Влияние условий хранения цельноклеточной коклюшной вакцины на ее токсичность: исследование на аутбредных мышах

ВВЕДЕНИЕ

Включение цельноклеточной коклюшной вакцины (ЦКВ) в календарь профилактических прививок значительно снизило заболеваемость коклюшем¹ [1], хотя не устранило эпидемические вспышки, происходящие по всему миру каждые 3–5 лет. Данные по динамике заболеваемости коклюшем подтверждают высокую эффективность ЦКВ. Например, в Англии с середины 1940-х гг., когда началась вакцинация, до середины 1970-х гг. заболеваемость коклюшем неуклонно снижалась [2]. Однако в результате антипрививочной кампании охват населения вакцинацией сократился, что привело к резкому росту заболеваемости. В Англии 1970-е гг. на фоне роста числа отказов от вакцинации было зарегистрировано более 100 летальных исходов [3]. Эти данные свидетельствуют о том, что польза вакцинации значительно превышает риск возможных побочных эффектов [2].

Проблема возможных побочных реакций ЦКВ вызвала широкую обеспокоенность. В некоторых странах, включая Японию, проведение профилактических прививок было приостановлено [4]. Помимо риска поствакцинальных реакций была обозначена проблема непродолжительного поствакцинального иммунитета. Решение этой проблемы видели в проведении ревакцинаций среди детей старшего возраста. Однако из-за реактогенности ЦКВ это невозможно было реализовать [3].

Были предприняты попытки по разработке менее реактогенных и более стандартизованных бесклеточных коклюшных вакцин (БКВ) [3]. БКВ включают в состав от одного до пяти очищенных антигенов: коклюшный анатоксин, филаментозный гемагглютинин, пертактин, агглютиногены (фимбрии) типов 2 и 3. В клинических исследованиях продемонстрирована безопасность и иммуногенная активность БКВ [5]. Тем не менее многолетнее (более 20 лет) применение БКВ не оправдало всех ожиданий. В странах, где используется исключительно БКВ, несмотря на высокий уровень охвата населения вакцинацией, отмечался рост заболеваемости и зарегистрированы эпидемии, что свидетельствовало о кратковременности адаптивного иммунитета, индуцированного БКВ [6–8]. Предложено несколько основных причин данного явления: неоптимальный баланс клеточно-опосредованных иммунных реакций (Th1, Th2, Th17) [9]; отсутствие ключевых защитных антигенов в составе вакцины; несбалансированное содержание антигенов в составе вакцины или их недостаточное количество; различия между защитными антигенами в вакцине и аналогичными антигенами современных циркулирующих штаммов [10–13].

Таким образом, в настоящее время сложилась непростая ситуация в области вакцинопрофилактики коклюша: существует ЦКВ, доказавшая свою эффективность, но обладающая реактогенностью, и менее эффективная, но малореактогенная БКВ. Очевидно, что необходимы усилия для совершенствования существующих вакцин. Требуется снизить реактогенность ЦКВ при сохранении ее защитной активности и повысить эффективность БКВ. Защитную активность БКВ можно увеличить путем изменения соотношения антигенов в составе вакцины, добавления новых антигенов [14][15], использования новых адъювантов, способных изменить характер иммунного ответа (баланс Th1, Th2, Th17) [16], оптимизации путей доставки антигенов [14]. Реализация этих шагов потребует проведения доклинических и клинических исследований, дополнительного финансирования, значительных временных затрат.

Снижение специфической токсичности ЦКВ возможно осуществить, вероятно, менее затратными способами. К ним относятся уменьшение количества убитых бактериальных клеток в дозе вакцины [17], генетическая модификация токсинов B. pertussis [18], а также изменения в технологическом процессе производства ЦКВ.

В рамках данной работы рассматривалась возможность снижения токсических свойств ЦКВ путем воздействия на технологический процесс изготовления коклюшной вакцины.

Цель работы — оценка токсических свойств ЦКВ в экспериментах на мышах при изменении условий в процессе хранения вакцины.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Штаммы. В работе использовали производственные штаммы B. рertussis 38, 305, 312, 475, 703, хранящиеся в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) и применяемые для изготовления ЦКВ как компонента АКДС-вакцины, а также циркулирующие штаммы, выделенные от больных коклюшем детей: 16-16, 28(1)-18, 30-18, 31(2)-17, 33-18.

Экспериментальные животные. Исследования проводили на аутбредных мышах обоего пола массой тела 15±1 г, полученных из питомника филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Животных рандомизировали с формированием десяти опытных групп и одной контрольной, каждая из которых включала по 10 особей (равномерное распределение с учетом разницы в массе тела). Мышам опытных групп внутрибрюшинно (в/б) вводили образцы вакцины (10 образцов, указанных в разделе «Штаммы»), мышам контрольной группы — в/б 0,9% раствор натрия хлорида с тиомерсалом (консервант). Период наблюдения за характеристиками ЦКВ был разделен на 4 интервала: 1–3 мес., 4–6 мес., 7–9 мес. и 10–12 мес. Для 10 образцов вакцины в каждом временном интервале оценивали специфическую безопасность. В течение периода исследования животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде.

Протокол исследования с использованием экспериментальных животных был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (№ 8 от 03.12.2024). Все исследования проводились в соответствии с рекомендациями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях², принципами Международного совета медицинских научных обществ (CIOMS)³, Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях⁴, ГОСТ 33216-2014⁵.

Методы

Подготовка образцов вакцины. Из штаммов B. pertussis в соответствии с МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» были изготовлены 10 образцов ЦКВ. Их готовили на основе суспензии из агаровой бактериальной культуры возбудителя, в которую были внесены инактивирующий агент (формальдегид) и тиомерсал в требуемых концентрациях. С этой целью культуру B. pertussis выращивали на среде КУА (АО «НПО «Микроген», филиал «НПО «Питательные среды», Россия). В среду добавляли кровь барана дефибринированную (АО «ЭКОлаб», Россия) до концентрации 10%. Далее с 3 или 4 пассажа проводили смыв бактериальной культуры 0,9% раствором натрия хлорида, содержащим формальдегид (PanReac AppliChem). Концентрацию бактериальных клеток в суспензии определяли с помощью фармакопейного стандартного образца мутности бактериальных взвесей 10 МЕ (ФСО 3.1.00085, ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России). В качестве консерванта в смытую коклюшную суспензию (КС) вносили тиомерсал (Sigma-Aldrich). Изготовленные образцы вакцины хранили при 5±3 °С на протяжении 12 мес. (срок хранения ЦКВ).

Оценка токсического действия вакцины. Из емкости, в которой хранили изготовленную ЦКВ, в указанные выше интервалы времени отбирали пробы вакцины для оценки токсического действия. С этой целью определяли значения показателя «Специфическая безопасность» образцов вакцин на протяжении 12 мес. (срок наблюдения) в экспериментах на мышах в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) ФС.3.3.1.0010.15⁶. Этот показатель рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и используется на производстве при оценке остаточной токсичности ЦКВ⁷. Мышам опытных групп вводили в/б дозу вакцины с концентрацией убитых клеток, эквивалентной таковой в коммерческих вакцинах (10⁹ клеток/0,5 мл). Контрольным животным вводили 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с концентрацией тиомерсала, соответствующей его содержанию в изготовленных вакцинах. Взвешивание мышей проводили до введения препарата, а также на 1 сут, через 72 ч и на 7 сут после введения. Выбор сроков взвешивания животных обусловлен временем максимального проявления действия основных токсинов B. pertussis — липоолигосахарида (ЛОС) и коклюшного токсина (КТ): ЛОС оказывает свое действие через 1 сут после введения препарата, КТ — на 7 сут⁸. Восстановление массы тела мышей до исходных значений через 72 ч после введения вакцины служит одним из критериев в рамках данного подхода. Все исследованные образцы ЦКВ соответствовали этому требованию.

Показатель «Специфическая безопасность» для образцов вакцин рассчитывали как отношение изменения массы тела опытных животных (после введения вакцины) к изменению массы тела контрольных животных на 7 сут, выраженное в процентах. Согласно требованиям ГФ РФ ФС.3.3.1.0010.15⁹, значение этого показателя через 7 сут после введения препарата должно составлять не менее 60%. Меньшее значение показателя указывает на высокую остаточную токсичность вакцины, обусловленную содержанием необезвреженного КТ. Токсическое действие ЛОС оценивали по изменению массы тела мышей на 1 сут (%) после введения препарата. Требования к величине показателя, отражающего токсическое действие препарата на 1 сут после введения вакцины, в документах ВОЗ и ГФ РФ отсутствуют.

Для определения изменения показателя массы тела мышей вычисляли разницу между показателем массы, зафиксированной через 1 или 7 сут, и массы тела, определенную до введения препарата (исходная масса). Значения изменения массы тела мышей выражали в процентах относительно исходного веса.

Статистическая обработка данных. За период наблюдения проведено более 100 измерений значений показателей, отражающих остаточную токсичность препарата. Полученные данные по изменению массы тела мышей в опытных группах и значения показателя специфической безопасности группировали (с учетом четырех интервалов срока хранения вакцины: 1–3 мес., 4–6 мес., 7–9 мес. и 10–12 мес.) и рассчитывали среднее арифметическое значение и стандартное отклонение. Взаимосвязь между показателями специфической безопасности вакцины и изменением массы тела мышей на 1 и 7 сут устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена¹⁰ [19].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Динамика изменения массы тела мышей на 1 и 7 сут после введения им исследуемых образцов ЦКВ, выдержанных с инактивирующим агентом в условиях хранения в зависимости от его срока, представлена на рисунке 1.

Расчетные значения изменения массы тела мышей представлены в таблице 1. Установлено, что при введении животным КС, выдержанной с инактивирующим агентом в течение 1–3 мес., средний прирост массы тела мышей через 7 сут после введения вакцины составил 31,0% по отношению к исходному весу, а в случае введения КС, инактивированной на протяжении других сроков хранения, прирост массы тела составил: 4–6 мес. — 38,28%, 7–9 мес. — 41,47%, 10–12 мес. — 43,22%.

Так как действие остаточного количества необезвреженного КТ, присутствующего в вакцине, максимально проявляется на 7 сут¹¹, то по динамике значений изменения массы тела можно сделать вывод о степени эффективности процесса обезвреживания КТ в КС. Так, если прирост массы тела мышей через 1–3 мес. составил 31,0%, а в конце срока хранения (10–12 мес.) — 43,22%, то общий прирост массы тела составил 12,22%. Следовательно, в ЦКВ, инактивированной на протяжении 10–12 мес. в условиях хранения, содержится меньшее количество активного КТ по сравнению с вакциной на начальном этапе хранения, что проявляется в более выраженном приросте массы тела животных. Можно заключить, что обезвреживание КТ происходит на протяжении всего срока хранения вакцины (12 мес.).

Поскольку, предположительно, на 1 сут после введения вакцины проявляется действие содержащегося в препарате ЛОС¹², то определение значений изменения массы тела мышей на 1 сут позволяет оценить токсическое действие ЛОС. Показатели прироста массы тела мышей на 1 сут после введения КС имели отрицательные значения, что свидетельствует о значительном токсическом действии ЛОС. Следует отметить, что значения прироста массы тела с течением времени достоверно не изменялись.

При введении животным КС, выдержанной с инактивирующим агентом в течение 1–3 мес., среднее значение изменения массы тела мышей на 1 сут после введения вакцины составило (-2,84%) относительно исходного веса (табл. 1). В случае введения КС, инактивированной на протяжении других сроков хранения (4–6, 7–9 и 10–12 мес.), этот показатель составил (-1,99%), (-1,79%), (-1,62%) соответственно. Различия между значениями на начальном и конечном этапах хранения КС оказались статистически незначимы и составили 1,22%. Эти результаты свидетельствуют о том, что формальдегид, содержащийся в ЦКВ, практически не оказывает детоксицирующего эффекта на ЛОС и его токсическое действие при хранении вакцины изменяется крайне незначительно.

Величина показателя специфической безопасности ЦКВ в зависимости от срока выдерживания с инактивирующим агентом в условиях хранения (рис. 2) увеличивается в интервале наблюдения. Следовательно, процесс обезвреживания КТ после добавления в КС формальдегида продолжается в течение всего срока хранения вакцины. Так, через 1–3 мес. выдерживания КС с инактивирующим агентом показатель специфической безопасности составлял 69,4%, через 4–6 мес. — 76,3%, через 7–9 мес. — 81,7%, через 10–12 мес. — 84,3%. Таким образом, остаточная токсичность, определяемая косвенно через показатель специфической безопасности, снизилась на 14,9%.

Следует отметить, что представленные результаты получены на образцах ЦКВ, изготовленных с использованием твердой питательной среды КУА. Поэтому сделанные выводы применимы исключительно к процессу производства, в котором культивирование бактериальной массы осуществляется на твердой среде КУА.

Срок хранения цельноклеточного коклюшного компонента на предприятии до сведения (объединения) его с дифтерийным и столбнячным анатоксинами в АКДС-вакцину составляет 1 год. В течение этого срока, начиная с 3 мес. хранения, ЦКВ может использоваться для сведения с компонентами АКДС-вакцины. Согласно представленным результатам процесс обезвреживания КТ носит пролонгированный характер и продолжается как в течение 1 года хранения, так и после его истечения (неопубликованные данные). Следовательно, целесообразно использовать ЦКВ для сведения ее с другими компонентами АКДС-вакцины ближе к концу срока хранения, когда остаточное количество КТ в вакцине максимально обезврежено. Это позволит минимизировать содержание необезвреженного КТ в дозе вакцины, предназначенной для введения ребенку. Исходя из этого производителям АКДС-вакцин рекомендуется для сведения с дифтерийным и столбнячным анатоксинами использовать ЦКВ, находящуюся на хранении не менее 10–12 мес., то есть в конце допустимого срока хранения.

Для оценки взаимосвязи между изучаемыми показателями был проведен корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Величина коэффициента Спирмена, характеризующая силу связи между значениями специфической безопасности и приростом массы тела мышей, составила: на 7 сут — 0,55 (р<0,01), что указывает на заметную силу связи; на 1 сут — 0,349 (р<0,01), что свидетельствует об умеренной силе связи. Таким образом, показатель качества вакцины «Специфическая безопасность» отражает наличие как активного КТ, так и ЛОС в ЦКВ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Длительное наблюдение за эффективностью БКВ позволило сделать заключение, что эти вакцины и применяемые программы вакцинации не обеспечивают полного контроля над заболеваемостью коклюшем [20][21]. Более того, высказано предположение о наличии связи между использованием БКВ и ростом заболеваемости коклюшем в странах Европы, США, Японии [10][22–24]. В настоящее время в Российской Федерации также наблюдается рост заболеваемости коклюшем. Так, показатель заболеваемости коклюшем в 2023 г. составил 36,2 случая на 100 тыс. населения, что превышает уровень заболеваемости 2022 г. в 16,4 раза [25][26]. Учитывая тот факт, что в России практически отказались от использования отечественной ЦКВ и широко используют зарубежные БКВ (например, Пентаксим, Адасель), можно предположить, что одной из причин роста заболеваемости коклюшем является масштабное использование для вакцинации детского населения зарубежных бесклеточных вакцин. Для проверки данного предположения необходимо провести анализ корреляционной взаимосвязи между количеством использованных в Российской Федерации доз ЦКВ и БКВ и уровнем заболеваемости коклюшем.

Возрождение коклюша поднимает перед обществом проблему профилактики заболевания среди населения, особенно среди младенцев и детей младшего возраста, наиболее подверженных инфекции.

Альтернативой БКВ является ЦКВ, которая доказала свою эффективность в течение многолетнего периода использования [1]. ВОЗ высказано мнение о том, что опасения по поводу реактогенности ЦКВ необоснованно преувеличены, и рекомендовано продолжить использование этих вакцин в соответствии с утвержденными национальными календарями профилактических прививок¹³. Несмотря на это существующая настороженность в обществе к ЦКВ, хотя она в определенной мере оправданна, ограничивает широкое применение АКДС-вакцины [27].

В настоящее время предпринимаются попытки снизить остаточную токсичность ЦКВ, обусловленную ЛОС, посредством его экстракции из коклюшной бактериальной культуры [28] и других методов [29]. Было установлено, что ЛОС, помимо токсического эффекта, обладает выраженной защитной активностью¹⁴ и рассматривается как потенциальный кандидат для включения в состав БКВ.

Разрабатываются генно-инженерные подходы к конструированию новых вакцин. Предполагается, что вакцины, содержащие генетически инактивированные коклюшные токсины, смогут вызывать длительный иммунный ответ, аналогичный реакции организма при естественной инфекции. В Российской Федерации и Франции ведутся разработки живых аттенуированных вакцин для интраназального применения, которые находятся на стадии клинических исследований [30–33]. От разработчиков этих вакцин требуются доказательства генетической стабильности препаратов, их безопасности и исключения возможности передачи штамма контактным лицам [34]. Новые вакцины должны соответствовать ряду требований: обеспечение безопасности, индуцирование длительного эффективного иммунитета, минимизация влияния антигенного дрейфа, индуцирование образования бактерицидных антител, исключение передачи бактерий B. рertussis.

Таким образом, в настоящее время исследования идут в разных направлениях: создание новых вакцин и совершенствование имеющихся.

В ходе данного исследования авторами продемонстрирована возможность снижения остаточной токсичности ЦКВ. Был установлен факт длительного обезвреживающего действия формальдегида на КТ убитых бактерий B. pertussis. В дальнейшем авторами планируется представить рекомендации производителям по использованию ЦКВ для сведения с дифтерийным и столбнячным анатоксинами в АКДС-вакцину в конце допустимого срока ее хранения, когда КТ в значительной степени обезврежен. Это позволит повысить безопасность ЦКВ и в определенной степени снизить реактогенность. Повышение качества АКДС-вакцины обеспечит более широкое ее применение в профилактических программах, способствуя успешному контролю над коклюшной инфекцией.

Проблема снижения токсических свойств ЛОС в ЦКВ остается актуальной. Эндотоксичность ЛОС обусловлена входящими в его структуру липидами A и X. Разрушение бактериальных клеток B. pertussis приводит к высвобождению липидов в кровь, что может вызывать серьезные токсические реакции [35]. Из-за влияния на остаточную токсичность ЦКВ в настоящее время ЛОС не используется в качестве защитного антигена в БКВ.

Важно отметить, что приготовление образцов ЦКВ в рамках данной работы проводилось в соответствии с технологическим процессом, применяемым на производстве при изготовлении коклюшной вакцины. Соблюдение всех требований процесса обеспечивает сохранение биологических свойств производственных штаммов, включая важный показатель качества вакцины — защитную активность. Более подробное изучение этого аспекта требует дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

1. При введении мышам коклюшной суспензии, выдержанной с инактивирующим агентом (формальдегид) в течение 1–3 мес. в условиях хранения, средний прирост массы тела мышей через 7 сут после введения вакцины составил 31,0% по отношению к исходному весу, а в случае инактивации в течение 10–12 мес. — 43,22% (общий прирост — 12,22%). Это указывает на меньшее количество активного коклюшного токсина в ЦКВ через 12 мес. Следовательно, процесс обезвреживания коклюшного токсина носит пролонгированный характер и продолжается на протяжении всего срока хранения вакцины (12 мес.).
2. Повышение значений показателя «Специфическая безопасность» ЦКВ в процессе ее хранения с 69,4% (через 1–3 мес.) до 84,3% (через 10–12 мес.) подтверждает снижение остаточной токсичности вакцины после 10–12 мес. хранения. Для повышения безопасности АКДС-вакцины целесообразно использовать ЦКВ для сведения с другими компонентами АКДС-вакцины после 10–12 мес. ее хранения в регламентированных условиях, когда остаточное содержание коклюшного токсина в вакцине максимально обезврежено.
3. Введение мышам коклюшной суспензии после ее выдерживания с инактивирующим агентом приводило к снижению массы тела мышей на 1 сут после введения вакцины. Этот эффект регистрировался как на начальном, так и конечном этапах хранения вакцины, что указывает на сохранение токсического воздействия, связанного с наличием ЛОС в ЦКВ даже спустя 10–12 мес. и недостаточном детоксицирующем действии формальдегида на ЛОС B. pertussis. Установление возможных путей для снижения токсических свойств ЛОС в вакцине требует дальнейших исследований.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.А. Алексеева — формирование цели и задач исследования; анализ и систематизация данных научной литературы, анализ и интерпретация результатов исследования, написание и редактирование текста рукописи; Д.Н. Лепихова — проведение экспериментальных исследований, сбор и анализ данных научной литературы, редактирование текста рукописи; О.Ю. Борисова — планирование исследования, обобщение экспериментальных данных, анализ и интерпретация результатов, анализ и обобщение данных научной литературы, редактирование текста рукописи; А.С. Пименова — проведение экспериментальных исследований, анализ и интерпретация результатов исследования; редактирование текста рукописи; И.Ю. Андриевская, И.В. Ибрагимхаллова — проведение экспериментальных исследований, сбор и анализ данных научной литературы, работа с графическим материалом.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования с использованием экспериментальных животных был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (протокол № 8 от 03.12.2024).

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. I.A. Alekseeva formulated the study aim and objectives, analysed and systematised literature data, analysed and interpreted the study results, and drafted and edited the manuscript. D.N. Lepikhova conducted experiments, collected and analysed literature data, and edited the manuscript. O.Yu. Borisova designed the study, analysed and interpreted literature data, summarised the experimental data obtained, analysed and interpreted the study results, and edited the manuscript. A.S. Pimenova conducted experiments, analysed and interpreted the study results, and edited the manuscript. I.Yu. Andrievskaya, I.V. Ibragimkhalilova conducted experiments, collected and analysed literature data, and worked with the graphical material.

Ethics approval. The protocol of the animal study was approved by the Local Ethics Committee at the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation (Protocol No. 8 of 3 December 2024).