Получение клонов-продуцентов фермента кислой альфа-глюкозидазы на основе клеток линии СНО-К1

ВВЕДЕНИЕ. Разработка биофармацевтического препарата для ферментной заместительной терапии на основе рекомбинантной кислой α-1,4-глюкозидазы (α-глюкозидаза) является актуальной задачей, решение которой может позволить обеспечить пациентов с болезнью Помпе необходимым количеством препарата в Российской Федерации. В работе показан эффективный способ получения стабильного промышленного клона-­продуцента на основе клеток линии СНО-К1, продуцирующего активную α-глюкозидазу.

ЦЕЛЬ. Получение моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантной кислой α-глюкозидазы и оценка стабильности ростовых показателей и продуктивности в ходе культивирования в течение 60 генераций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Суспензионную клеточную линию СНО-К1 (ECACC) культивировали в среде BalanCD Growth A. Трансфекцию клеток проводили электропорацией на систе­ме MaxCyte (по протоколу СНО). Селекцию продуцентов проводили с использованием пуромицина (5 мкг/мл). Клонирование осуществляли с помощью системы дозирования клеток на основе микрофлюидной технологии (C.SIGHT). Моноклональность клеточных линий подтверждали с применением автоматизированной системы визуализации клеток (Cell Metric CLD). Концентрацию α-глюкозидазы в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Активность фермента измеряли колориметрически с субстратом 4-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид (pNP-α-D-Glc).

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен скрининг 1000 продуцентов, в результате которого отобраны 22 клеточные линии с продуктивностью 0,14–0,65 г/л. Лидерный продуцент α-глюкозидазы GAA-14 клонировали с последующим подтверждением моноклональности. Получена панель из 20 моноклональных линий. Удельная активность фермента и содержание остатков маннозо-6-фосфата (М6Р) (4,3±0,9 ЕД/мг; 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка соответственно) не отличались от референтного препарата. При изучении стабильности лидерного клона в течение 60 генераций показано сохранение ростовых характеристик: жизнеспособность 98,5±1,5%, время удвоения популяции 20,0±1,3 ч, продуктивность 450±20 мг/л при периодическом культивировании в течение 7 сут.

ВЫВОДЫ. Получена стабильная моноклональная клеточная линия-продуцента α-глюкозидазы на основе СНО-К1, обеспечивающая продукцию активного фермента 0,45 г/л на 7 сут. Полученный клон-продуцент пригоден для масштабирования и наработки субстанции для доклинических исследований.

1. Herzog A, Hartung R, Reuser AJ, et al. A cross-sectional single-centre study on the spectrum of Pompe disease, German patients: molecular analysis of the GAA gene, manifestation and genotype-phenotype correlations. Orphanet J Rare Dis. 2012;7:35. https://doi.org/10.1186/1750-1172-7-35

2. Wan L, Lee CC, Hsu CM, et al. Identification of eight novel mutations of the acid alpha-glucosidase gene causing the infantile or juvenile form of glycogen storage disease type II. J Neurol. 2008;255(6):831–8. https://doi.org/10.1007/s00415-008-0714-0

3. Taverna S, Cammarata G, Colomba P, et al. Pompe disease: Pathoge­nesis, molecular genetics and diagnosis. Aging (Albany NY). 2020;12(15):15856–74. https://doi.org/10.18632/aging.103794

4. Risi B, Caria F, Bertella E, et al. Management of Pompe disease alongside and beyond ERT: A narrative review. Acta Myol. 2025;44(1):11–22. https://doi.org/10.36185/2532-1900-1106

5. Chien YH, Chen HA, Hsu RH, et al. Efficacy of transitioning from alglucosidase alfa to avalglucosidase alfa in infantile-onset Pompe disease: A single-center cohort analysis. Genet Med. 2025;27(5):101373. https://doi.org/10.1016/j.gim.2025.101373

6. Kishnani PS, Díaz-Manera J, Illarioshkin S, et al. Efficacy and safety of avalglucosidase alfa in patients with late-onset Pompe disease after 145 weeks of treatment during the COMET trial. J Neurol. 2025;272(9):581. https://doi.org/10.1007/s00415-025-13266-y

7. Le Bras A, De Lonlay P, Attarian S, et al. Medical expenses and care pathways of patients with Pompe receiving myozyme: an observational study based on the French national healthcare database. Orphanet J Rare Dis. 2025;20(1):554. https://doi.org/10.1186/s13023-025-03866-2

8. Jung JW, Huy NX, Kim HB, et al. Production of recombinant human acid α-glucosidase with high-mannose glycans in GnT1 rice for the treatment of Pompe disease. J Biotechnol. 2017;249:42–50. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.03.033

9. Jung JW, Kim NS, Jang SH, et al. Production and characteri­zation of recombinant human acid α-glucosidase in transgenic rice cell suspension culture. J Biotechnol. 2016;226: 44–53. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.03.031

10. Sariyatun R, Florence, Kajiura H, et al. Production of human acid-alpha glucosidase with a paucimannose structure by glycoengineered arabidopsis cell culture. Front Plant Sci. 2021;12:703020. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.703020

11. Bohnsack RN, Misra SK, Liu J, et al. Lysosomal enzyme binding to the cation-independent mannose 6-phosphate receptor is regulated allosterically by insulin-like growth factor 2. Sci Rep. 2024;14(1):26875. https://doi.org/10.1038/s41598-024-75300-9

12. Liu L, Lee WS, Doray B, Kornfeld S. Engineering of GlcNAc-1-phosphotransferase for production of highly phosphorylated lysosomal enzymes for enzyme replacement therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017;5:59–65. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2017.03.006

13. Caval T, Zhu J, Tian W, et al. Targeted analysis of lysosomal directed proteins and their sites of mannose-6-phosphate modification. Mol Cell Proteomics. 2019;18(1):16–27. https://doi.org/10.1074/mcp.RA118.000967

14. Zhang X, Liu H, Meena N, et al. Chemoenzymatic glycan-selective remodelling of a therapeutic lysosomal enzyme with high-affinity M6P-glycan ligands. Enzyme substrate specificity is the name of the game. Chem Sci. 2021;12(37):12451–62. https://doi.org/10.1039/d1sc03188k

15. Steger K, Brady J, Wang W, et al. CHO-S antibody titers >1 gram/liter using flow electroporation-mediated transient gene expression followed by rapid migration to high-yield stable cell lines. J Biomol Screen. 2015;20(4):545–51. https://doi.org/10.1177/1087057114563494

16. Anumula KR. Quantitative determination of monosaccharides in glycoproteins by high-performance liquid chromatography with highly sensitive fluorescence detection. Anal Biochem. 1994;220(2):275–83. https://doi.org/10.1006/abio.1994.1338

17. Trivedi PC, Bartlett JJ, Pulinilkunnil T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 2020;9(5):1131. https://doi.org/10.3390/cells9051131

18. Feng X, Liu S, Xu H. Not just protons: Chloride also activates lyso­somal acidic hydrolases. J Cell Biol. 2023;222(6):e202305007.

19. Neuss A, Steimann T, Tomas Borges JS, et al. Scale-up of CHO cell cultures: From 96-well-microtiter plates to stirred tank reactors across three orders of magnitude. J Biol Eng. 2025;19(1):5. https://doi.org/10.1186/s13036-024-00475-8