Сравнительный анализ результатов испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммунофлуоресцентным и иммунохроматографическим методами

ВВЕДЕНИЕ

Основным способом предупреждения заболевания сибирской язвой является плановая иммунизация сельскохозяйственных животных в неблагополучных районах и вакцинация лиц, подверженных повышенному риску заражения сибирской язвой. В Российской Федерации для иммунизации населения используется отечественная вакцина сибиреязвенная живая, которая представляет собой споры вакцинного сибиреязвенного штамма Bacillus anthracis СТИ-1, лиофилизированные в 10% водном растворе сахарозы. Вакцина после двукратного применения с интервалом 20–30 сут вызывает формирование специфического иммунитета продолжительностью до 1 года [1]. В Китае используют живую сибиреязвенную вакцину на основе штамма B. anthracis А16R. В США и Великобритании применяют химические вакцины — AVA и AVP соответственно [2].

В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации¹ (ГФ РФ) обязательным показателем качества вакцины живой сибиреязвенной является показатель «Подлинность», который подтверждается при микроскопии мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену. Однако, по мнению авторов статьи, данный метод объективно не характеризует подлинность вакцины, так как не всегда позволяет специфически идентифицировать споровый сибиреязвенный антиген [3].

При проведении экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» важным аспектом является внедрение альтернативных перспективных методов анализа с помощью соответствующих диагностических препаратов, зарегистрированных в Российской Федерации, предназначенных для выявления спор возбудителя сибирской язвы. В лабораторной диагностике для обнаружения возбудителя сибирской язвы или его компонентов (ДНК, антигенов) используются разные диагностические наборы, бактериофаги и питательные среды² [4–7]. Ранее в опубликованной авторами работе при оценке качества вакцины по показателю «Подлинность» было продемонстрировано, что иммунохроматографический метод может быть эффективным экспресс-методом для видоспецифического выявления спор B. anthracis СТИ-1 в сибиреязвенной вакцине [3]. Кроме того, в других работах авторов рассмотрены альтернативные методы испытания вакцины сибиреязвенной и других вакцин против особо опасных инфекций (туляремийная, бруцеллезная, чумная вакцины) по показателю «Подлинность» [8–10]. Так, например, был применен иммунофлуоресцентный метод, основанный на окраске спор B. anthracis специфичными иммуноглобулинами, меченными флуоресцентным красителем (реакция иммунофлуоресценции), и показана его диагностическая эффективность [8][9]. Таким образом, внедрение альтернативных иммунологических методов для ускоренной оценки показателя «Подлинность» сибиреязвенной вакцины с помощью российских диагностических препаратов обеспечивает эффективный контроль качества данного иммунобиологического лекарственного препарата.

Цель работы — оценка возможности применения иммунофлуоресцентного метода и сравнительный анализ результатов его применения с иммунохроматографическим методом при испытании вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность».

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• выявление спорового антигена в вакцине сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом с помощью коммерческих иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных при определении показателя качества «Подлинность»;
• проведение сравнительного анализа испытаний вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммунофлуоресцентным и иммунохроматографическим методами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В исследовании использовали следующие основные материалы:

• вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения, серия 2850921, производства ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Минобороны России;
• фармакопейный стандартный образец (ФСО) мутности бактериальных взвесей 10 МЕ (ФСО мутности 10 МЕ) — ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) производства ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России;
• иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие по ТУ 9389-005-01897080-2010 (ФСР 2011/11339), серия 1-22, производства ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Россия;
• набор реагентов «Иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-система anthracis)» по ТУ 9398-093-78095326-2008 (ФСР 2009/05485), серия О84-К-19, производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия.

Оборудование

Учет результатов иммунофлуоресцентного анализа проводили на микроскопе люминесцентном (Axio Scope A1, Carl Zeiss, Германия).

Методы

При выполнении работ руководствовались требованиями СанПиН 3.3686-21 и методическими указаниями МУК 4.2.2413-08³.

Подтверждение подлинности вакцины сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом проводили с помощью иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих, представляющих собой меченную флуоресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ) иммуноглобулиновую фракцию к водорастворимому антигену споровой формы B. anthracis, выделенную из гипериммунной кроличьей сыворотки и адсорбированную на основе магноиммуносорбентов с водорастворимыми антигенами штаммов B. cereus 8, B. cereus 104, B. cereus 111, B. megaterium 6.

Препарат обеспечивает видоспецифическое выявление и идентификацию спор B. anthracis в суспензиях, полученных из колоний микроорганизмов, выращенных на питательном агаре в течение 7 сут при температуре 35±1 °С, и в суспензиях, полученных из сырья животного происхождения и объектов окружающей среды путем специальной пробоподготовки, при которой из выращенных культур готовят микробные взвеси в 0,9% растворе натрия хлорида по ФСО мутности 10 МЕ, эквивалентной концентрации 10⁸ спор/мл. Рабочее разведение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих — 1:64. Согласно инструкции по применению рабочее разведение иммуноглобулинов должно быть не менее 1:16. В данной работе при окраске мазков с вакциной сибиреязвенной использовали разведения иммуноглобулинов 1:32 и 1:64. Поскольку вакцина сибиреязвенная живая представляет собой взвесь живых спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1, лиофилизированную в 10% водном растворе сахарозы, в связи с чем пробоподготовка исследуемого образца для получения спор не требовалась. Взвесь спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 разводили исходя из общей концентрации, указанной в паспорте на вакцину, 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2±0,2) до концентрации 10⁸ спор/мл по ФСО мутности 10 МЕ и готовили мазки. Далее проводили обеззараживание и окраску мазков, а также учет результатов в соответствии с инструкцией по применению на иммуноглобулины. Для учета результатов испытания вакцины использовалась система оценки по интенсивности свечения и количеству специфически светящихся клеток⁴: 4+ — очень яркая, сверкающая флуоресценция зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; 3+ — яркая флуоресценция зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки, при этом клетки расположены отдельными группами и единично; 2+ — слабое свечение всей микробной клетки; 1+ — едва заметные контуры клетки. Препарат вакцины сибиреязвенной живой в рабочем разведении должен обеспечивать специфическое зеленовато-желтое свечение интенсивностью на 3+ или 4+. Свечение на 1+ или 2+ свидетельствует об отсутствии в исследуемых мазках В. anthracis в споровой форме. При этом препарат вакцины в рабочем разведении не должен вызывать специфическую флуоресценцию гетерологичных штаммов рода Bacillus.

Испытания вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» иммунохроматографическим методом проводили, как описано ранее [3]. Для исследования готовили суспензию из взвеси спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 до концентрации 10⁹ спор/мл, исходя из общей концентрации спор, указанной в паспорте на вакцину (4,9 млрд спор/мл). Затем разводили в 0,9% растворе натрия хлорида (рН 7,2±0,2) до концентрации 10⁸ спор/мл по ФСО мутности 10 МЕ. Микробные взвеси в полученных разведениях в объеме 0,1 мл вносили в лунку тест-системы. Через 15 мин фиксировали результат.

Статистическая обработка данных. Испытания проводили три оператора, каждый использовал по одному образцу (ампула) вакцины сибиреязвенной живой. Так как при применении иммунофлуоресцентного и иммунохроматографического методов регистрировали качественные реакции образования иммунокомплексов, результаты оценивали визуально, в связи с чем статистической обработки полученных результатов не проводилось.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При контроле качества иммунобиологических лекарственных препаратов по показателю «Подлинность» предприятиями-изготовителями, контрольными лабораториями, экспертными организациями применяется широкий спектр методов — биологических, химических, физико-химических, молекулярных и др.⁵ В отношении препаратов вакцин против особо опасных инфекций (сибиреязвенная, туляремийная, бруцеллезная, чумная вакцины)⁶ существующие методы оценки по показателю «Подлинность» чаще всего являются достаточно трудоемкими, сложными и длительными, а также не всегда обеспечивают высокую достоверность анализа. В связи с этим для подтверждения подлинности вакцины сибиреязвенной более предпочтительным является использование иммунофлуоресцентного и иммунохроматографического методов, которые отвечают основным современным критериям, таким как экспрессность, относительная простота проведения анализа, высокая достоверность результатов анализа. Данные методы успешно применяются для экспресс-диагностики сибирской язвы как в отечественной, так и в зарубежной лабораторной практике⁷.

Результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой иммунофлуоресцентным методом

Как видно на рисунке 1, при окраске мазков препарата вакцины сибиреязвенной живой диагностическими иммуноглобулинами в обоих разведениях наблюдалась яркая зеленовато-желтая, сверкающая флуоресценция оболочки, четко контрастирующая с темным телом споры, оцениваемая на 3+ или 4+⁸. При этом были отчетливо видны окрашенные споры как в скоплениях, так и при одиночном расположении размером (0,8–1,0)×1,5 мкм⁹. Было отмечено, что испытуемый препарат вакцины сибиреязвенной живой в рабочем разведении не вызывал специфическую флуоресценцию гетерологичных штаммов рода Bacillus.

На основании полученных результатов при испытании вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» рекомендовано окрашивать мазки диагностическими сибиреязвенными иммуноглобулинами в рабочем разведении.

Сравнительный анализ данных, полученных при исследовании вакцины сибиреязвенной живой иммунохроматографическим и иммунофлуоресцентным методами

При выявлении спорового антигена в вакцине сибиреязвенной живой иммунохроматографическим и иммунофлуоресцентным методами с помощью, соответственно, ИХ тест-системы B. anthracis и диагностических сибиреязвенных иммуноглобулинов были зафиксированы положительные результаты. В концентрациях суспензии вакцины сибиреязвенной живой, равных 10⁹ и 10⁸ спор/мл, в зоне «С» и «Т» тест-полосок отчетливо видны красные линии (рис. 2), которые свидетельствуют о связывании спорового антигена B. anthracis со специфическими антителами, иммобилизованными на тестовой линии [7].

Следует отметить, что полученные авторами в данной работе положительные результаты испытаний на наличие спорового антигена B. anthracis иммунохроматографическим методом с помощью ИХ тест-системы коррелируют с положительными результатами других исследователей [11].

Таким образом, результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой продемонстрировали, что как иммунофлуоресцентный, так и иммунохроматографический методы равноценны и подтверждают подлинность сибиреязвенного микроба, входящего в состав вакцины. При этом важно отметить, что каждый метод имеет как преимущества, так и недостатки (табл. 1).

Использование иммунохроматографического теста при подтверждении подлинности вакцины сибиреязвенной живой, учитывая быстроту анализа, высокую специфичность и экономичность, является удобным и надежным методом. Достоверность тестов достигает 92–99,8%, и при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль [11]. К недостаткам используемых тест-систем можно отнести субъективность оценки результатов в спорных моментах, однако это можно нивелировать путем проведения контрольных тестов¹⁰.

В свою очередь, иммунофлуоресцентный метод может быть эффективным в силу наглядного учета результатов, невысокой стоимости иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных споровых адсорбированных и относительно большого срока их годности (3 года). Следует отметить значительный разброс данных литературы по характеристике специфичности этого метода. Согласно данным Ю.О. Селянинова и И.Ю. Егорова [12], специфичность метода составляет 70% из-за большого числа перекрестно реагирующих антигенов с близкородственными микроорганизмами. Результаты другого исследования показывают, что иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные в разведении 1:64 выявляют 93,8±6,0% исследуемых штаммов B. anthracis (оценка по интенсивной флуоресценции на 3+ или 4+), при этом в 96,9±3,1% случаев не реагируют со штаммами близкородственных микроорганизмов¹³. Однако недостатком данного метода является использование дорогостоящего оборудования — люминесцентного микроскопа с системой светофильтров.

ВЫВОДЫ

1. Иммунофлуоресцентный метод с использованием иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных споровых адсорбированных является эффективным методом для видоспецифического выявления спор B. anthracisСТИ-1 в вакцине сибиреязвенной живой. Основные преимущества метода: наглядность учета результатов, невысокая стоимость иммуноглобулинов и относительно большой срок их годности (3 года).
2. Иммунохроматографический метод с использованием диагностического набора реагентов — иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы (ИХ тест-система В. anthracis) эффективен для подтверждения подлинности спорового антигена вакцины сибиреязвенной живой. Основные преимущества метода: быстрота и простота проведения анализа, специфичность и экономичность.
3. Представленные результаты испытания вакцины сибиреязвенной живой по показателю качества «Подлинность» иммунофлуоресцентным и иммунохроматографическим методами с помощью коммерческих диагностических препаратов российского производства являются основанием для рекомендации внесения данных методов в нормативную документацию на вакцину сибиреязвенную живую в качестве альтернативных подходов, дополнительных к методу бактериоскопии спор по Цилю — Нильсену.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.А. Алексеева — выполнение экспериментальных исследований по определению показателя качества «Подлинность» вакцины сибиреязвенной живой, обобщение экспериментальных данных, анализ и интерпретация результатов, написание и критический пересмотр текста рукописи; И.В. Касина — формирование цели и задач исследования, выполнение экспериментальных исследований по определению показателя качества «Подлинность» вакцины сибиреязвенной живой; обобщение экспериментальных данных, анализ и интерпретация результатов исследования, написание текста рукописи; Т.И. Немировская — общее руководство, критический пересмотр текста рукописи и утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. S.A. Alekseeva conducted identification experiments with the live plague vaccine, summarised the experimental data, analysed and interpreted the study results, and drafted and critically revised the manuscript. I.V. Kasina formulated the study aim and objectives, conducted identification experiments with the live plague vaccine, summarised the experimental data, analysed and interpreted the study results, and drafted the manuscript. T.I. Nemirovskaya provided general supervision of the research project, critically revised the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication.