналитической чувствительности повторяли трижды и затем рассчитывали среднее значение (табл. S1, опубликована на сайте журнала⁵).

Таким образом, среднее значение аналитической чувствительности разработанной ИФА тест-системы составило 0,625 нг/мл.

Тест на «линейность» проводили на 3 сериях планшетов, для чего сформировали две группы разведений калибровочной пробы, содержащей Е2 белок ВЧИК. В первую группу были включены калибраторы с концентрациями 1,25, 2,5, 5 и 10 нг/мл, во вторую — 0,75, 1,5, 3 и 6 нг/мл Е2 белка. Затем сравнивали концентрации, полученные в ИФА (фактическое практическое значение) с рассчитанными концентрациями Е2 белка в этих разведенных пробах (теоретическое значение), и рассчитывали значение параметра «линейность» (Л) по формуле (3):

(3)

где С_ПР — полученное по калибровочному графику фактическое практическое значение концентрации анализируемого Е2 белка ВЧИК в исследуемой пробе; С_Т — расчетное теоретическое значение концентрации Е2 белка ВЧИК в исследуемой пробе.

Результаты теста на «линейность» представлены в таблице S2 (опубликована на сайте журнала⁶).

Экспериментально установлено, что тест на «линейность» разработанной ИФА тест-системы в диапазоне концентрации 1,5–16 нг/мл допустим в пределах 90–110%.

Коэффициент вариации. Для оценки коэффициента вариации (КВ) выбирали 3 различные концентрации Е2 белка ВЧИК в калибровочных пробах: 16 нг/мл (высокая), 8 нг/мл (средняя) и 2 нг/мл (низкая). ИФА проводили на трех сериях планшетов, анализируя пробы с исследуемыми значениями концентрации в 8 повторах. Затем рассчитывали КВ, разделив значение стандартного отклонения на среднее значение для каждой из трех концентраций по формуле (4):

(4)

где σ — стандартное отклонение оптической плотности анализируемой пробы, содержащей Е2 белок ВЧИК; X — среднее значение оптической плотности анализируемой пробы, содержащей Е2 белок ВЧИК; КВ — коэффициент вариации.

Результаты оценки КВ представлены в таблице S3 (опубликована на сайте журнала⁷).

Среднее значение КВ разработанной тест-системы составило 3,56%, что считается удовлетворительным, поскольку данное значение ниже 8%.

Тест на «открытие». Для проведения ИФА использовали один и тот же объем двух разных концентраций калибровочной пробы и, смешав их вместе, анализировали каждую смешанную пробу в 8 повторах. Эксперимент проводили на трех сериях планшетов, после чего рассчитывали значение параметра теста на «открытие» (ОТ) путем сравнения значения концентрации Е2 белка в калибровочных пробах (фактическое практическое значение) с рассчитанным теоретическим значением по формуле (5):

(5)

где С_ПР — полученное по калибровочному графику фактическое практическое значение концентрации анализируемого Е2 белка ВЧИК в исследуемой пробе; С_Т — расчетное теоретическое значение концентрации Е2 белка ВЧИК в исследуемой пробе. Результаты эксперимента приведены в таблице S4 (опубликована на сайте журнала⁸).

Тест на «открытие» разработанной ИФА тест-системы составил 100%.

Специфичность. Для оценки специфичности разработанной ИФА тест-системы изучали перекрестную реактивность с другими арбовирусами, передаваемыми комарами. В экспериментах использовали вирусы денге (1 тип — штамм Hawaii, 2 тип — New Guinea C, 3 тип — H-87, 4 тип — H241), желтой лихорадки (штамм 17D), Синдбис (штамм 574), краснухи (RA-27) и лихорадки Западного Нила (штамм Ast-986). В результате выполненного ИФА не наблюдали положительных реакций с перечисленными вирусами. Таким образом, специфичность разработанной тест-системы составила 100%.

По результатам проведенных тестов были определены значения следующих параметров текст-системы: аналитическая чувствительность — 0,625 нг/мл; тест на «линейность» — 90–110% в диапазоне концентраций 1,5–16 нг/мл Е2 белка ВЧИК; тест на «открытие» — 100%; среднее значение коэффициента вариации — 3,56%; специфичность — 100%. Оценка основных характеристик разработанной количественной ИФА тест-системы показывает, что она обладает высокой точностью, специфичностью и аналитической чувствительностью при выявлении Е2 белка вируса Чикунгунья.

Сравнение чувствительности методов ОТ-кПЦР-РВ и ИФА при выявлении ВЧИК в культуральной жидкости

После заражения ВЧИК клеток Vero отбирали пробы культуральной жидкости, содержащей ВЧИК (ВСЖ), в разные временные точки от начала заражения клеток (18, 24, 46 и 72 ч). В качестве контроля заражали клетки Vero вирусом денге 2. Затем проводили ИФА по протоколу, описанному в разделе «Материалы и методы», и ОТ-кПЦР-РВ по методике, описанной в работе А.С. Оксанич с соавт. [33].

С помощью ОТ-кПЦР-РВ (табл. 1) удалось обнаружить вирус Чикунгунья в образцах культуральной жидкости на всех стадиях заражения клеток, при этом количество вирусной РНК нарастало к 72 ч. По данным ИФА ВЧИК был выявлен в образцах начиная с 46 ч после заражения ВЧИК клеток Vero. Таким образом, для контроля наличия антигена при наработке вируса количественный ИФА можно использовать не ранее чем через двое суток после заражения.

Расчет массы цельновирионного антигена вируса Чикунгунья через концентрацию Е2 антигена

На поверхности вируса Чикунгунья располагаются 80 шипов, представляющих собой тримеры, состоящие из гетеродимеров поверхностных гликопротеинов Е1 и Е2. Количество молекул Е2 гликопротеина в одном вирионе составляет 240 [36][37]. Известно, что молекулярная масса (ММ) целого вириона альфа-вирусов составляет 52 мДа, а ММ одного Е2 гликопротеина — 50 кДа [38], то есть масса всего Е2 белка в вирусной частице составляет 12 мДа (240×50). Таким образом, для пересчета количества Е2 белка в массу цельновирионного препарата необходимо использовать коэффициент 4,33 (52/12).

Для проверки коэффициента, используемого при расчете массы цельновирионного антигена, массу вирусных частиц рассчитывали двумя способами. В первом способе исходили из количества геномных эквивалентов на 1 мл (ГЭ/мл) исследуемого образца, определенных методом ОТ-кПЦР-РВ, подразумевая, что один ГЭ соответствует одной вирусной частице. Во втором способе расчет проводили по массе Е2 белка, определенной в количественном ИФА, и умножали это значение на рассчитанный коэффициент. Для чистоты эксперимента культуральную жидкость, содержащую ВЧИК, разделяли на четыре части: две части обрабатывали РНКазой (50 мкг/мл), а другие две части не обрабатывали (вместо РНКазы добавляли эквивалентный объем ФСБ). Все образцы анализировали обоими методами. Целью предварительной обработки ВСЖ РНКазой было удаление всей свободной вирусной РНК, при этом РНК внутри вирионов оставалась защищенной от фермента, что позволило нам точно определить количество ГЭ/мл методом ОТ-кПЦР-РВ и фактическую массу цельновирионного антигена в образце.

Вес одной вирусной частицы, как было отмечено выше, составляет 52 мДа, или 8,64×10⁻¹⁷ г. С учетом пересчета разведений при выделении РНК, постановке обратной транскрипции и ПЦР в ВСЖ нами было выявлено 1,26×10¹⁰ ГЭ/мл, или 1,09 мкг/мл (1,26×10¹⁰×8,64×10⁻¹⁷=1,09×10⁻⁶ г).

Результаты количественного ИФА указали на то, что содержание Е2 белка в этих же образцах составляет 244,64 нг/мл (табл. 2). Для пересчета концентрации Е2 антигена в массу цельновирионного препарата использовали коэффициент 4,33 (4,33×244,64=1059 нг/мл ≈ 1,06 мкг/мл).

При расчете концентрации цельновирионного антигена в двух образцах, не обработанных РНКазой, получено два значения: 2,99 мкг/мл (данные ОТ-кПЦР-РВ) и 1,05 мкг/мл (данные ИФА). Отметим, что по данным ОТ-кПЦР-РВ расчетное значение концентрации антигена без обработки образца РНКазой превышало почти в 2 раза концентрацию, установленную в ИФА. Это объясняется большим количеством вирусной РНК в ВСЖ, которая присутствует как в виде свободной РНК, вышедшей из разрушенных клеток, так и РНК, заключенной внутри вирусных частиц. Тогда как в ИФА обработка ВСЖ РНКазой не влияет на полученный результат (разница не превышает 1%).

Таким образом, при сравнении двух количественных методов, ИФА и ОТ-кПЦР-РВ с обработкой РНКазой образцов и последующим пересчетом в массу цельновирионного препарата, нами были получены схожие результаты: 1,06 и 1,09 мкг/мл соответственно. Разница в концентрациях не превышает 3% и является недостоверной, что свидетельствует о возможности использования коэффициента 4,33 для пересчета массы Е2 белка ВЧИК в массу цельновирионного антигена.

При расчете коэффициента корреляции Пирсона с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2016 было получено значение r_xy=–0,94. Это указывает на то, что между значениями оптической плотности и пороговыми циклами, полученными с помощью двух методов, существует очень сильная обратная корреляция (0,9<r<1 по шкале Чеддока).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная ИФА тест-система для количественного выявления поверхностного Е2 антигена ВЧИК показала высокую эффективность: аналитическая чувствительность метода составила не более 0,625 нг/мл; тест на «линейность» в диапазоне концентраций 1,5–16 нг/мл допустим в пределах 90–110%; среднее значение коэффициента вариации составило 3,56%; тест на «открытие» — 100%. Специфичность ИФА составила 100%, перекрестная реактивность не наблюдалась с образцами, содержащими вирусы денге, желтой лихорадки, Синдбис, краснухи и вирус Западного Нила. Рассчитанный коэффициент пересчета концентрации Е2 белка ВЧИК в цельновирионный антиген составил 4,33. С помощью него можно вычислить значения, достоверно близкие значениям, полученным при пересчете массы вирионов с использованием геномных эквивалентов на 1 мл. Это позволяет говорить о применимости обеих методик расчета на практике, в частности при разработке вакцин, основанных на цельновирионном антигене. При статистическом анализе обнаружена прямая зависимость между двумя количественными методами, ИФА и ОТ-кПЦР-РВ, а также сильная обратная корреляция (r_xy=–0,94) между значениями оптической плотности и пороговыми циклами.

Таким образом, разработанная ИФА тест-система для количественного определения Е2 антигена ВЧИК в комплексе с методикой пересчета в цельновирионный антиген помогут внести серьезный вклад в разработку вакцинных препаратов и позволят повысить качество и точность дозировки специфического антигена.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» размещены таблицы S1–S4.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s2

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s3

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s4

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Б. Тахан — постановка экспериментов, написание текста рукописи, формулировка выводов; Л.Н. Притворова — тестирование моноклональных антител, планирование экспериментов по оценке эффективности ИФА; Т.Г. Самарцева — конструирование калибратора ПЦР, отработка методики ОТ-кПЦР-РВ; С.А. Кедик — обоснование концепции исследования, критический пересмотр текста рукописи; А.С. Оксанич — планирование исследования, оценка и обобщение результатов экспериментов, написание и редактирование текста рукописи, формулировка выводов.

Additional information. Tables S1–S4 are published on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s1

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s2

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s3

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-632-table-s4

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. B. Tahhan performed experiments, wrote the manuscript, formulated conclusions. L.N. Pritvorova tested monoclonal antibodies, planned the experiments to evaluate the effectiveness of ELISA. T.G. Samartseva constructed a PCR calibrator and developed the RT-qPCR-RT technique. S.A. Kedik substantiated the study concept and critically revised the manuscript. A.S. Oksanich planned the study, evaluated and summarised the experimental results, wrote and edited the manuscript, and formulated conclusions.