Оптимизация условий культивирования клона-продуцента, коэкспрессирующего арилсульфатазу B и формилглицин-генерирующий фермент, с целью повышения выхода фермента арилсульфатазы B

Синдром Марото—Лами (мукополисахаридоз VI типа) — орфанное генетическое заболевание, вызванное мутациями гена ARSB, который кодирует лизосомальный фермент арилсульфатазу В. Актуальность исследования заключается в необходимости разработки отечественного препарата рекомбинантной арилсульфатазы В для лечения пациентов с данным заболеванием в Российской Федерации. Ранее были получены клеточные линии-продуценты, коэкспрессирующие целевой фермент арилсульфатазу В и вспомогательный формилглицин-генерирующий фермент на основе клеточной линии СНО. Однако для дальнейшей разработки препарата рекомбинантной арилсульфатазы В представляется важным повышение выхода фермента. Цель работы: увеличение продуктивности клонов-продуцентов за счет оптимизации процесса культивирования и добавления в культуральную среду хлорида кальция и сульфата меди. Материалы и методы: использовали суспензионную клеточную линию СНО. Моноклональные клеточные линии получали с использованием систем Cell Metric и Clone Pix FL. Концентрацию арилсульфатазы В в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Использовали периодическое культивирование (batch culture) и/или периодическое культивирование с подпиткой (fedbatch culture) в среде с добавлением различных концентраций сульфата меди и хлорида кальция. Результаты: продемонстрировано, что одновременное добавление сульфата меди и хлорида кальция в концентрации 300 мкM при периодическом культивировании клонов-продуцентов, коэкспрессирующих арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, увеличивает жизнеспособность культур и повышает удельную продуктивность клеток до 4,58±1,62 пг/(клетка×сут). При культивировании лидерного клона-продуцента, коэкспрессирующего арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, в условиях периодического культивирования с подпиткой длительностью 12 сут достигнуто увеличение выхода активного лизосомального фермента арилсульфатазы В до 420 мг/л при добавлении в ростовую среду сульфата меди в концентрации 300 мкM. Выводы: культивирование клонов-продуцентов, коэкспрессирующих арилсульфатазу В и формилглицин-генерирующий фермент, в условиях периодического культивирования с подпиткой и с добавлением в среду сульфата меди приводит к значительному улучшению ростовых свойств клеточной линии и выхода целевого фермента. Данный подход в подборе условий культивирования продуцентов можно применять к другим ферментам подкласса сульфатаз.

1. Remondino RG, Tello CA, Noel M, Wilson AF, Galaretto E, Bersusky E, Piantoni L. Clinical manifestations and surgical management of spinal lesions in patients with mucopolysaccharidosis: a report of 52 cases. Spine Deform. 2019;7(2):298–303. https://doi.org/10.1016/j.jspd.2018.07.005

2. Mikami T, Kitagawa H. Biosynthesis and degradation of glycans of the extracellular matrix: sulfated glycosaminoglycans, hyaluronan, and matriglycan. In: Barchi JJ, ed. Comprehensive Glycoscience. 2nd ed. Elsevier B.V.; 2021. P. 29–62. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819475-1.00018-3

3. Mehta A, Winchester B, eds. Lysosomal Storage Disorders: A Practical Guide. John Wiley & Sons, Ltd.; 2012. https://doi.org/10.1002/9781118514672

4. Harmatz P, Hendriksz CJ, Lampe C, McGill JJ, Parini R, Leão-Teles E, et al. The effect of galsulfase enzyme replacement therapy on the growth of patients with mucopolysaccharidosis VI (Maroteaux-Lamy syndrome). Mol Genet Metab. 2017;122(1–2):107–12. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2017.03.008

5. Garcia P, Phillips D, Johnson J, Martin K, Randolph LM, Rosenfeld H, Harmatz P. Long-term outcomes of patients with mucopolysaccharidosis VI treated with galsulfase enzyme replacement therapy since infancy. Mol Genet Metab. 2021;133(1):100–8. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2021.03.006

6. de Ruijter J, de Ru MH, Wagemans T, Ijlst L, Lund AM, Orchard PJ, at al. Heparan sulfate and dermatan sulfate derived disaccharides are sensitive markers for newborn screening for mucopolysaccharidoses types I, II and III. Mol Genet Metab. 2012;107(4):705– 10. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2012.09.024

7. Baenziger JU. A major step on the road to understanding a unique posttranslational modification and its role in a genetic disease. Cell. 2003;113(4):421–2. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(03)00354-4

8. Peng J, Alam S, Radhakrishnan K, Mariappan M, Rudolph MG, May C, et al. Eukaryotic formylglycine-generating enzyme catalyses a monooxygenase type of reaction. FEBS J. 2015;282(17):3262–74. https://doi.org/10.1111/febs.13347

9. Appel MJ, Bertozzi CR. Formylglycine, a post-translationally generated residue with unique catalytic capabilities and biotechnology applications. ACS Chem Biol. 2015;10(1):72–84. https://doi.org/10.1021/cb500897w

10. Dierks T, Miech C, Hummerjohann J, Schmidt B, Kertesz MA, von Figura K. Posttranslational formation of formylglycine in prokaryotic sulfatases by modification of either cysteine or serine. J Biol Chem. 1998;273(40):25560–4. https://doi.org/10.1074/jbc.273.40.25560

11. Bond CS, Clements PR, Ashby SJ, Collyer CA, Harrop SJ, Hopwood JJ, Guss JM. Structure of a human lysosomal sulfatase. Structure. 1997;5(2):277–89. https://doi.org/10.1016/s0969-2126(97)00185-8

12. Dierks T, Dickmanns A, Preusser-Kunze A, Schmidt B, Mariappan M, von Figura K, et al. Molecular basis for multiple sulfatase deficiency and mechanism for formylglycine generation of the human formylglycine-generating enzyme. Cell. 2005;121(4):541–52. https://doi.org/10.1016/j.cell.2005.03.001

13. Dickmanns A, Schmidt B, Rudolph MG, Mariappan M, Dierks T, von Figura K, Ficner R. Crystal structure of human pFGE, the paralog of the Calpha-formylglycine-generating enzyme. J Biol Chem. 2005;280(15):15180–7. https://doi.org/10.1074/jbc.M414317200

14. Mariappan M, Preusser-Kunze A, Balleininger M, Eiselt N, Schmidt B, Gande SL, et al. Expression, localization, structural, and functional characterization of pFGE, the paralog of the Cα-formylglycine-generating enzyme. J Biol Chem. 2005;280(15):15173–9. https://doi.org/10.1074/jbc.M413698200

15. Ghosh D. Three-dimensional structures of sulfatases. Methods Enzymol. 2005;400:273–93. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(05)00016-9

16. Holder PG, Jones LC, Drake PM, Barfield RM, Bañas S, de Hart GW, et al. Reconstitution of formylglycine-generating enzyme with copper(II) for aldehyde tag conversion. J Biol Chem. 2015;290(25):15730–45. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.652669

17. Appel MJ, Meier KK, Lafrance-Vanasse J, Lim H, Tsai CL, Hedman B, et al. Formylglycine-generating enzyme binds substrate directly at a mononuclear Cu(I) center to initiate O2 activation. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116(12):5370–5. https://doi.org/10.1073/pnas.1818274116

18. York D, Baker J, Holder PG, Jones LC, Drake PM, Barfield RM, et al. Generating aldehyde-tagged antibodies with high titers and high formylglycine yields by supplementing culture media with copper(II). BMC Biotechnol. 2016;16:23. https://doi.org/10.1186/s12896-016-0254-0

19. Knop M, Dang TQ, Jeschke G, Seebeck FP. Copper is a cofactor of the formylglycine-generating enzyme. Chembiochem. 2017;18(2):161–5. https://doi.org/10.1002/cbic.201600359

20. Roeser D, Preusser-Kunze A, Schmidt B, Gasow K, Wittmann JG, Dierks T, et al. A general binding mechanism for all human sulfatases by the formylglycine-generating enzyme. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(1):81–6. https://doi.org/10.1073/pnas.0507592102

21. Schlotawa L, Wachs M, Bernhard O, Mayer FJ, Dierks T, Schmidt B, Radhakrishnan K. Recognition and ER quality control of misfolded formylglycine-generating enzyme by protein disulfide isomerase. Cell Rep. 2018;24(1):27–37.e4. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.06.016

22. Тимонова СС, Смолова КА, Зарипова ДТ, Пантюшенко МС, Королева МА, Анисимов РЛ и др. Увеличение продуктивности клеточной линии-продуцента арилсульфатазы B за счет коэкспрессии формилглицин-генерирующего фермента. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2022;22(1):80–93. https://doi.org/10.30895/2221996X-2022-22-1-80-93

23. Тимонова СС, Пантюшенко МС, Тихонов РВ, Пискунов АА, Бадэ ВН. Оптимизация процесса культивирования клона-продуцента рекомбинантного лизосомального фермента идуронат-2-сульфатазы. Биотехнология. 2021;37(2):34–47. https://doi.org/10.21519/0234–2758–2021–37–2–34–47

24. Muralidharan-Chari V, Wurz Z, Doyle F, Henry M, Diendorfer A, Tenenbaum SA, et al. PTSelect™: a post-transcriptional technology that enables rapid establishment of stable CHO cell lines and surveillance of clonal variation. J Biotechnol. 2021;325:360– 71. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.09.025

25. Christianson TM, Starr CM, Zankel TC. Overexpression of inactive arylsulphatase mutants and in vitro activation by light-dependent oxidation with vanadate. Biochem J. 2004;382(2):581–7. https://doi.org/10.1042/BJ20040447

26. Gupta SK, Srivastava SK, Sharma A, Nalage VHH, Salvi D, Kushwaha H, et al. Metabolic engineering of CHO cells for the development of a robust protein production platform. PLoS One. 2017;12(8):e0181455. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181455

27. Mulukutla BC, Yongky A, Le T, Mashek DG, Hu WS. Regulation of glucose metabolism — a perspective from cell bioprocessing. Trends Biotechnol. 2016;34(8):638–51. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2016.04.012

28. Tsao YS, Cardoso AG, Condon RG, Voloch M, Lio P, Lagos JC, et al. Monitoring Chinese hamster ovary cell culture by the analysis of glucose and lactate metabolism. J Biotechnol. 2005;118(3):316–27. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2005.05.016

29. Martínez-Monge I, Comas P, Triquell J, Casablancas A, Lecina M, Paredes CJ, Cairó JJ. Concomitant consumption of glucose and lactate: a novel batch production process for CHO cells. Biochem Eng J. 2019;151:107358. https://doi.org/10.1016/j.bej.2019.107358

30. Qian Y, Khattak SF, Xing Z, He A, Kayne PS, Qian NX, et al. Cell culture and gene transcription effects of copper sulfate on Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Prog. 2011;27(4):1190–4. https://doi.org/10.1002/btpr.630