Preview

БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение

Расширенный поиск

Изучение возможности использования метода qPCR для контроля отсутствия микоплазменной контаминации в клеточных культурах

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2017-17-3-173-179

Полный текст:

Аннотация

Микоплазмы - основные контаминанты клеточных культур. Персистируя в клеточных культурах, микоплазмы многообразно влияют на функционирование клеток-хозяев. Проведение экспериментов на таких контаминированных клетках нерационально, как и наработка в них белка. Цель работы - изучить возможность быстрого выявления контаминации микоплазмами культур клеток и биотехнологических продуктов с воспроизведением ранее разработанной методики, при внесении в нее упрощающих модификаций, повышающих доступностность такого анализа в России, а также оценить возможность валидации методики для контроля в процессе производства. Из уже существующих методик детекции микоплазмы методом qPCR (quantitative PCR) была выбрана наиболее пригодная для работы, произведена модификация анализа: дорогостоящие и недоступные к синтезу в России MGB-зонды были заменены на обычные флуоресцентные. Воспроизводимость и чувствительность модифицированной методики были изучены на примере работы с M. hominis. Чувствительность данного теста достигает 10 генных копий микоплазм на реакцию. На основании сопоставления полученных результатов и регламентируемых нормативными документами требований к методам детекции микоплазм сделан вывод, что предложенная методика на основе qPCR анализа хорошо подходит для своевременной и регулярной проверки культур клеток на предмет контаминации микоплазмами, теоретически нет никаких противоречий с современной регламентирующей документацией для использования этого метода в качестве основного.

Об авторах

Н. Д. Ёлшин
Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
Россия
Младший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии


А. В. Петров
Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
Россия
Начальник лаборатории иммунофармакологии


Список литературы

1. Langdon SP. Cell culture contamination: an overview. Methods Mol Med. 2004; 88: 309-17.

2. Uphoff CC, Denkmann SA, Drexler HG. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin. J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 267678.

3. Rottem S, Barile MF. Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol. 1993; 11(4): 143-51.

4. Stemke GW, Robertson JA. Comparison of two methods for enumeration of mycoplasmas. J Clin Microbiol. 1982; 16(5): 959-61.

5. Olarerin-George AO, Hogenesch JB. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI’s RNA-seq archive. Nucleic Acids Res. 2015; 43(5): 2535-42.

6. van Kuppeveld FJ, van der Logt JT, Angulo AF, van Zoest MJ, Quint WG, Niesters HG, et al. Genus- and species-specific identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification. Appl Environ Microbiol. 1992; 58(8): 2606-15.

7. Lincoln CK, Gabridge MG. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods Cell Biol. 1998; 57: 49-65.

8. ОФС. 1.7.2.0031.15. Испытание на присутствие микоплазм. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. Т. 2. М.; 2015. С. 827-35. Available from: http://www.femb.ru/feml.

9. 6.7. Mycoplasmas. European Pharmacopoeia 9.0. Available from: http://pharmeuropa.edqm.eu/ep900.

10. Volokhov DV, Graham LJ, Brorson KA, Chizhikov VE. Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Mol Cell Probes 2011; 25(2 - 3): 69-77.

11. Ёлшин НД. Определение остаточной ДНК клеток-продуцентов E. Coli и CHO в субстанциях рекомбинантых белков методом qPCR. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16(4): 245-52.

12. Janetzko K, Rink G, Hecker A, Bieback K, Kluter H, Bugert P. A single-tube real-time PCR assay for Mycoplasma detection as a routine quality control of cell therapeutics. Transfus Med Hemother. 2014; 41(1): 83-9.

13. st WHO International Standard for mycoplasma DNA for nucleic acid amplification technique-based assays designed for generic mycoplasma detection. Available from: https://goo.gl/Ue2xP9.

14. Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, Gorn VV, Lukhtanov EA, Belousov ES, et al. 3’-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 2000; 28(2): 655-61.

15. Шалунова НВ, Волкова РА, Волгин АР, Петручук ЕМ, Бердникова ЗЕ, Эльберт ЕВ и др. Микоплазмы - контаминанты клеточных культур. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16(3): 151-60.

16. Peredeltchouk M, David SA, Bhattacharya B, Volokhov DV, Chizhikov V. Detection of mycoplasma contamination in cell substrates using reverse transcription-PCR assays. J Appl Microbiol. 2011; 110(1): 54-60.


Для цитирования:


Ёлшин Н.Д., Петров А.В. Изучение возможности использования метода qPCR для контроля отсутствия микоплазменной контаминации в клеточных культурах. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017;17(3):173-179. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2017-17-3-173-179

For citation:


Yolshin N.D., Petrov A.V. Possibilities of qPCR control of mycoplasma contamination of cell cultures. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2017;17(3):173-179. (In Russ.) https://doi.org/10.30895/2221-996X-2017-17-3-173-179

Просмотров: 18


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2221-996X (Print)
ISSN 2619-1156 (Online)