Гликогенозы — группа орфанных заболеваний, при которых нарушается синтез или распад гликогена из-за дефицита ферментов. Болезнь Помпе (гликогеноз II типа) — редкая наследственная мультисистемная лизосомная болезнь накопления, связанная с дефицитом лизосомальной кислой α‑1,4-глюкозидазы (α‑глюкозидаза). Заболевания вызывают мутации в гене GAA, кодирующем α‑глюкозидазу. Обнаружено более 500 мутаций в гене GAA, которые могут приводить к нарушению синтеза α‑глюкозидазы [1–3].

Для замедления прогрессирования болезни Помпе применяют пожизненную ферментную заместительную терапию (ФЗТ) [4] препаратами рекомбинантной человеческой кислой α‑глюкозидазы: алглюкозидаза альфа (Myozyme, Sanofi Genzyme) и авалглюкозидаза альфа (Nexviazyme, Sanofi Genzyme) [5].

Разработка клеточных линий, продуцирующих активные лизосомальные ферменты, представляет собой высокотехнологичную задачу в области клеточной инженерии. Это связано с уникальными требованиями к посттрансляционной модификации, компартментализации, внутриклеточному транспорту, активности ферментов, их pH-зависимому протеолитическому процессингу и выбору системы экспрессии. Выбор системы экспрессии критичен для производства рекомбинантных лизосомальных гидролаз, поскольку необходимо обеспечить паттерн гликозилирования, соответствующий нативному человеческому белку. Клеточные линии млекопитающих, в частности CHO-K1, широко используются в биофармацевтике для получения различных белков, включая ферменты. Это обусловлено их ферментативным аппаратом, который обеспечивает посттрансляционную модификацию и присоединение метки — остатка маннозо‑6‑фосфата (M6P) к олигосахаридам белка [6][7]. Получение активной α‑глюкозидазы показано с использованием растительных клеточных линий: клеток риса (титр до 45 мг/л, удельная активность 3,092 Ед/мг [8]); трансгенных клеток риса (выход α‑глюкозидазы — 37 мг/л [9]); клеток линии Arabidopsis alg3, дефицитной по α‑1,3-маннозилтрансферазе (максимальный выход α‑глюкозидазы — 228±21,1 мкг/л [10]). Несмотря на применение гликоинженерных растительных систем экспрессии, их продуктивность остается низкой (менее 50 мг/л), тогда как CHO-клетки обеспечивают промышленно значимые титры.

Лизосомальные ферменты имеют уникальный паттерн посттрансляционного гликозилирования. Критически важные остатки M6P на терминальных участках N-связанных гликанов обеспечивают специфическое узнавание лизосомального фермента рецепторами и его последующий транспорт в лизосомы. Именно терминальные M6P-остатки фермента обусловливают рецепторно-опосредованный эндоцитоз препарата и его биологическую функцию в лизосоме [11]. Для повышения содержания M6P применяют различные стратегии, такие как: котрансфекция генов-модуляторов (например, коэкспрессия фосфотрансферазы GlcNAc-1-PT [12]); нокаут генов кислых фосфатаз Acp2 и Acp5; химическая конъюгация очищенного фермента с биc-маннозо‑6‑фосфатом [13]; сайт-селективное ферментативное M6P-гликановое ремоделирование с использованием эндогликозидаз Endo-A/Endo-F3 и синтетического оксазолинтетрасахарида M6P [14].

При получении линий-продуцентов лизосомальных ферментов важно учитывать вышеперечисленные аспекты, а также особенности строения и функции получаемого фермента для оптимизации стратегии отбора. Многие исследования сосредоточены на максимизации титра. Однако недостаточное внимание к удельной активности и генетической стабильности клеточной линии в долгосрочной перспективе ведет к нарушению посттрансляционных модификаций и, как следствие, к снижению терапевтической эффективности конечного препарата.

Предлагаемый авторами подход включает многофакторный контроль критических параметров на каждом этапе отбора клеточных линий: выявление клеточных линий с высоким титром целевого фермента и оценку их удельной активности фермента во время скринингов. Лидерные моноклональные линии изучают в ходе длительного пассирования (60 генераций) для оценки стабильности ростовых и продукционных характеристик, а также комплексного анализа профиля гликозилирования и физико-химических свойств рекомбинантного фермента α‑глюкозидазы. Преимущество данной стратегии заключается в возможности получить не только высокопродуктивную, но и стабильную моноклональную линию, синтезирующую фармакологически активный продукт с предсказуемыми параметрами.

Цель работы — получение моноклональных клеточных линий-продуцентов рекомбинантной кислой α‑глюкозидазы и оценка стабильности ростовых показателей и продуктивности в ходе культивирования в течение 60 генераций.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: трансфекция клеток линии СНО-К1 плазмидой, кодирующей ген GAA; отбор продуцентов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и оценки активности α‑глюкозидазы с использованием хромогенного субстрата pNP-α‑D-Glc; получение моноклональных линий-продуцентов; изучение стабильности ростовых и продукционных характеристик лидерного клона в течение 60 генераций.

Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность гена GAA для экспрессии в клетках CHO-К1, фланкированная специфическими сайтами рестрикции, была клонирована в составе экспрессионного вектора, содержащего ген пуромицин-N-ацетилтрансферазы (селективный маркер). Экспрессия гена GAA находилась под транскрипционным контролем конститутивного химерного промотора CMVe/EF1α (рис. 1).

Клеточную линию СНО-К1 культивировали в питательной среде BalanCD Growth A (FujiFilm, США), не содержащей компонентов животного происхождения, в CO2-инкубаторе Climo-Shaker ISF1-XC (Kuhner, Германия) в спин-тьюбах TubeSpin (конические биореакторы) (TPP Techno Plastic Products AG, Швейцария) при 37 °С, 5% CO2, влажности >75%, перемешивании со скоростью 200 об/мин (рабочий объем 10–20 мл).

Клеточную плотность и жизнеспособность клеток оценивали окрашиванием трипановым синим (0,4%; NeoFroxx GmbH, Германия) с использованием автоматизированной системы подсчета клеток Countess II FL Automated Cell Counter (Thermo Fisher Scientific, США) и одноразовых слайдов (объем образца 10 мкл).

Клетки СНО-К1 засевали в концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл за 24 ч до трансфекции (экспоненциальная фаза роста). Отбирали 200 млн клеток, осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин), дважды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления компонентов среды, ресуспендировали клеточный осадок в 1 мл буфера для электропорации (MaxCyte, США) до достижения концентрации 2,0×10⁸ клеток/мл. Плазмиду, кодирующую ген GAA, смешивали с клетками СНО-К1 в объеме 100 мкл и вносили в кювету ОС-100 (MaxCyte, США) для проведения трансфекции на системе MaxCyte STX (MaxCyte, США) по протоколу «CHO» (программа производителя) [15].

Пул трансфицированных клеток засевали в 96-луночные плоскодонные планшеты (200 мкл/лунку) в среде BalanCD Growth A в присутствии селективного агента — пуромицина (5 мг/л). Инкубацию проводили в стационарном режиме до формирования устойчивых продуцентов в течение 14 сут (частичная смена селективной среды каждые 5–6 сут) в CO2-инкубаторе (Sanyo, Япония) при 37 °С, 5% CO2, влажности >75%.

Клеточную линию, продуцирующую фермент α‑глюкозидазу, клонировали с применением системы дозирования единичных клеток C.SIGHT (CYTENA, Германия) в 96-луночные плоскодонные планшеты с использованием среды BalanCD Growth A и культивировали в стационарных условиях в течение 14 сут при 37 °С, 5% CO2, влажности >75%. Моноклональность клеточных линий подтверждали с помощью автоматизированной системы визуализации (фотодокументации) клеток Cell Metric CLD (Solentim, Великобритания) путем сканирования всей площади лунки в день 0 (единичная клетка) и в последующие дни роста (мониторинг формирования колонии).

Клетки в экспоненциальной фазе роста (жизнеспособность >95%) осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин), удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в криопротекторной смеси (ростовая среда с 10% диметилсульфоксидом) до концентрации 1,0×10⁷ клеток/ампула, разливали в стерильные криопробирки, медленно охлаждали (1 °С/мин) в контейнере Mr. Frosty (Thermo Fisher Scientific, США) до минус 80 °С в течение 24 ч, затем переносили в пары жидкого азота CryoExtra 20 (Thermo Scientific, США) для длительного хранения.

Специфическую сорбцию проводили на планшетах Maxi-sorb (Nunc, Дания) с использованием поликлональных кроличьих антител к hGAA (5 мг/л; АО «ГЕНЕРИУМ», Россия) в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в течение 16 ч при 4 °С. Для построения калибровочной кривой применяли коммерческий стандарт рекомбинантного фермента Recombinant human lysosomal alpha-glucosidase (Cusabio, КНР). Для детекции антигена использовали конъюгат крысиных анти-hGAA антител с пероксидазой хрена (АО «ГЕНЕРИУМ», Россия). Оптическую плотность измеряли при λ=450 нм на фотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США) после остановки реакции 1 М серной кислотой.

Клетки культивировали в колбах Эрленмейера (125 мл, Сorning, США) в рабочем объеме 20 мл среды BalanCD Growth A с добавлением подкормки BalanCD CHO Feed 4 (IrvineScientific, США; 4% от объема культуры) в течение 7 сут в шейкере-инкубаторе Infors HT Multitron (INFORS HT, Швейцария) при 37 °С, 5% CO2, влажности >75%, при перемешивании 150 об/мин. Посевная концентрация клеток составляла 0,3×10⁶ клеток/мл.

Хроматографическую очистку α‑глюкозидазы проводили с использованием препаративной системы AKTA Pure 25 (Cytiva, США). Для аффинного связывания целевого белка из культуральной жидкости (КЖ) использовали металл-хелатный сорбент IMAC 6FF (Cytiva, США), предварительно насыщенный ионами Cu²⁺. В ходе пробоподготовки в КЖ, содержащую целевой фермент, вносили раствор сульфата меди до конечной концентрации 1 мМ, доводили рН до 6,5 (0,3 M HCl или 0,5 M, NaOH), затем наносили КЖ на аффинный сорбент. После сорбции целевого фермента сорбент последовательно промывали фосфатными буферами с последовательным снижением ионной силы и рН: 25 мМ Na2HPO4, 175 мМ NaCl, pH 6,5 и 25 мМ Na2HPO4, 40 мМ NaCl, pH 6,0. Десорбцию α‑глюкозидазы проводили промывкой сорбента буферным раствором (25 мМ Na2HPO4, 10 мМ имидазола, pH 6,0) для мягкой элюции и сохранения активности фермента. Содержание белка в элюате определяли спектрофотометрически (λ=280 нм); расчет проводили с использованием коэффициента экстинкции ε=1,51 мл/(мг×см).

Активность α‑глюкозидазы определяли колориметрически с использованием субстрата — 4‑нитрофенил-α‑D-глюкопиранозида (pNP-α‑D-Glc). Реакционную смесь (0,2–2,5 мкг/мл фермента, 35 мМ субстрата в ацетатном буфере, рН 4,3), инкубировали в течение 20 мин при 37 °С. Реакцию останавливали 0,3 М глициновым буфером, рН 10,6. Концентрацию высвободившегося 4‑нитрофенола (pNP) измеряли при λ=405 нм на планшетном ридере Synergy HTX (BioTek, США) по калибровочной кривой pNP. За единицу активности (1 U) принимали количество фермента, катализирующее превращение 1 мкмоль субстрата в минуту при 37 °С. Ферментативную активность (A, в ЕД/мл) рассчитывали по формуле (1):

(1)

где ОПобр — оптическая плотность разведения испытуемого образца; ОПсо — оптическая плотность разведения стандарта 4‑нитрофенола; ОПбланк — оптическая плотность раствора сравнения; C — концентрация 4‑нитрофенола в разведении стандарта, мкмоль/мл; Dil — коэффициент разведения испытуемого образца; t — время ферментативной реакции, мин.

Количественное определение остатков М6Р в α‑глюкозидазе проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ после селективного кислотного гидролиза олигосахаридов до свободных моносахаридов и последующей дериватизации флуоресцентной меткой [16]. Испытуемый раствор (250 мкл) — 125 мкг белка в 50% (об./об.) трифторуксусной кислоте (Merck, Германия). Гидролиз проводили при температуре 100 °C в течение 1,5 ч. Калибровочные растворы М6Р (Sigma-Aldrich, США) — от 0 до 2,5 нмоль в 75 мкл воды. В каждую пробу вносили 25 мкл (1,5 нмоль) внутреннего стандарта ксилозы (Ludger, Великобритания) и упаривали досуха в вакуумном концентраторе CentriVap (Labconco, США). Дериватизацию проводили добавлением 30 мкл раствора, содержащего 0,3 М цианоборогидрида натрия (Ludger, Великобритания), 0,1 М антраниловой кислоты (Ludger, Великобри-тания) в натрий-ацетатном буферном растворе (Ludger, Великобритания) с инкубацией при температуре 80 °C в течение 45 мин. После охлаждения добавляли 700 мкл подвижной фазы А (ПФ А).

Хроматографическое разделение выполняли на колонке Symmetry C18 (3,9×150 мм, размер частиц 5 мкм; Waters, США), термостатированной при 30 ºС. Подвижные фазы (ПФ): ПФ А — 0,2% бутиламин (Sigma-Aldrich, США), 0,5% ортофосфорная кислота (PanReac AppliChem, Испания), 1% тетрагидрофуран (J.T. Baker, США) в воде; ПФ В — ацетонитрил (Merck, Германия). Скорость потока 0,5 мл/мин. Градиентный режим: 0–7 мин — 2,5% ПФ В (изократически); 7–25 мин — линейный градиент от 2,5 до 9% ПФ В; 25–40 мин — линейный градиент от 9 до 10% ПФ В; промывка 60% ПФ В и повторное уравновешивание в начальных условиях. Объем инжекции — 10 мкл. Детектирование флуоресценции — при длинах волн возбуждения 360 нм и эмиссии 425 нм. Использовали хроматографическую систему Alliance e2695, оснащенную детектором флуоресценции FLR 2475 (Waters, США).

Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Empower 3 (Waters) и MS Excel 2010 (Microsoft, США). По калибровочным растворам строили график зависимости отношения площади пика М6Р к площади пика ксилозы от содержания М6Р. Для испытуемых образцов рассчитывали количество остатков М6Р на одну молекулу белка.

Статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США)1. Достоверность межгрупповых различий оценивали с применением непараметрического U-критерия Манна — Уитни или t-критерия Стьюдента. Результаты представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения. Уровень статистической значимости: **** — p<0,0001, *** — p<0,001, ** — p<0,01, * — p<0,05, ns — статистически незначимы.

Для получения продуцентов α‑глюкозидазы клетки линии СНО-К1 трансфицировали электропорацией, после чего проводили селекцию. При скрининге в 96-луночных планшетах по содержанию целевого белка в КЖ проанализировано 1000 кандидатов (рис. 2А). Доля клеточных линий, прошедших селекцию, составила около 20%, максимальная продуктивность — до 40 мг/л. Лидерные кандидаты были переведены в больший объем среды, где подтверждено наличие целевого фермента в КЖ. Максимальный выход белка на этом этапе составил до 30 мг/л (рис. 2В).

Лидерные продуценты переводили в спин-тьюбы для восстановления жизнеспособности и последующей криоконсервации. Далее осуществляли отбор продуцентов по ростовым показателям и продуктивности (рис. 3). В течение 7 сут проводили периодическое культивирование 22 продуцентов α‑глюкозидазы, в ходе которого оценивали жизнеспособность клеточных линий (рис. S1А, опубликован в Приложении 1 на сайте журнала2), концентрацию жизнеспособных клеток (рис. S1В, Приложение 1), продуктивность (рис. 3А), удельную продуктивность (рис. S1С, Приложение 1) и активность фермента (рис. 3В). Жизнеспособность клеточных линий начала снижаться на 7 сут, после чего культивирование было остановлено. Максимальную концентрацию жизнеспособных клеток наблюдали на 6 сут: биомасса продуцентов GAA‑21 и GAA‑8 достигала пиковой плотности более 25×10⁶ клеток/мл (рис. S1В, Приложение 1). Максимальную волюметрическую продуктивность (>0,6 г/л) выявили у продуцентов GAA‑7, GAA‑14 и GAA‑4 (рис. 3А). Максимальную удельную продуктивность (>15 пг/клетка/сут) наблюдали у GAA‑3, GAA‑5, GAA‑1, GAA‑2 (рис. S1С, Приложение 1). Максимальную активность целевого фермента в КЖ (>30 ЕД/мл) выявили у GAA‑7, GAA‑14 и GAA‑4 (рис. 3В). Таким образом, для клонирования выбран продуцент GAA‑14, обладающий как высокой способностью к экспрессии целевого гена, так и максимальной удельной активностью синтезируемого фермента.

Процедуру клонирования проводили в соответствии с принципами обеспечения моноклональности клеточных линий (FDA Q5D3), поскольку при производстве биофармацевтических продуктов использование моноклональной клеточной линии является ключевым фактором, гарантирующим постоянство, предсказуемое качество синтезируемых рекомбинантных белков и стабильность клеточных линий.

Лидерный продуцент GAA‑14 клонировали с помощью системы дозирования клеток C.SIGHT. Пример отбора единичной клетки представлен на рисунке S2А (Приложение 1). Всего получено 880 клонов в десяти 96-луночных планшетах. Моноклональность подтверждали с помощью системы Cell Metric. Время деления клеток СНО-К1 составляет примерно 18–22 ч, поэтому фотодокументацию (Cell Metric CLD) проводили так, чтобы в день посева (клонирования) детектировать единичную клетку, через 24 ч — две клетки, на 2 сут роста — четыре клетки. Визуализацию роста моноклонов выполняли в течение 12 сут (рис. S2В, Приложение 1).

Далее проведена серия скринингов на наличие целевого фермента и его активности для полученных клонов (аналогично процедуре, представленной на рис. 2). Получено 20 подтвержденных моноклональных клеточных линий, продуцирующих α‑глюкозидазу. Удельная активность фермента в панели клонов не отличалась от референтного препарата и составила 4,3±0,9 ЕД/мг (рис. 4А). Количественное определение остатков М6Р на молекулу целевого фермента для ряда лидерных клонов показало среднее значение 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка, что сопоставимо с референтным препаратом (рис. 4В).

Оценивали стабильность восьми лидерных моноклональных клеточных линий α‑глюкозидазы в течение 60 генераций. На рисунке 5 представлены характеристики лидерного промышленного клона-продуцента. Пересевы проводили в течение 2 мес. через каждые 3–4 сут с подсчетом концентрации жизнеспособных клеток, определением жизнеспособности и отбором проб для анализа продуктивности фермента. Характеристики культуры в течение 60 генераций оставались стабильными: жизнеспособность — 98,5±1,5% (рис. 5D), концентрация жизнеспособных клеток на 3 и 4 сут пересева — (3,8±0,6)×10⁶ и (8,3±1,8)×10⁶ клеток/мл соответственно (рис. 5E). Время удвоения популяции составляло 20,0±1,3 ч (рис. 5F).

После длительного пассирования клонов-продуцентов (60 генераций) проводили периодическое культивирование одного и того же клона на ранних (5–10 генераций) и поздних (>60 генераций) пассажах в течение 7 сут. На последние сутки клеточная плотность достигла максимума — (23,3±1,2)×10⁶ клеток/мл (рис. 5А). Жизнеспособность клона во время периодического культивирования была стабильно высокой и варьировалась от 94 до 99% (рис. 5В). Продуктивность составила 450±20 мг/л целевого белка (рис. 5С). Полученная моноклональная линия α‑глюкозидазы охарактеризована как стабильная по совокупности критических параметров качества (critical quality attributes, CQAs) для технологических промышленных процессов.

В настоящей работе получена панель продуцентов кислой α‑глюкозидазы на основе клеток линии CHO-К1, продуцирующих активный фермент с титром до 0,65 г/л.

Лизосомальные ферменты, в частности гидролазы, включая α‑глюкозидазу, в процессе биосинтеза проявляют каталитическую активность при низких рН (4,5–5,0) и синтезируются как неактивные формы (проферменты) [17][18]. При разработке клеточных линий-продуцентов мы проводили отбор не только по титру белка (ИФА), но и по активности фермента (рис. 3, 6). Этот подход критически важен для лизосомальных гидролаз, поскольку высокопродуктивные клоны могут продуцировать белок с нарушенной конформацией и низкой активностью. Из 1000 исходных продуцентов после последовательных этапов скрининга (в 96- и 6-луночных планшетах) отобрано 22 продуцента, протестированных в условиях периодического культивирования. Титр фермента варьировал от 140 до 650 мг/л. Выход целевого фермента продуцентов на основе СНО-К1 более чем на порядок превышал выход α‑глюкозидазы в растительных клетках: в 14–18 раз выше по сравнению с клетками риса [8][9] и более чем в 2000 раз выше по сравнению с культурой клеток Arabidopsis alg3 [10]. На основе комплексной оценки физико-химических свойств, гликопрофиля и ростовых параметров был выбран продуцент GAA‑14 для клонирования с использованием систем C.SIGHT и Cell Metric.

В процессе создания клеточных линий для производства рекомбинантных терапевтических лизосомальных ферментов удельная активность является одним из главных критериев качества, отражая его функциональность. Удельная активность фермента у итоговой панели лидерных клонов-продуцентов α‑глюкозидазы (4,3±0,9 ЕД/мг) соответствует референтному препарату (4,2±0,2 ЕД/мг) (рис. 4А).

Особое значение имеет профиль гликозилирования фермента — критический параметр качества (CQA), определяющий рецептор-опосредованную интернализацию, конформационную стабильность, фармакокинетический профиль (включая период полувыведения) и низкую иммуногенность препарата. Уровень М6P полученных белков составил 0,99±0,10 моль М6Р/моль белка, что сопоставимо с референтным препаратом (0,96±0,06 моль М6Р/моль белка) (рис. 4В).

Важнейшим этапом разработки промышленного продуцента является подтверждение его фенотипической стабильности. Для получения качественного продукта в производственных условиях клеточная линия должна стабильно продуцировать фермент длительное время. В ходе исследования изучена стабильность полученных клонов-продуцентов α-глюкозидазы при длительном пассировании (60 генераций) с мониторингом клеточного роста, жизнеспособности и продуктивности. В отличие от большинства работ, сосредоточенных на отдельных задачах (повышение активности, продуктивности, оптимизация гликопрофиля и др.), в настоящей работе предложен комплексный подход, включающий не только стандартные этапы, но и комплексное изучение стабильности клеточных линий-продуцентов в процессе длительного культивирования в течение 60 генераций (рис. 6). Такой подход является преимуществом нашей работы и гарантирует предсказуемость свойств целевого фермента в промышленном масштабе.

К ограничениям работы можно отнести то, что представленные результаты по экспрессии целевого гена и стабильности клона GAA‑14 получены в условиях лабораторного культивирования, что налагает определенные ограничения на экстраполяцию данных. В частности, для перехода в промышленные биореакторы необходимо учитывать гидродинамический профиль, коэффициент массопередачи кислорода и другие особенности [19].

Несмотря на указанные ограничения, полученные результаты имеют высокую практическую значимость. Представленный подход позволил отобрать стабильный клон-продуцент α‑глюкозидазы с продуктивностью 0,45 г/л, пригодный для масштабирования. Полученный фермент по удельной активности и уровню М6P не уступает референтному препарату и может быть использован для наработки субстанции и доклинических исследований. Дальнейшие работы будут направлены на оптимизацию промышленного масштабирования в биореакторах. Описанная схема разработки клеточной линии (рис. 6) позволит получать различные рекомбинантные белки подобного класса, в частности лизосомальные гидролазы.

Дополнительная информация. На сайте журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение» опубликовано Приложение 1.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-2-171-182-annex

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.С. Тимонова — разработка клеточной линии, анализ результатов, статистическая обработка данных, формирование концепции статьи, написание текста рукописи; С.С. Шубина — оформление иллюстраций и редактирование текста рукописи; Ю.С. Снегирева — анализ данных литературы, редактирование текста рукописи; Р.Л. Анисимов — дизайн экспрессионных векторов; Н.В. Никифорова — получение плазмид; Д.А. Третяк — очистка фермента; М.А. Королева — измерение активности фермента; М.Ю. Неронова — определение маннозо‑6‑фосфатных остатков; Р.А. Хамитов — научная экспертиза, координация работ, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Использование генеративного искусственного интеллекта. Авторы заявляют, что не использовали генеративный ИИ при подготовке рукописи.

Supplementary information. Supplementary material 1 is available on the website of Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-2-171-182-annex

Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. S.S. Timonova developed the cell line, analyzed the results, performed statistical data processing, conceptualized the article, and drafted the manuscript. S.S. Shubina prepared the illustrations and edited the manuscript. J.S. Snegireva analyzed the literature and edited the manuscript. R.L. Anisimov designed the expression vectors. N.V. Nikiforova obtained the plasmids. D.A. Tretyak purified the enzyme. M.A. Koroleva measured the enzyme activity. M.Yu. Neronova determined the mannose‑6‑phosphate residue content. R.A. Khamitov provided scientific expertise, coordinated the work, and approved the final version of the article for publication.

Use of generative artificial intelligence. The authors declare that no generative AI was used during the preparation of this manuscript.

1. https://cdn.graphpad.com/docs/prism/6/Prism-6-User-Guide.pdf2. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2026-26-2-171-182-annex3. Q5D Quality of biotechnological/biological products: Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/biological products; Availability. FDA; 1998.