biopreparatБИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечениеBiological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment2221-996X2619-1156Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products10.30895/2221-996X-2026-26-2-171-182biopreparat-773Research ArticleТЕМА НОМЕРА: РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕДКИХ (ОРФАННЫХ) ЗАБОЛЕВАНИЙISSUE TOPIC: DEVELOPMENT OF MEDICINAL PRODUCTS FOR THE TREATMENT OF RARE (ORPHAN) DISEASESПолучение клонов-продуцентов фермента кислой альфа-глюкозидазы на основе клеток линии СНО-К1Development of acid alpha-glucosidase-producing clones based on the CHO-K1 cell linehttps://orcid.org/0000-0003-2733-7458ТимоноваС. С.TimonovaS. S.

Тимонова Софья Сергеевна, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Sofia S. Timonova, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

timonova1993@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0003-5762-2193ШубинаС. С.ShubinaS. S.

Шубина Софья Сергеевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Sofia S. Shubina

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0009-0005-0343-8993СнегиреваЮ. С.SnegirevaJ. S.

Снегирева Юлия Сергеевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Julia S. Snegireva

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0009-0000-9131-3464АнисимовР. Л.AnisimovR. L.

Анисимов Роман Львович, канд. биол. наук

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Roman L. Anisimov, Cand. Sci. (Biol.)

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0009-0004-8151-5758НикифороваН. В.NikiforovaN. V.

Никифорова Наталья Владимировна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Natalya V. Nikiforova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0009-0004-7987-3513ТретякД. А.TretyakD. A.

Третяк Данила Алексеевич

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Danila A. Tretyak

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0000-0002-5721-0557КоролеваМ. А.KorolevaM. A.

Королева Мария Александровна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Mariya A. Koroleva

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0000-0001-6029-4563НероноваМ. Ю.NeronovaM. Yu.

Неронова Мария Юрьевна

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Maria Yu. Neronova

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

https://orcid.org/0000-0002-1314-894XХамитовР. А.KhamitovR. A.

Хамитов Равиль Авгатович, д-р мед. наук, проф.

ул. Владимирская, д. 14, пос. Вольгинский, городской округ Покров, Владимирская область, 601125

Ravil A. Khamitov, Dr. Sci. (Med.), Prof.

14 Vladimirskaya St., Volginsky, Pokrov, Vladimir Region 601125

Акционерное общество «ГЕНЕРИУМ»РоссияGENERIUM JSCRussian Federation202604072026262171182Copyright © Тимонова С.С., Шубина С.С., Снегирева Ю.С., Анисимов Р.Л., Никифорова Н.В., Третяк Д.А., Королева М.А., Неронова М.Ю., Хамитов Р.А., 20262026Тимонова С.С., Шубина С.С., Снегирева Ю.С., Анисимов Р.Л., Никифорова Н.В., Третяк Д.А., Королева М.А., Неронова М.Ю., Хамитов Р.А.Timonova S.S., Shubina S.S., Snegireva J.S., Anisimov R.L., Nikiforova N.V., Tretyak D.A., Koroleva M.A., Neronova M.Y., Khamitov R.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.biopreparations.ru/jour/article/view/773ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. Разработка биофармацевтического препарата для ферментной заместительной терапии на основе рекомбинантной кислой α-1,4-глюкозидазы (α-глюкозидаза) является актуальной задачей, решение которой может позволить обеспечить пациентов с болезнью Помпе необходимым количеством препарата в Российской Федерации. В работе показан эффективный способ получения стабильного промышленного клона-­продуцента на основе клеток линии СНО-К1, продуцирующего активную α-глюкозидазу.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Получение моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантной кислой α-глюкозидазы и оценка стабильности ростовых показателей и продуктивности в ходе культивирования в течение 60 генераций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Суспензионную клеточную линию СНО-К1 (ECACC) культивировали в среде BalanCD Growth A. Трансфекцию клеток проводили электропорацией на систе­ме MaxCyte (по протоколу СНО). Селекцию продуцентов проводили с использованием пуромицина (5 мкг/мл). Клонирование осуществляли с помощью системы дозирования клеток на основе микрофлюидной технологии (C.SIGHT). Моноклональность клеточных линий подтверждали с применением автоматизированной системы визуализации клеток (Cell Metric CLD). Концентрацию α-глюкозидазы в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа. Активность фермента измеряли колориметрически с субстратом 4-нитрофенил-α-D-глюкопиранозид (pNP-α-D-Glc).

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен скрининг 1000 продуцентов, в результате которого отобраны 22 клеточные линии с продуктивностью 0,14–0,65 г/л. Лидерный продуцент α-глюкозидазы GAA-14 клонировали с последующим подтверждением моноклональности. Получена панель из 20 моноклональных линий. Удельная активность фермента и содержание остатков маннозо-6-фосфата (М6Р) (4,3±0,9 ЕД/мг; 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка соответственно) не отличались от референтного препарата. При изучении стабильности лидерного клона в течение 60 генераций показано сохранение ростовых характеристик: жизнеспособность 98,5±1,5%, время удвоения популяции 20,0±1,3 ч, продуктивность 450±20 мг/л при периодическом культивировании в течение 7 сут.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Получена стабильная моноклональная клеточная линия-продуцента α-глюкозидазы на основе СНО-К1, обеспечивающая продукцию активного фермента 0,45 г/л на 7 сут. Полученный клон-продуцент пригоден для масштабирования и наработки субстанции для доклинических исследований.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. The development of a biopharmaceutical drug for enzyme replacement therapy based on recombinant acid α-1,4-glucosidase (α-glucosidase) is a pressing task, the solution of which could provide patients with Pompe disease in the Russian Federation with the necessary amount of the drug. This study demonstrates an effective method for developing, from the CHO-K1 cell line, a stable industrial producer clone that produces active α-glucosidase.

AIM

AIM. This study aimed to develop monoclonal cell lines producing recombinant acid α-glucosidase and to evaluate the stability of growth characteristics and productivity during cultivation over 60 generations.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. The suspension CHO-K1 cell line (ECACC) was cultured in BalanCD Growth A medium. Cell transfection was performed by electroporation using the MaxCyte system (according to the CHO protocol). Selection of producers was carried out using puromycin (5 μg/mL). Cloning was performed using a cell dispensing system based on microfluidic technology (C.SIGHT). The monoclonality of the cell lines was confirmed using an automated cell imaging system (Cell Metric CLD). The concentration of α-glucosidase in the culture fluid was determined by enzyme-linked immunosor­bent assay. Enzyme activity was measured by a colorimetric method using the substrate 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNP-α-D-Glc).

RESULTS

RESULTS. Screening of 1000 producers was performed, resulting in the selection of 22 cell lines with a productivity of 0.14–0.65 g/L. The lead α-glucosidase producer GAA-14 was cloned, followed by confirmation of monoclonality. A panel of 20 monoclonal lines was obtained. The specific activity of the enzyme and the mannose-6-phosphate residue (М6Р) content did not differ from those of the reference drug (4.3±0.9 U/mg and 0.99±0.10 mol M6P/mol protein, respectively). When studying the stability of the lead clone over 60 generations, preservation of growth characteristics (viability, 98.5±1.5%; population doubling time, 20.0±1.3 h; and productivity, 450±20 mg/L) was demonstrated under batch cultivation over 7 days.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. A stable monoclonal α-glucosidase producer cell line based on CHO-K1 cells has been developed, yielding the active enzyme at 0.45 g/L on day 7. The resulting producer clone is suitable for scale-up and manufacture of the drug substance for preclini­cal studies.

клеточная линия СНО-К1моноклональная клеточная линиякислая α-глюкозидазализосомальная кислая α-14-глюкозидаза4-нитрофенил-α-D-глюкопиранозидGAAболезнь Помпегликогеноз II типарекомбинантные ферментыCHO-K1 cell linemonoclonal cell lineacid alpha-glucosidaselysosomal acid alpha-14-glucosidase4-nitrophenyl-α-D-glucopyranosideglycogen storage disease type IIGSD IIrecombinant enzymesРабота проводилась при финансировании АО «ГЕНЕРИУМ»The study was funded by GENERIUM JSCReferencesHerzog A, Hartung R, Reuser AJ, et al. A cross-sectional single-centre study on the spectrum of Pompe disease, German patients: molecular analysis of the GAA gene, manifestation and genotype-phenotype correlations. Orphanet J Rare Dis. 2012;7:35. https://doi.org/10.1186/1750-1172-7-35Список литературыWan L, Lee CC, Hsu CM, et al. Identification of eight novel mutations of the acid alpha-glucosidase gene causing the infantile or juvenile form of glycogen storage disease type II. J Neurol. 2008;255(6):831–8. https://doi.org/10.1007/s00415-008-0714-0Gümüş E, Özen H. Glycogen storage diseases: An update. World J Gastroenterol. 2023 Jul 7;29(25):3932-3963. doi: 10.3748/wjg.v29.i25.3932. PMID: 37476587; PMCID: PMC10354582..Taverna S, Cammarata G, Colomba P, et al. Pompe disease: Pathoge­nesis, molecular genetics and diagnosis. Aging (Albany NY). 2020;12(15):15856–74. https://doi.org/10.18632/aging.103794Герберт М., Голдштейн Дж. Л., Редер К. и др. Дефицит фосфорилазы-киназы. 31 мая 2011 г. [Обновлено 1 ноября 2018 г.]. В: Адам М. П., Бик С., Мирзаа Г. М. и др., редакторы. GeneReviews® [Интернет]. Сиэтл (штат Вашингтон): Университет Вашингтона, Сиэтл; 199.Risi B, Caria F, Bertella E, et al. Management of Pompe disease alongside and beyond ERT: A narrative review. Acta Myol. 2025;44(1):11–22. https://doi.org/10.36185/2532-1900-1106Nana M, Anastasopoulou C, Parikh NS, et al. Glycogen Storage Disease Type I. [Updated 2025 Apr 6]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan-. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK534196/.Chien YH, Chen HA, Hsu RH, et al. Efficacy of transitioning from alglucosidase alfa to avalglucosidase alfa in infantile-onset Pompe disease: A single-center cohort analysis. Genet Med. 2025;27(5):101373. https://doi.org/10.1016/j.gim.2025.101373Morales A, Siqueira Tavares De Melo MH, Anastasopoulou C, et al. Glycogen Storage Disease Type II. [Updated 2025 Jan 28]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan-. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books.Kishnani PS, Díaz-Manera J, Illarioshkin S, et al. Efficacy and safety of avalglucosidase alfa in patients with late-onset Pompe disease after 145 weeks of treatment during the COMET trial. J Neurol. 2025;272(9):581. https://doi.org/10.1007/s00415-025-13266-ySchreuder AB, Rossi A, Grünert SC, et al. Glycogen Storage Disease Type III. 2010 Mar 9 [Updated 2022 Jan 6]. In: Adam MP, Bick S, Mirzaa GM, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2026. Available f.Le Bras A, De Lonlay P, Attarian S, et al. Medical expenses and care pathways of patients with Pompe receiving myozyme: an observational study based on the French national healthcare database. Orphanet J Rare Dis. 2025;20(1):554. https://doi.org/10.1186/s13023-025-03866-2Szymańska E, Szymańska S, Truszkowska G, Ciara E, Pronicki M, Shin YS, Podskarbi T, Kępka A, Śpiewak M, Płoski R, Bilińska ZT, Rokicki D. Variable clinical presentation of glycogen storage disease type IV: from severe hepatosplenomegaly to cardiac insuffi.Jung JW, Huy NX, Kim HB, et al. Production of recombinant human acid α-glucosidase with high-mannose glycans in GnT1 rice for the treatment of Pompe disease. J Biotechnol. 2017;249:42–50. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.03.033Llavero F, Arrazola Sastre A, Luque Montoro M, Gálvez P, Lacerda HM, Parada LA, Zugaza JL. McArdle Disease: New Insights into Its Underlying Molecular Mechanisms. Int J Mol Sci. 2019 Nov 25;20(23):5919. doi: 10.3390/ijms20235919. PMID: 31775340; PMCID: PM.Jung JW, Kim NS, Jang SH, et al. Production and characteri­zation of recombinant human acid α-glucosidase in transgenic rice cell suspension culture. J Biotechnol. 2016;226: 44–53. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.03.031Labrador E, Weinstein DA. Glycogen Storage Disease Type VI. 2009 Apr 23 [Updated 2019 Nov 27]. In: Adam MP, Bick S, Mirzaa GM, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2026. Available from: https://ww.Sariyatun R, Florence, Kajiura H, et al. Production of human acid-alpha glucosidase with a paucimannose structure by glycoengineered arabidopsis cell culture. Front Plant Sci. 2021;12:703020. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.703020Glycogen storage disorder types IX: the mutation spectrum and ethnic distribution.Bohnsack RN, Misra SK, Liu J, et al. Lysosomal enzyme binding to the cation-independent mannose 6-phosphate receptor is regulated allosterically by insulin-like growth factor 2. Sci Rep. 2024;14(1):26875. https://doi.org/10.1038/s41598-024-75300-9Sperry E, Leslie N, Berry L, Pena L. Pompe Disease. 2007 Aug 31 [updated 2025 Aug 21]. In: Adam MP, Bick S, Mirzaa GM, Pagon RA, Wallace SE, Amemiya A, editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993–2026. PMID: 203.Liu L, Lee WS, Doray B, Kornfeld S. Engineering of GlcNAc-1-phosphotransferase for production of highly phosphorylated lysosomal enzymes for enzyme replacement therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017;5:59–65. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2017.03.006A cross-sectional single-centre study on the spectrum of Pompe disease, German patients: molecular analysis of the GAA gene, manifestation and genotype-phenotype correlations.Caval T, Zhu J, Tian W, et al. Targeted analysis of lysosomal directed proteins and their sites of mannose-6-phosphate modification. Mol Cell Proteomics. 2019;18(1):16–27. https://doi.org/10.1074/mcp.RA118.000967Identification of eight novel mutations of the acid α-glucosidase gene causing the infantile or juvenile form of glycogen storage disease type II.Zhang X, Liu H, Meena N, et al. Chemoenzymatic glycan-selective remodelling of a therapeutic lysosomal enzyme with high-affinity M6P-glycan ligands. Enzyme substrate specificity is the name of the game. Chem Sci. 2021;12(37):12451–62. https://doi.org/10.1039/d1sc03188kTaverna S, Cammarata G, Colomba P, Sciarrino S, Zizzo C, Francofonte D, Zora M, Scalia S, Brando C, Curto AL, Marsana EM, Olivieri R, Vitale S, Duro G. Pompe disease: pathogenesis, molecular genetics and diagnosis. Aging (Albany NY). 2020 Aug 3;12(15):158.Steger K, Brady J, Wang W, et al. CHO-S antibody titers >1 gram/liter using flow electroporation-mediated transient gene expression followed by rapid migration to high-yield stable cell lines. J Biomol Screen. 2015;20(4):545–51. https://doi.org/10.1177/1087057114563494Risi B, Caria F, Bertella E, Giovanelli G, Gatti S, Poli L, Gazzina S, Leggio U, Bozzoni V, Volonghi I, Allali NA, Ottelli E, Ferrari E, Marrello A, Ricci G, Siciliano G, Padovani A, Filosto M. Management of Pompe disease alongside and beyond ERT: a narra.Anumula KR. Quantitative determination of monosaccharides in glycoproteins by high-performance liquid chromatography with highly sensitive fluorescence detection. Anal Biochem. 1994;220(2):275–83. https://doi.org/10.1006/abio.1994.1338Chien YH, Chen HA, Hsu RH, Yeh CH, Fang CY, Lee NC, Hwu WL, Chien YH. Efficacy of transitioning from alglucosidase alfa to avalglucosidase alfa in infantile-onset Pompe disease: A single-center cohort analysis. Genet Med. 2025 May;27(5):101373. doi: 10.10.Trivedi PC, Bartlett JJ, Pulinilkunnil T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 2020;9(5):1131. https://doi.org/10.3390/cells9051131Colburn R, Lapidus D. An analysis of Pompe newborn screening data: a new prevalence at birth, insight and discussion. Front Pediatr. 2024 Jan 8;11:1221140. doi: 10.3389/fped.2023.1221140. PMID: 38274468; PMCID: PMC10810242..Feng X, Liu S, Xu H. Not just protons: Chloride also activates lyso­somal acidic hydrolases. J Cell Biol. 2023;222(6):e202305007.K. Steger, J. Brady, W. Wang, M. Duskin, K. Donato и M. Peshwa, CHO-S antibody titers >1 gram/liter using flow electroporation-mediated transient gene expression followed by rapid migration to high-yield stable cell lines, J Biomol Screen. Apr;20(4):545-51. doi: 10.1177/1087057114563494.Neuss A, Steimann T, Tomas Borges JS, et al. Scale-up of CHO cell cultures: From 96-well-microtiter plates to stirred tank reactors across three orders of magnitude. J Biol Eng. 2025;19(1):5. https://doi.org/10.1186/s13036-024-00475-8J. S. Lee, H. F. Kildegaard, N. E. Lewis и G. M. Lee, «Mitigating Clonal Variation in Recombinant Mammalian Cell Lines,» Trends Biotechnol. 2019 Sep;37(9):931-942. doi: 10.1016/j.tibtech.2019.02.007.R. Flaherty, «Mammalian cell culture for production of recombinant proteins: A review of the critical steps in their biomanufacturing,» Biotechnology Advances, 2020.R. Flaherty, «Mammalian cell culture for production of recombinant proteins: A review of the critical steps in their biomanufacturing,» Biotechnology Advances, 2020.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.