Рекомендации по разработке методик испытания стерильности биологических лекарственных препаратов на основе фармакопейных методов

ВВЕДЕНИЕ

Некоторые особенности биологических лекарственных препаратов (БЛП), связанные с их природой или составом, могут вызывать определенные сложности при проведении испытаний на стерильность. Так, присутствующие в составе БЛП стабилизаторы (алюминия гидроксид, сквалан), консерванты (мертиолят, формальдегид) могут препятствовать выявлению микробной контаминации, что влияет на достоверность результатов контроля стерильности [1–3].

Основные требования, изложенные в Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ)¹, Фармакопее Евразийского экономического союза (ЕАЭС)², Европейской фармакопее³ и Фармакопее США⁴, не в полной мере отражают специфику проведения испытаний на стерильность отдельных групп БЛП, связанную с природой или составом препаратов, а содержат лишь общие положения по проведению испытаний.

Анализ результатов испытаний более 3000 серий 200 наименований различных групп БЛП (вакцины живые и инактивированные, вирусные и бактериальные, одно- и многокомпонентные, бактериофаги и интерфероны, сыворотки и иммуноглобулины) по показателю «Стерильность» в 2021–2023 гг. в испытательном центре (ИЦ) экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) указывает на необходимость решения ряда проблемных практических вопросов, связанных с различной природой исследуемого образца, выбором наиболее подходящего фармакопейного метода и разработкой на его основе воспроизводимой адекватной методики контроля стерильности. К основным проблемам проведения испытаний БЛП относятся изменение внешнего вида и физического состояния питательной среды или образца, увеличенный риск контаминации и получения ложноположительного результата при испытании методом прямого посева, затруднения при проведении процедуры фильтрации и др.

Решению этих проблем будет способствовать разработка производителями БЛП верифицированной, воспроизводимой методики контроля стерильности на основе фармакопейных методов, установление порядка проведения испытания с учетом особенностей конкретного БЛП, а также подробное и последовательное изложение раздела «Стерильность» нормативной документации (НД) на препарат, материалов регистрационного досье (раздела валидации аналитических методик), что позволит повысить точность воспроизведения методики и достоверность оценки качества препарата [4].

В национальных и международных фармакопеях — ГФ РФ (ОФС.1.2.4.0003.15)⁵, Фармакопее ЕАЭС (ОФС 2.1.6.1)⁶, Европейской фармакопее⁷ и Фармакопее США⁸ регламентированы условия проведения испытаний методом прямого посева или методом мембранной фильтрации. При выборе метода и разработке методики контроля стерильности рекомендуется провести анализ природы препарата, состава и его физико-химических свойств, в том числе растворимости и способности свободно проходить через мембранные фильтры [5][6].

При рассмотрении раздела «Стерильность» НД в ходе проведения экспертизы в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России установлено, что только 15% НД на БЛП содержат схему контроля стерильности, включающую оба фармакопейных метода. Для повышения качества испытания на стерильность и расширения возможности выбора метода в зависимости от тестируемого материала, наличия необходимого оборудования и расходных материалов (питательных сред, фильтроэлементов) рекомендуется разрабатывать схему контроля стерильности, включающую оба метода, как наиболее доступную, рациональную и обеспечивающую всесторонний подход к оценке результатов испытания [4][7][8].

Цель работы — предложить основные рекомендации по разработке методик испытания стерильности биологических лекарственных препаратов на основе фармакопейных методов.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Метод прямого посева

При проведении экспертизы качества по показателю «Стерильность» различных БЛП методом прямого посева был выявлен ряд проблемных аспектов.

При испытании отдельной категории БЛП — высокобелковых препаратов крови и сывороток — методом прямого посева с использованием питательной среды Сабуро, обладающей низким значением pH (5,6±0,2), после внесения испытуемой пробы наблюдалось изменение внешнего вида и физического состояния питательной среды или образца, а именно, появлялись хлопья, осадок, изменение цвета, не связанные с качеством среды или самого образца, что свидетельствует об отрицательном влиянии условий испытания на жизнеспособность возможных микроорганизмов-контаминантов, при этом достоверность полученных результатов сомнительна. Подобные явления наблюдали при испытании 13% наименований БЛП (например, Иммуноглобулиновый комплексный препарат (КИП)⁹, Габриглобин®-IgG¹⁰, Иммуноглобулин человека нормальный¹¹ и др.). Присутствие в толще питательной среды Сабуро посторонних включений и изменение цвета не позволяло наблюдать рост возможных микроорганизмов и вызывало затруднения и неопределенность при предварительном просмотре посевов и окончательном учете и интерпретации результатов контроля. Как правило, процедура испытания подобных препаратов включает пересев на свежую питательную среду для подтверждения достоверности результатов контроля.

В связи с этим при разработке методики рекомендуется исключить использование питательной среды Сабуро при проведении испытания на стерильность препаратов, вызывающих изменение внешнего вида среды, не связанное с качеством испытуемого материала¹². В этом случае испытание на стерильность рекомендуется проводить с использованием тиогликолевой или жидкой соево-казеиновой питательных сред.

Испытания БЛП, содержащих ртутные консерванты, рекомендуется проводить методом прямого посева с использованием свежеприготовленной (1–3 сут), обладающей нейтрализующими свойствами тиогликолевой среды в качестве универсальной для выявления аэробных и анаэробных бактерий и грибов, при условии соответствия ее ростовых и нейтрализующих свойств в отношении тестовых микроорганизмов, а инкубацию посевов проводить при двух температурных режимах¹³. В настоящее время, учитывая данные рекомендации, испытания стерильности 10% наименований препаратов, содержащих ртутный консервант, проводят на тиогликолевой среде при двух температурных режимах инкубации.

В действующих НД на ряд БЛП (Анатоксин стафилококковый очищенный¹⁴, КОКАВ Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная¹⁵, Вакцина Е сыпнотифозная комбинированная живая (ЖКСВ-Е)¹⁶ и др.) методика испытания предусматривает использование питательных сред, разлитых в емкости (пробирки), укупоренные ватно-марлевыми пробками, предназначенные для внесения, как правило, одного испытуемого образца небольшого объема (1–2 мл). Процедура откупорки и внесения испытуемого образца является критической точкой испытания, увеличивающей риск контаминации и получения ложноположительного результата.

В этом случае рекомендуется предусмотреть в методике испытаний использование питательных сред, разлитых в стеклянные флаконы большого объема, закрытые резиновыми пробками и завальцованные, что сокращает количество емкостей с питательными средами, снижает риск контаминации и повышает надежность испытания. Кроме того, рекомендуется высевать содержимое каждого образца или общую объединенную пробу, полученную в отдельной емкости или шприце большого объема (20–50 мл), непосредственно в емкость с питательной средой и внесение образца проводить через «окошко» алюминиевого колпачка, осторожно перемешивая до равномерного распределения препарата в питательной среде, исключая риск контаминации из внешней среды¹⁷.

Ретроспективный анализ результатов экспертизы НД (первичные данные, протоколы валидации) на препараты за последние три года показал, что в 50% случаев процедура испытания БЛП включала один метод прямого посева и 15% из этих случаев составляли препараты в жидкой лекарственной форме в емкостях большого объема, от 10 мл и более (Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная очищенная концентрированная¹⁸, 10 мл; Иммуновенин®¹⁹, 25 мл; Габриглобин®-IgG²⁰, 25 мл и 50 мл; Бактериофаги специфичные к Pseudomonas aeruginosa²¹, 1000 мл). Учитывая, что согласно требованиям ГФ РФ (ОФС.1.2.4.0003.15²²) для проведения испытания используют не весь материал, а только 1/2 объема первичной упаковки, что уменьшает выборку, испытание методом прямого посева следует считать малоинформативным. Кроме того, процедура испытания методом прямого посева перечисленных препаратов, выпускаемых большими сериями, весьма трудоемка и экономически нецелесообразна, поскольку требует использования значительного количества емкостей и питательных сред. Так, например, для проведения испытания 20 емкостей препарата объемом упаковки 25 мл методом прямого посева в соотношении 1:20 потребуется 480 пробирок с объемом питательный среды 20 мл или 48 флаконов с объемом среды 200 мл. В этом случае при анализе БЛП в большой первичной упаковке (от 10 мл и более) по показателю «Стерильность» рекомендуется разработать и верифицировать методику, включающую метод мембранной фильтрации²³.

Метод мембранной фильтрации

Возможность использования метода мембранной фильтрации для испытания стерильности определяется природой, составом испытуемого образца, его способностью растворяться и проходить через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм [5]. Следует отметить, что производители в 35% случаев включают этот метод в схему испытания по показателю «Стерильность». Однако основные проблемы, выявляемые экспертами ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России при испытании методом мембранной фильтрации, касаются затруднений при проведении процедуры фильтрации.

Выполнение процедуры фильтрации согласно методике, изложенной в НД, трудновыполнимо, что связано с использованием неподходящего растворителя, неверной температуры, неустановленного времени растворения, а также высокой белковой нагрузки на мембрану (Киовиг®²⁴, Вилате® Нео²⁵, ОКТАПЛЕКС®²⁶).

В этих случаях при разработке методики испытания методом мембранной фильтрации и описании процедуры растворения лиофилизированных образцов БЛП рекомендуется предусмотреть использование растворителя в соответствии с инструкцией по применению или других подходящих жидкостей, не обладающих антимикробным действием, рекомендованных ГФ РФ (ОФС.1.2.4.0003.15)²⁷, а также предусмотреть увеличение времени растворения труднорастворимых образцов или использование растворителя, нагретого до температуры не выше 44–45 °С²⁸. Также в методике необходимо указать максимально возможный объем пробы, фильтруемый через один мембранный фильтр, определить количество мембранных фильтров, необходимое для испытания отобранных образцов.

Для увеличения скорости фильтрации вязких белковых препаратов рекомендуется предварительно развести испытуемый образец. Разведение следует готовить непосредственно в канистрах для фильтрации или в отдельной стерильной емкости в установленном соотношении, используя стерильную промывочную жидкость.

При проведении испытаний БЛП в ходе экспертизы на этапе фильтрации некоторых образцов препаратов, содержащих в составе стабилизаторы (алюминия гидроксид, сквалан) или консерванты (формальдегид), возникали проблемы, связанные с образованием на поверхности мембранных фильтров плотного труднопроницаемого осадка/«пласта», затрудняющего фильтрование и отмывку (АДАСЕЛЬ®²⁹, Вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая³⁰) или образование в толще питательной среды мутности при использовании недостаточного количества промывочной жидкости (Конвасэл®³¹).

В этом случае при разработке методики испытания рекомендуется экспериментально определить и указать количество мембранных фильтров, необходимых для фильтрации отобранных образцов, с учетом особенностей испытуемого материала и упаковки препарата. В ходе верификации методики испытания необходимо подобрать промывочную жидкость, определить ее объем и количество циклов промывки, обеспечивающих устранение потенциального антимикробного действия, восстановление значения рН и освобождение мембранных фильтров от испытуемой пробы препарата³².

При испытании образцов БЛП, относящихся к препаратам крови (Иммуноглобулин Сигардис МТ³³, Иммуновенин®³⁴, Иммуноглобулин антирабический³⁵), процедура фильтрации сопровождалась нежелательным явлением — пенообразованием, которое приостанавливало ход фильтрации и не устранялось в процессе отмывки, что затрудняло внесение питательных сред в канистры для фильтрации.

В связи с этим при разработке методики испытания стерильности препаратов крови методом мембранной фильтрации для уменьшения явления пенообразования рекомендуется предусмотреть проведение фильтрации при более низких значениях.

Рекомендации к содержанию раздела «Стерильность» нормативной документации

В случае применения метода прямого посева рекомендуется привести подробное и последовательное описание методики, условия проведения испытания, сведений об антимикробном действии препарата, способах его устранения и в разделе «Стерильность» НД указать следующую информацию³⁶:

• наименование используемых питательных сред;
• количество испытуемого материала или образцов препарата, необходимое для проведения испытания с учетом объема серии и упаковки;
• наименование растворителя и условия растворения лиофилизированного образца;
• количественное соотношение испытуемой пробы и питательной среды;
• обоснование пересева на 5–7 сут инкубации в случае посева мутных препаратов или вызывающих помутнение питательных сред;
• количественное соотношение отобранной пробы и питательной среды при пересеве;
• возможные изменения внешнего вида питательной среды в зоне посева и при пересеве в период инкубации при предварительном и окончательном учете результатов испытания;
• в случае отклонений от процедуры учета результатов, изложенной в ГФ РФ (ОФС.1.2.4.0003.15)³⁷, рекомендуется привести подробное описание порядка учета, позволяющее правильно интерпретировать результаты испытания.

В случае применения метода мембранной фильтрации рекомендуется в разделе «Стерильность» НД указать следующую информацию³⁸:

• наименование используемых питательных сред;
• количество испытуемого материала или образцов препарата, необходимое для проведения испытания, с учетом объема серии и упаковки;
• наименование растворителя и условия растворения лиофилизированного образца;
• наименование промывочной жидкости;
• необходимость разведения испытуемой пробы (с указанием соотношения) перед фильтрацией;
• максимально допустимый объем испытуемого образца, фильтруемый через один мембранный фильтр;
• наименование и объем промывочной жидкости (количество циклов отмывки), используемый для смачивания и отмывки одного (каждого) мембранного фильтра;
• в случае отклонений от процедуры учета результатов, изложенной в ГФ РФ (ОФС.1.2.4.0003.15)³⁹, рекомендуется привести подробное описание порядка учета, позволяющее правильно интерпретировать результаты испытания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представлены рекомендации по разработке производителями биологических лекарственных препаратов методик испытания стерильности препаратов на основе фармакопейных методов, позволяющие унифицировать подход к контролю качества препаратов по показателю «Стерильность».

Рекомендации могут быть использованы предприятиями-изготовителями, контрольными лабораториями, экспертными организациями и учитываться при разработке методик испытаний различных по своим свойствам биологических лекарственных препаратов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: З.Е. Бердникова — концепция исследования, написание текста рукописи, утверждение окончательной версии статьи для публикации; А.С. Тихонова — анализ и обобщение данных литературы, написание текста рукописи.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Z.E. Berdnikova conceptualised the study, drafted the manuscript, and approved the final version for publication. A.S. Tikhonova analysed and summarised literature data and drafted the manuscript.