Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе

Векторы на основе аденоассоциированного вируса являются одними из наиболее перспективных для доставки трансгенов в различные органы и ткани. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) способен трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, обладает низкой иммуногенностью и способен обеспечивать долгосрочную экспрессию трансгенов. На сегодняшний день существуют технологии, позволяющие получать rAAV для применения in vivo, однако они не лишены недостатков, связанных с трудоемкостью, сложностями масштабирования и высокой стоимостью, поэтому вопрос об усовершенствовании технологических схем получения rAAV является актуальным. Цель работы: сравнение технологических подходов к получению rAAV, основанных на различных условиях культивирования трансфицированной клеточной линии HEK293 в лабораторном масштабе. Материалы и методы: в исследовании использовали культуру клеток HEK293, плазмидную систему AAV-DJ Packaging System, систему PlasmidSelect Xtra Starter Kit. В качестве модели для сравнения технологий использовали вектор rAAV с трансгеном однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1, специфичного к ботулотоксину. Применяли метод трансфекции клеток HEK293 суперскрученной плазмидной ДНК, выделенной при помощи трехступенчатой хроматографической очистки. Определение подлинности препарата rAAV проводили методами электрофореза, иммуноблоттинга и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Результаты: продемонстрирована эффективность получения суперскрученной формы плазмидной ДНК, применимой для эффективной трансфекции с целью получения rAAV. Проведено сравнение процесса транзиентной трансфекции и культивирования трансфицированных клеток HEK293 в условиях суспензии в колбах, адгезии в культуральных флаконах и адгезии в биореакторе BioBLU 5p на матрице из дисков Fibra-Cel с целью продукции rAAV. Выводы: показана возможность применения описанных подходов к очистке плазмидной ДНК, трансфекции и культивированию трансфицированных клеток в различных условиях для получения препарата rAAV, эспрессирующего ген антитела. Реактор BioBLU 5p с дисками Fibra-Cel был впервые использован для получения препаративных количеств rAAV в лабораторном масштабе, что позволило увеличить площадь поверхности адгезии при культивировании и трансфекции клеток и, как следствие, увеличить выход целевого продукта.

1. Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL, Strohl WR. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 2017;31(4):317–34. https://doi.org/10.1007/s40259-017-0234-5

2. Samulski RJ, Muzyczka N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 2014;1(1):427–51. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-031413-085355

3. Choi VW, McCarty DM, Samulski RJ. Host cell DNA repair pathways in adeno-associated viral genome processing. J Virol. 2006;80(21):10346–56. https://doi.org/10.1128/JVI.00841-06

4. Mays LE, Wang L, Lin J, Bell P, Crawford A, Wherry EJ, Wilson JM. AAV8 induces tolerance in murine muscle as a result of poor APC transduction, T cell exhaustion, and minimal MHCI upregulation on target cells. Mol Ther. 2014;22(1):28–41. https://doi.org/10.1038/mt.2013.134

5. Ahi YS, Bangari DS, Mittal SK. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Curr Gene Ther. 2011;11(4):307–20. https://doi.org/10.2174/156652311796150372

6. Grieger JC, Soltys SM, Samulski RJ. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 2016;24(2):287–97. https://doi.org/10.1038/mt.2015.187

7. Rajendra Y, Kiseljak D, Baldi L, Wurm FM, Hacker DL. Transcriptional and post-transcriptional limitations of high-yielding, PEI-mediated transient transfection with CHO and HEK-293E cells. Biotechnol Prog. 2015;31(2):541–9. https://doi.org/10.1002/btpr.2064

8. Wright JF. Transient transfection methods for clinical adeno-associated viral vector production. Hum Gene Ther. 2009;20(7):698–706. https://doi.org/10.1089/hum.2009.064

9. Keeler AM, Flotte TR. Recombinant adeno-associated virus gene therapy in light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): Where are we, and how did we get here? Annu Rev Virol. 2019;6(1):601–21. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-092818-015530

10. Godakova SA, Noskov AN, Vinogradova ID, Ugriumova GA, Solovyev AI, Esmagambetov IB, et al. Camelid VHHs fused to human Fc fragments provide long term protection against botulinum neurotoxin A in mice. Toxins (Basel). 2019;11(8):464. https://doi.org/10.3390/toxins11080464

11. Froger A, Hall JE. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. 2007;6:253. https://doi.org/10.3791/253

12. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979;7(6):1513–23. https://doi.org/10.1093/nar/7.6.1513

13. Merten OW. AAV vector production: state of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Therapy Insights. 2016;2(5):521–51.

14. Sousa F, Prazeres DMF, Queiroz JA. Improvement of transfection efficiency by using supercoiled plasmid DNA purified with arginine affinity chromatography. J Gene Med. 2009;11(1):79–88. https://doi.org/10.1002/jgm.1272

15. Diogo MM, Queiroz JA, Prazeres DMF. Chromatography of plasmid DNA. J Chromatogr A. 2005;1069(1):3–22. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2004.09.050

16. Stadler J, Lemmens R, Nyhammar T. Plasmid DNA purification. J Gene Med. 2004;6(Suppl 1):S54–S66. https://doi.org/10.1002/jgm.512

17. Cupillard L, Juillard V, Latour S, Colombet G, Cachet N, Richard S, et al. Impact of plasmid supercoiling on the efficacy of a rabies DNA vaccine to protect cats. Vaccine. 2005;23(16):1910–6. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2004.10.018

18. Zhao H, Lee KJ, Daris M, Lin Y, Wolfe T, Sheng J, et al. Creation of a high-yield AAV vector production platform in suspension cells using a design of experiment approach. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;18:312–20. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2020.06.004

19. Nass SA, Mattingly MA, Woodcock DA, Burnham BL, Ardinger JA, Osmond SE, et al. Universal method for the purification of recombinant AAV vectors of differing serotypes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017;9:33–46. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2017.12.004

20. Sommer JM, Smith PH, Parthasarathy S, Isaacs J, Vijay S, Kieran J, et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 2003;7(1):122–8. https://doi.org/10.1016/s1525-0016(02)00019-9

21. Benskey MJ, Sandoval IM, Manfredsson FP. Continuous Collection of Adeno-Associated Virus from Producer Cell Medium Significantly Increases Total Viral Yield. Hum Gene Ther Methods. 2016;27(1):32–45. https://doi.org/10.1089/hgtb.2015.117

22. Hajba L, Guttman A. Recent Advances in the Analysis Full/Empty Capsid Ratio and Genome Integrity of Adeno-associated Virus (AAV) Gene Delivery Vectors. Curr Mol Med. 2020;20(10):806–13. https://doi.org/10.2174/1566524020999200730181042

23. Crosson SM, Dib P, Smith KJ, Zolotukhin S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018;10:1–7. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.05.001